CN101379196B - 用于鉴定临床样品中的人乳头瘤病毒的体外诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明描述用于检测并且分析样品中的HPV的类型的方法和试剂盒,其为用于所述方法的反应容器。通用HPV引物用来通过PCR扩增样品;然后将扩增的样品与HPV类型-特异性探针的点阵杂交,以确定所述HPV的类型。
Description
发明领域
本发明涉及用于鉴定临床样品中的人乳头瘤病毒(HPV)的体外诊断试剂盒和方法。本发明还涉及用于所述试剂盒和方法的装置。
更具体而言,在本发明的优选实施方案中涉及使用用于基因型分析HPV的探针而特异性检测临床样品中的人乳头瘤病毒基因型的体外诊断试剂盒,组合包括所述探针的核酸点阵和标准实验室反应小瓶的平台,自动处理结果的装置和使用所述体外诊断试剂盒诊断HPV感染的方法。
发明背景
迄今为止,已经描述了约100种人乳头瘤病毒(HPV)类型。当在HPV区域E6、E7和L1的至少10%的基因序列与任何先前已知的类型不同时,认为一种HPV类型为新的类型。亚型或变体与主要类型的不同小于2-5%。这些病毒具有对人上皮细胞的向性,并且已经与严重的人类疾病相联系,特别是与生殖器和口腔粘膜癌症相联系。
已经从肛殖黏膜分离了大约50种HPV类型。取决于它们与宫颈癌的相关性,已经将它们分成低危类型(例如,HPV类型6,11,42,43和44)和高危类型(例如,类型16,18,31,33和45)。由于高危类型HPVs的持续感染是宫颈癌的主要病因因素,所以检测并且鉴定HPV类型非常重要。
HPV基因型的检测和鉴定通过HPV DNA检测进行。这些方法可以通过HPV DNA的直接检测或通过检测扩增的HPV DNA而进行。在HPVDNA的直接检测的方法中有美国马里兰州Gaithersburg Md.,的Digene公司(Digene Corp.)的杂合体捕获(HC)方法和原位杂交技术。HC是FDA核准的技术,其基于信号-扩增杂交方法。使用的杂交探针是HPV特异的RNA序列。在将这些探针与来自临床样品的变性的HPV DNA一起温育后,形成可以使用特异性抗体进行检测的RNA/DNA杂合体。HC方法允许区分高危和低危HPV类型,但是它不能鉴定HPV类型。这种检测方法的其它缺点在于,探针混合物的使用通常导致在来自两种类型的HPV类型之间的交叉反应。
通过扩增病毒基因组而鉴定HPV类型的方法主要通过聚合酶链式反应(PCR)进行。HPV的基因型分析可以通过使用只识别一种特异类型的类型-特异性PCR进行。备选方法是应用通用引物PCR扩增所有HPV类型。乳头瘤病毒通过随后分析所扩增的基因片段的序列而分析类型。这一序列的分析可以使用不同方法,诸如DNA测序、限制性片段长度多态性(RFLP)或核酸杂交而进行。已认为杂交技术,诸如反向印记杂交,最适合用于诊断目的(Kleter等.J Clin Microbiol.(临床微生物学杂志)1999,37:2508-2517;Van den Brule等.J Clin Microbiol(临床微生物学杂志).2002,40:779-787)。
最近,已经开发了微点阵技术(参见,例如,美国专利号5,445,934)。术语微点阵意指许多小点的分析,以促进能够同时分析数千DNA序列的大规模核酸分析。如本领域中已知,反向印记通常在膜上进行,而微点阵通常在固体支持物上进行,并且还可以以更小的规模进行。微点阵技术已经成功地应用于HPV诊断领域(参见,专利公布WO0168915和No.CA2484681)。
然而,使用微点阵技术仍然存在不足,其需要昂贵的设备和费力的操作。这种不便由提供‘点阵-管’的专利申请号US2005064469解决。术语‘点阵-管’描述具有实验室反应容器(例如,1.5ml Eppendorf管)的典型的形状和大小的反应容器,微点阵排列在它的基底上,可以在其中进行基于微点阵的检测。
发明目的
考虑上述,本发明的一个目的是提供用于特异性鉴定可能在临床样品中存在的HPV类型的可靠方法。
更具体地,本发明的一个目的是提供使用‘点阵-管’平台特异性鉴定HPV类型的方法。
提供特异性检测和/或鉴定不同的HPV类型的探针也是本发明的一个目的。
本发明的另一个目的是提供检测和/或诊断HPV类型的试剂盒,其包括试剂、规程和在‘点阵-管’上排列的HPV特异性探针,所述试剂盒允许可靠地特异性检测和/或诊断可能在临床样品中存在的HPV类型。
发明概述
按照本发明的第一方面,提供检测并且分析样品中的人乳头瘤病毒(HPV)的类型的测定,所述测定包括:在样品上进行核酸扩增反应,所述扩增反应意欲以非类型特异性方式扩增HPV目标序列;从任意扩增产物获得单链寡核苷酸;可能的情形中,允许单链寡核苷酸与在固体支持物上提供的多种HPV类型-特异性探针进行杂交,所述支持物位于适合容纳所述样品的反应容器内;并且检测杂交的寡核苷酸。
本发明的方面还提供检测并且分析样品中的人乳头瘤病毒病毒(HPV)的类型的测定,所述测定包括:在样品上进行核酸扩增反应,所述样品与具有固定在其上的多种HPV类型-特异性探针的固体支持物接触,扩增反应意欲以非类型特异性方式扩增HPV目标序列;从任意扩增产物获得单链寡核苷酸;在可能的情形中,允许单链寡核苷酸与HPV类型-特异性探针进行杂交;并且检测杂交的寡核苷酸。
所述扩增反应优选地是PCR。单链寡核苷酸可以通过将存在的任意双链寡核苷酸变性,例如通过加热变性而获得。单链寡核苷酸优选地允许在严格条件下杂交;所述条件是本领域的技术人员所理解的,但是优选地包括将变性的寡核苷酸与靶目标在55℃在含有1×SSC的缓冲液中温育。
在优选的实施方案中,所述样品和固体支持物包含在反应容器内;例如,在US2005064469中所述。
优选地使用对至少5,10,15,20,25,30,35,40,或42种HPV类型特异的探针,所述HPV类型优选地选自HPV类型6,11,16,18,26,30,31,32,33,34/64,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,54,56,57,58,59,61,62,66,67,68,69,70,71,72,73,74,81,82,83,84,85和89。探针便利地在长度上为20-40nt,优选地25-35nt,更优选地28-32nt,并且最优选地约30nt。所有的探针不必是相同长度。探针便利地对HPV的L1区域特异。每种类型特异的探针可以与对另一种HPV类型特异的探针在至少1个,2个,3个或优选地多于3个nt不同。优选的探针选自包括SEQ ID NO 1-SEQ ID NO133的组;这些探针中的一些检测如下文所述相同的HPV类型。优选地,多种探针对同一种HPV类型特异,并且更优选地使用至少两种对待检测的每种HPV类型特异的探针。这些探针的混合物可以固定在固体支持物上的相同位置,或者每种类型特异性探针可以固定在不同位置。每种对相同的HPV类型特异的探针优选地检测HPV靶点序列的不同部分。
所述探针可以在固体支持物上一式两份,以提供关于丰余的多个检测区域。
还可以检测一种或多种对照序列;例如,固定在固体支持物上的探针,其不与任何HPV型的靶点序列杂交。探针可以是人基因组靶点序列;那么测定可以包括从样品中扩增人靶点序列并且检测扩展是否发生。通过使用固定在固体支持物上的非特异性标记的序列,可以引入进一步的对照;标记的检测可以确保所述标记正确地工作。通过包括对照扩增序列,其可以通过用与人靶目标相同的引物扩增,但是其由在固体支持物上的不同的寡核苷酸检测,而还可以提供其它的对照。这种对照确保扩增正确地工作。
本发明还提供包含在其上固定多种HPV型-特异的探针的固体支持物的反应容器。还提供用于检测和分析HPV类型的试剂盒,其包括这样的反应容器,与核酸扩增混合物组合。所述混合物可以包括HPV共有引物诸如MY09和MY11;和任选地HMB01;扩增人靶点序列的引物;和对照扩增靶点序列,其包括与人靶点序列的侧连部分相对应的序列,以致使用相同的引物将发生两种靶点序列的扩增。所述试剂盒还可以包括关于其使用的用法说明。
附图简述
图1显示在具有12x11=132个位置的微点阵表面上的探针排列。数字与序列表的SEQ ID NO对应。单个探针固定在两个不同位置,以用于检测21种不同的HPV类型,DNA样品定性对照和扩增对照。LR=用于位置参照的探针(SEQ ID NO 140+SEQ ID NO 141)。
图2显示在具有12x11=132个位置的微点阵表面上的探针排列。数字与序列表的SEQ ID NO对应。单个探针或探针的混合物固定在两个不同位置,以用于检测23种不同的HPV类型,DNA样品定性对照和扩增对照。LR=用于位置参照的探针(SEQ ID NO 140+SEQ ID NO 141)。
图3显示在具有12x11=132个位置的微点阵表面上的探针排列。数字与序列表的SEQ ID NO对应。探针的混合物固定在两个不同位置,以用于检测42种不同的HPV类型和DNA样品定性对照。LR=用于位置参照的探针(SEQ ID NO 140+SEQ ID NO 141);M1=SEQ ID NO 76+SEQ ID NO 77+SEQ ID NO 78;M2=SEQ ID NO 122+SEQ ID NO 123+SEQ ID NO 124;M3=SEQ ID NO 116+SEQ ID NO 117+SEQ ID NO 118+SEQ ID NO 119。
图4显示在具有12x10=120个位置的微点阵表面上的探针排列。数字与序列表的SEQ ID NO对应。单个探针或探针的混合物固定在三个不同位置,以用于检测35种不同的HPV类型,DNA样品定性对照和扩增对照。LR=用于位置参照的探针(SEQ ID NO 140+SEQ ID NO 141);M1=SEQ ID NO 76+SEQ ID NO 77+SEQ ID NO 78;M2=SEQ ID NO 122+SEQ ID NO 123+SEQ ID NO 124。
图5显示在具有12x10=120个位置的微点阵表面上的探针排列。数字与序列表的SEQ ID NO对应。单个探针或探针的混合物固定在两个不同位置,以用于检测14种不同的HPV类型,DNA样品定性对照和扩增对照。LR=用于位置参照的探针(SEQ ID NO 140+SEQ ID NO 141);M4=SEQ ID NO 100+SEQ ID NO 101+SEQ ID NO 102。
图6显示用于作为扩增的阳性对照的PCR反应中的重组质粒pPG44的示意性表示。
图7显示本发明所用的‘点阵管’的照片。
发明详述
特异性检测和/或鉴定HPV型的方法包括下述步骤:
(i)扩增样品DNA:扩增从临床样品获得的DNA,优选地通过使用对于所有HPV已知的类型的通用引物的PCR进行扩增,所述通用引物侧连充分可变以允许进一步的基因型分析的基因组区域。尽管PCR是优选的扩增方法,样品中目标序列的扩增可以通过本领域已知的任何其它方法(连接酶链式反应,基于转录的扩增系统,链置换扩增等)实现。在本发明的一个实施方案中,使用引物MY11和MY09(Manos et al.,人癌症的分子诊断(Molecular Diagnostics of Human Cancer);Furth M,Greaves MF,eds.;冷泉港出版公司(Cold Spring Harbor Press).1989,vol.7:209-214),其扩增可变的L1区域。
在其扩增过程中在扩增的DNA中引入标记,以允许进一步的检测,优选引入可以通过比色方法检测的信号的标记。在优选的实施方案中,至少一种所用的引物在5’端使用生物素标记。然而,可以使用本领域已知的任何其它类型的标记(例如,洋地黄毒苷)。此外,标记扩增的DNA可以备选地通过在PCR混合物中添加携带标记的修饰核苷酸(例如,生物素化的或洋地黄毒苷dUTP衍生物)而实现。在某些实施方案中可以使用放射活性标记,或荧光团。
(ii)杂交:将来自步骤(i)的扩增的DNA变性(例如,通过热变性)并且应用到具有在表1中所示的那些探针中(SEQ ID NO:1-133)的一种或多种探针的‘点阵-管’中。还可以使用在扩增后制备单链DNA的其它方法。表1所示的每种探针(SEQ ID NO:1-133)能够特异性地与唯一一种HPV型的从步骤(i)扩增的L1区域杂交,并且因此,当这种类型在生物样品中存在时,能够特异性地鉴定这种HPV类型。样品中不同的HPV类型可以通过将来自所述HPV类型的扩增的DNA与至少一种但是优选地多于一种探针杂交而鉴定。
(iii)检测:DNA杂合体可以通过识别与配体特异性结合的标记或者通过免疫检测而检测到。在优选的实施方案中,生物素标记这样检测,即,通过与缀合辣根-过氧化物酶(HRP)的链霉抗生物素蛋白的特异结合,和随后N-四甲基联苯胺(TMB)转化成在相应的特异性探针结合的具体位置沉淀的蓝色颜料来检测。本领域公知的其它类型的缀合物也可以适用于本发明的目的(例如,链霉抗生物素蛋白-Au缀合物)。可以另外应用荧光标记的检测系统,间接或直接标记的荧光标记的检测系统。备选地,可以使用其它基于酶的系统。
(iv)分析并且处理结果:这样处理的′点阵-管′可以使用简单的光学装置,诸如光学显微镜或由CLONDIAG芯片技术GmbH(Jena,德国)制造的ATR01和ATS读数仪读取。
在一个备选的实施方案中,扩增和杂交步骤可以在同一点阵-管中进行;即,样品添加到点阵-管中,然后在所述管内扩增样品并且与探针杂交。
一种制备‘点阵-管’的方法在专利申请号US2005064469中公开。在本发明的一个优选的实施方案中,5’胺-连接的寡核苷酸探针在已知的不同位置结合在固体支持物表面。所述探针可以单个或者作为混合物固定在固体支持物上的描述(delineated)的位置。在一个优选的实施方案中,两种类型特异性探针用于每种HPV类型,其为包括在一种类型特异性探针的区域内已经发生核苷酸改变的变体的所有HPV正确分型提供额外的保证。优选地,应用能够在所扩增产物的分开区域杂交的两种类型-特异性探针。
所述探针或探针混合物可以固定在固体支持物的单一位置,优选地在固体支持物的两个不同位置,并且更优选地在固体支持物的三个不同位置。图1-5示例探针在微点阵表面的不同排列的示意图。
在本发明中所用的‘点阵-管’可以包括一种或多种选自序列表的核苷酸序列(SEQ ID NO:1-133)的HPV探针。另外它可以包括用于对照特异性检测的一种或多种探针,所述对照如PCR反应对照或来自样品对照的DNA的合适性(adequacy)。此外,它还可以包括一种或多种标记的寡核苷酸(例如,生物素修饰的寡核苷酸),用于检测反应的阳性对照和用于布置参照,以致所有其余的探针都可以定位。
HPV类型鉴定的特异性探针设计如下。所有参照HPVs的序列都保存在GenBank,包括已知的变体,对于扩增的L1区域,使用常规核酸比对程序如BioEdit(4,8.6.版本;Hall.Nucl Acids Symp Ser.(核酸专题论集系列)1999,41:95-98)进行比对,并且定位了在不同HPV类型中的大部分可变序列区域。从这些可变序列区域选择用作特异性探针的潜在寡核苷酸序列,优选地具有如下特征:长度为20-40个碱基,优选地约30个碱基长度;优选地没有二级结构或长于4个的连续相同的核苷酸链;优选地具有50%的G+C比例,并且在所有选择的探针中Tm尽可能相似得多;并且优选地在不同的HPV类型序列中错配的核苷酸尽可能多地位于寡核苷酸序列的中心。
使用NCBI网页的BLAST程序,将按照上述选择的每种潜在的探针序列针对在扩增的L1区域的所有已知的HPV序列进行比较(Altschul等.Nucleic Acid Res.(核酸研究)1997,25:3389-3402)。最终,选择当与所有已知的HPV类型比较时(除了当与所述寡核苷酸探针特异性针对的HPV类型比较时)具有至少三个核苷酸错配的探针,优选具有多于三个错配的探针。
本发明提供用于42种临床上最重要的HPV类型的特异性检测的探针(表1;SEQ ID NO 1-133),所述42种临床上最重要的HPV类型为:6,11,16,18,26,30,31,32,33,34/64,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,54,56,57,58,59,61,62,66,67,68,69,70,71,72,73,74,81,82,83,84,85和89。探针序列表示为从5’到3’端的单链DNA寡核苷酸。在本发明的一个优选的实施方案中,探针序列与反义链对应,但是对于本领域的任一技术人员都是显而易见的,这些探针可以按照原样,或者以它们的互补形式,或者以它们的RNA形式(其中T被U取代)的任一种使用。本发明的探针还可以通过加入或改变它们序列中的一个或多个没有显著影响它的功能的核苷酸而制备。
表1:
所述序列的核苷酸指定如下:G为鸟嘌呤,A为腺嘌呤,T为胸腺嘧啶,C为胞嘧啶,R为G或A,Y为T或C,M为A或C,K为G或T,S为G或C,W为A或T,H为A或C或T,B为G或T或C,V为G或C或A,D为G或A或T,并且最后,N为G或A或T或C。在本发明中所用核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和修饰的核苷酸,如肌苷酸或包含不主要(essentially)改变它们的杂交特征的修饰基团的核苷酸。
本发明的探针可以通过不同方法获得,诸如化学合成(例如,通过常规磷酸三酯方法)或遗传工程技术,例如通过重组质粒的分子克隆,在所述重组质粒中已经插入对应的核苷酸序列并且以后可以通过用核酸酶消化而获得对应的核苷酸序列。
对于一些HPV类型,从在所提及的HPV类型的不同变体的具体位置上含有不同核苷酸的序列区域设计探针。在这些情形中,使用简并探针,即,在所提及的位置分别含有备选的核苷酸的寡核苷酸的混合物。这是关于探针39C3d[SEQ ID NO 41],39C4d[SEQ ID NO 43],45C1d[SEQ IDNO 57],45C3d[SEQ ID NO 58],57A1d[SEQ ID NO 74],59C3_3d[SEQ IDNO 81],66B1[SEQ ID NO 91],66C3d[SEQ ID NO 93],和83B1d[SEQ IDNO 126]的情形。备选地,包含准确相同的序列区域但是在特定位置的核苷酸组成不同的两种寡核苷酸的等摩尔混合物用作单一探针(下列寡核苷酸的混合物:58B1a[SEQ ID NO 77]和58B1b[SEQ ID NO 78];68C4b[SEQ ID NO 100]和68C4c[SEQ ID NO 101];74A1a[SEQ ID NO 116]和74A1b[SEQ ID NO 117];74B1a[SEQ ID NO 118]和74B1b[SEQ ID NO119];和寡核苷酸82A2a-AS[SEQ ID NO 122]和82A2b-AS[SEQ ID NO123]的混合物)。
本发明公开的所有探针都已经证明在所述“点阵管”平台上在相同的杂交条件下特异性杂交它们的靶点序列。这一事实使得可以通过使用这种微点阵平台使用这些探针同时鉴定42种不同的HPV类型。由于其余的HPV类型是临床不相关的,所以通过使用在本发明中研发的所述“点阵管”鉴定的HPV类型的高数量使得这种方法还被认为是直接的检测方法。
诊断方法的一个弱点是出现假阴性。在本方法的情形中,假阴性可以由于低质量的DNA样品或由于在待分析的样品中存在DNA聚合酶抑制剂而引起。本发明举例说明通过使用两种类型的对照而消除这些假阴性的方法。
优选地使用由患者自身DNA的扩增物组成的一种对照,以保证DNA样品的良好质量。来自人DNA的任何序列片段都可以用作这一目的的靶点。认为来自单拷贝基因诸如CFTR基因的片段是在本发明中用于DNA质量的阳性对照的特别适合的靶点。设计引物CFTR-F4(SEQ ID IMO 134)和CFTR-R5(SEQ ID NO 135),用于扩增来自CFTR基因的892bp的片段。使用单拷贝相对多拷贝靶点和与HPV扩增的片段相比更大的质量DNA对照扩增产物的大小,即,分别为892bp相对大约450bp,允许在用于扩增HPV基因组的L1区域的同一反应混合物中包含用于CFTR扩增的引物,而具有最小程度的竞争作用。因此,质量DNA对照可以同时在分析样品的同一反应管中运行,而不影响HPV检测的灵敏性。
可以使用作为检测PCR反应失败,例如,由于存在DNA聚合酶抑制剂引起的失败的扩增阳性对照的第二种对照。在一个优选的实施方案中,扩增阳性对照由可以使用与扩增CFTR基因片段所用的相同的引物和相同的PCR条件进行扩增的重组质粒组成。引物的大小和内部序列在PCR产物之间不同,这是由CFTR基因的扩增和重组质粒的扩增导致。在这种方法中,两种扩增产物的类型可以通过凝胶电泳或通过用特异性探针杂交而容易地区分。图6显示具有这些特征的重组质粒pPG44的示意图。
质粒pPG44通过分子克隆技术构建。简言之,使用由美国威斯康辛州麦迪逊市普洛麦格公司(Promega Corporation,Madison,WI,USA)提供的商购试剂盒,将侧连CFTR引物CFTR-F4和CFTR-R5的由从载体II SK+(Stratagene,La JoIIa,加州,美国)的位置124到位置1285的1162bp的片段组成的DNA插入片段克隆到-T Easy载体中。将得到的重组质粒pPG44的纯化的制备物通过使用限制性酶和通过序列分析而进一步特征性描述。质粒pPG44以线性形式用作扩增方法的阳性对照。
在分析样品的同一PCR扩增混合物中存在所提及的重组质粒作为阳性对照防止假阴性结果的出现,即,它甚至在样品中存在目标HPV基因组时,防止给出阴性结果,原因在于,当没有扩增产物产生时,必定假设PCR扩增没有正确运行,而不能得出关于样品中存在还是不存在HPV基因组的结论。
表2提供特异性检测所述的两种类型的阳性对照,即,DNA质量对照和扩增反应对照的探针(SEQ ID NO 136-139和SEQ ID NO 145-147)。与本发明的任何扩增产物没有显著相同性的寡核苷酸序列(SEQ ID NO140-141)也在所述表2中提供。当固定在微点阵的表面时,生物素修饰的寡核苷酸SEQ ID NO 140和SEQ ID NO 141作为PCR产物检测反应的阳性对照,并且作为布置参照,以致所有其余的探针都可以放置。
表2:
本发明还涉及用于特异性检测临床样品中的HPV类型的体外诊断试剂盒。优选地,所提及的试剂盒包括任何或全部下述成分:扩增混合物,包括扩增缓冲液,dNTPs,引物和对照质粒;洗涤缓冲液;检测试剂;点阵管,其包含含有HPV类型-特异的探针的固体支持物;用于获得和制备样品的试剂。尽管熟练的技术人员应该能够确定适当的试剂盒成分和缓冲液组成,但是具体的成分将取决于所述试剂盒意欲使用的准确条件。
实施例
下文提供的实施例只是举例说明本发明,而不以任何方式限制后附的权利要求的范围。
实施例1:制备‘点阵-管’
本发明的‘点阵管’在CLONDIAG芯片技术GmbH(Jena,德国)制备如下。将来自Eppendorf由聚丙烯制成的并且具有1.5ml的指定接收体积的标准反应测试管通过重熔而进行改进,以致在所述管中模塑具有粘合边的用于微点阵支持物的开放的凹进处。
要插入这些管的微点阵通过使用MicroGrid II Arrayer(生物机器人(BioRobotics),剑桥,英国)生产。将由具有来自序列表的序列的5’端氨基-修饰的寡核苷酸组成的探针布置在载玻片(载玻片大小:75mm×25mm)的环氧化玻璃表面上的确定位点,并且共价固定。单一微点阵包含12x10=120,或12x11=132个可以布置寡核苷酸的具体位置。这些位置具有0.2mm的间隔,以致在每一微点阵中包含的DNA文库覆盖2.4mmx2.4mm的面积,并且,以这种方式每个载玻片总计可以产生多于100种相同的DNA文库。取决于实验的类型,可以在这些位置的每一个位置上放置每种单一探针或它们的混合物。通常,当进行关于探针选择的特异性和灵敏性实验时,在每个位置放置单一探针。一旦探针已被验证,可以将能够在特异的HPV类型扩增产物的分开区域杂交的探针的混合物放置在进行HPV基因型测定鉴定的相同位置。图1-5显示本发明所用的微点阵内的探针的不同排列。在每个微点阵中包含每种探针或探针混合物的两次或三次重复。
除了用于HPV基因型分析和用于检测扩增对照以及DNA对照合适性的特异性探针之外,微点阵在一些位置包括与本发明的任何扩增序列都没有显著相同性的参照标记,所述参照标记由5’端生物素修饰的寡核苷酸(标记-1[SEQ ID NO 140]和标记-2[SEQ ID NO 141])组成。这些参照标记用于检验检测反应的正确性能和通过读数仪的成像的光学定位,因此所有其余的探针都可以定位,并且进行数据分析。
所有的寡核苷酸都从1×QMT点样溶液I(Quantifoil Micro ToolsGmbH,Jena,德国)放置在在所述载玻片上。在每种点样溶液中的寡核苷酸的总浓度在2.5μM参照标记到20μM特异性探针的范围内。然后,通过在60℃烘焙30分钟,然后进行多步洗涤处理,而将寡核苷酸共价连接到玻璃表面的环氧化物基团上。将晾干的载玻片分割成3.15mmx3.15mm的玻璃片,严格来说,这就是我们所称为的微点阵。在‘点阵管’制备的最后步骤中,然后将这些微点阵插入到前文提及的改进的Eppendorf管中,并且胶合到粘合边上。图7显示按照本实施例所述生产的‘点阵管’的照片。
实施例2:制备DNA样品
2.1.HPV DNA标准
用于评估类型-特异的探针的特异性和灵敏性的HPV DNAs是含有扩增的L1区域(HPV类型6,11,13,16,18,26,31,33,35,39,40,42,44,45,51,52,53,54,56,58,61,62,66,68,70,71,72,73,81,82,83,84,85和89)的重组质粒,或者是从临床样品提取的DNAs,所述临床样品的扩增的L1区域通过DNA测序进一步特征性描述。重组质粒通过分子克隆技术构建。简言之,使用由美国威斯康辛州麦迪逊市普洛麦格公司(PromegaCorporation,Madison,WI,USA)提供的商购试剂盒,将从每种HPV类型扩增的L1区域克隆到-T Easy载体中。将从每种重组质粒获得的纯化的制备物通过序列分析而进一步特征性描述。将1-10pg质粒DNA用于特异性实验的评估。
来自K562细胞系的DNA(目录号DD2011,普洛麦格公司,Madison,WI,美国)用于评估CFTR特异性探针的特异性和灵敏性。
2.2.临床样品
为了检测HPV的目的,首先需要从剩余的生物材料中分离DNA。DNA制备步骤根据样品来源而不同。提供从各种来源的样品制备DNA的具体的实例:
A.药签:样品用洁净、干燥的棉签采取。通过向具有样品的容器中直接加入1.5ml盐水,并且用力振荡,而回收来自临床药签的细胞。将样品物质转移到1.5ml Eppendorf管中,并且通过离心沉淀。倒掉上清,并且将沉淀的细胞悬浮在100μl的裂解缓冲液中,所述裂解缓冲液含有10mM Tris-HCl(在25℃ pH 9.0),50mM KCl,0.15mM MgCl2,0.1%X-100,0.5%吐温20,和0.25mg/ml蛋白酶K。将这一混合物在56℃温育大约2小时,并且通过将所述混合物在100℃加热10分钟而使蛋白酶K热失活。碎片通过离心沉淀,并且将上清转移到洁净并且无菌的管中。随后将5μl整分试样用于PCR反应。
B.细胞混悬液:这种类型的样品指用于基于子宫颈阴道液的细胞学检测中所用的样品。子宫颈标本用刷子或刮刀(spatula)采集,并且重悬在PreservCyt溶液(Cytyc公司,Marlborough,MA,美国)中。将1ml的整分试样离心,并且将沉淀重悬在1ml盐水中。再一次离心步骤后,将沉淀重悬在100μl与在A段中用于药签样品相同的裂解缓冲液中,并且以与在那一部分相同的方式继续流程。
C.福尔马林固定的和石蜡包埋的活组织切片:在本方法中使用5μm宽度的一些组织切片,典型地2-5片切片,这取决于所述活组织切片的表面积。将切片置于1.5ml无菌管中,并且加入100μl与在A段中用于药签样品相同的裂解缓冲液。除了使用蛋白酶K的温育进行3小时以外,以与在那一部分相同的方式继续流程。
备选地,将设计用于从来自各种来源的样品分离DNA的商业试剂盒(组织试剂盒,目录号635966,来自BD生物科学克隆技术(BDBiosciences Clontech),Palo Alto,CA,美国)用于处理药签、细胞混悬液或福尔马林固定的和石蜡包埋的活组织切片样品。在这种情形中,DNA分离流程的起始如在A、B和C部分所述。取代100μl的裂解缓冲液,向样品中加入180μl的缓冲液T1。流程按照供应商关于从细胞和组织中分离基因组DNA的说明书而继续。
不管是临床样品类型还是DNA制备方法,阴性对照都在每一批次的样品中平行运行。这些由1ml盐水组成的阴性对照以与在部分A中相同的方法进行处理。
实施例3:PCR扩增
进行使用共有引物MY11和MY09的PCR扩增(Manos等,MolecularDiagnostics of Human Cancer(人类癌症的分子诊断);Furth M,Greaves MF,eds.;Cold Spring Harbor Press(冷泉港出版社).1989,卷7:209-214)。在所述PCR反应中还包含第三种引物,HMB01,其通常与MY09和MY11组合使用以扩增只使用MY09和MY11不能有效扩增的HPV类型51(Hildesheim等,J Infect Dis.(传染病杂志)1994,169;235-240)。简言之,PCR扩增在50μl的终体积反应中进行,所述反应中包含10mM Tris-HClpH 8.3,50mM KCl,1mM MgCl2,0.3μM每种引物MY09和MY11(SEQ IDNO 142和143),0.03μM引物HMB01(SEQ ID NO 144),200μM每种dNTP,4个单位的AmpliTaq Gold DNA聚合酶(应用生物系统(AppliedBiosystems),Foster City,CA,美国),和5μl每种来自实施例2.1.的HPVDNA标准或来自实施例2.2.的临床样品DNA。为了检测样品DNA的适合性,还将0.08μM每种引物CFTR-F4和CFTR-R5(SEQ ID NO 134和135)加入到反应混合物中。另外,为了检验扩增过程并且消除由于反应失败导致的假阴性结果,在分析样品的同一反应管中包含20fg内部对照pPG44。用于所述PCR反应的所有正向引物(MY11[Seq ID NO 143]和CFTR-F4[Seq ID NO 134])都在5’端生物素修饰,以致随后可以检测任何扩增的DNA。
由5μl来自实施例2.2.的空白样品或5μl去离子水组成的阴性对照与样品DNA平行处理。使用这些种类的阴性对照用来检验在样品处理的任一点或在PCR反应设置中没有发生污染,并且所有阳性结果表示DNA在样品中的真实存在。
PCR反应在以下述循环概述编程的Mastercycler热循环器(Eppendorf,Hamburg,德国)中进行:1个初始变性循环,95℃ 9分钟;45个循环,在94℃ 30秒,55℃ 60秒和72℃ 90秒;和一种最后延伸循环,72℃ 8分钟。扩增之后,将5μl每种反应物用于使用特异性探针的后续检测。
实施例4:使用‘点阵管’同时鉴定HPV基因型
在使用前,通过向每个管中加入300μl 0.5×PBS-吐温20缓冲液,并且将它们颠倒几次,而将‘点阵管’预洗。使用与真空系统连接的巴斯德移液器,移除每个管内的所有液体。
通过将它们在95℃加热10分钟,并且然后立即将它们在冰上冷却5分钟,而将实施例3的扩增反应物变性。将5微升变性的扩增反应物和100μl杂交溶液(250mM磷酸钠缓冲液,pH 7.2;SSC 1×;0.2%X-100;1mM EDTA,pH 8.0)一起用于在实施例1中制备的‘点阵管’。杂交反应在热混合器comfort(Eppendorf,Hamburg,德国)中进行,通过将‘点阵管’在550rpm摇动下在55℃温育1小时而进行。温育期间后,使用与真空系统连接的巴斯德移液器,将杂交反应物移除,并且用300μl 0.5XPBS-吐温20缓冲液进行洗涤步骤。
通过在550rpm摇动下在100μl 0.075μg/ml聚-HRP链霉抗生物素蛋白(Pierce生物技术公司(Pierce Biotechnology Inc.),Rockford,IL,美国)溶液中在30℃温育15分钟,而检测杂交的DNA。然后,迅速将来自‘点阵管’的所有液体移除,并且进行如上文提及的两个洗涤步骤。显色反应在100μl True BlueTM过氧化物酶底物(KPL,Gaithersburg,MD,美国)中进行,其由含有3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)的缓冲溶液和H2O2组成,显色反应通过在25℃温育10分钟进行。这样产生的有颜色的沉淀物引起在微点阵的具体位置的光学透射的改变,其可以使用由CLONDIAG芯片技术GmbH(Jena,德国)制造的ATR01和ATS读数仪读取。任选地,ATS读数仪可以具有安装的特殊软件,以用于自动处理使用本发明研发的‘点阵管’获得的样品分析结果。
Claims (65)
1.用于检测并且分析样品中人乳头瘤病毒(HPV)的类型的非诊断目的测定,所述测定包括:
在样品上进行核酸扩增反应,所述扩增反应意欲以非类型特异性方式扩增HPV目标序列;
从任意扩增产物获得单链寡核苷酸;
在可能的情形中,允许单链寡核苷酸与在固体支持物上提供的多种HPV类型-特异性探针进行杂交,所述多种HPV类型-特异性探针是对于HPV类型6,11,16,18,26,30,31,32,33,34/64,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,54,56,57,58,59,61,62,66,67,68,69,70,71,72,73,74,81,82,83,84,85和89中的至少20种特异的探针,并且多种所述探针选自一个或多个下述SEQ IDs组:用于检测HPV类型6的1或2;用于HPV类型11的3或4;用于HPV类型16的5-9;用于HPV类型18的10-13;用于HPV类型26的14-18;用于HPV类型30的19-21;用于HPV类型31的22-25;用于HPV类型32的26或27;用于HPV类型33的28-31;用于HPV类型34/64的32或33;用于HPV类型35的34-37;用于HPV类型39的38-43;用于HPV类型40的44或45;用于HPV类型42的46-50;用于HPV类型43的51或52;用于HPV类型44的53或54;用于HPV类型45的55-59;用于HPV类型51的60-64;用于HPV类型52的65或66;用于HPV类型53的67或68;用于HPV类型54的69-71;用于HPV类型56的72或73;用于HPV类型57的74或75;用于HPV类型58的76-78;用于HPV类型59的79-83;用于HPV类型61的84-86;用于HPV类型62的87-89;用于HPV类型66的90-94;用于HPV类型67的95-97;用于HPV类型68的98-102;用于HPV类型64的103或104;用于HPV类型70的105或106;用于HPV类型71的107或108;用于HPV类型72的109或110;用于HPV类型73的111-115;用于HPV类型74的116-119;用于HPV类型81的120或121;用于HPV类型82的122-124;用于HPV类型83的125或126;用于HPV类型84的127或128;用于HPV类型85的129或130;用于HPV类型89的131-133,所述支持物位于适合容纳所述样品的反应容器内;并且
检测杂交的寡核苷酸。
2.权利要求1的测定,其中所述HPV类型-特异性探针包括DNA。
3.权利要求1或2的测定,其中所述核酸扩增步骤在反应容器内与固体支持物上的HPV类型-特异性探针接触的样品上进行。
4.权利要求1或2的测定,其中所述核酸扩增步骤在将扩增的样品引入到所述反应容器以与在固体支持物上的HPV类型-特异性探针接触之前在样品上进行。
5.权利要求1或2的测定,其中选择所述探针,以在对于所有探针都相同的杂交条件下与HPV目标序列特异性结合。
6.权利要求1或2的测定,其中所述探针长度为20-40nt。
7.权利要求1或2的测定,其中所述探针是25-35nt。
8.权利要求1或2的测定,其中所述探针是28-32nt。
9.权利要求1或2的测定,其中所述探针是30nt。
10.权利要求1或2的测定,其中所述探针对HPV的L1区域特异。
11.权利要求1或2的测定,其中每种探针有至少2nt与对另一种HPV类型特异的探针不同。
12.权利要求1或2的测定,其中每种探针有至少3nt与对另一种HPV类型特异的探针不同。
13.权利要求1或2的测定,其中所述多种探针中的一种或多种探针选自包括SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 133的组。
14.权利要求1或2的测定,其中所有的探针都选自包括SEQ ID NO1-SEQ ID NO 133的组。
15.权利要求1或2的测定,其中探针选自所述组的每一组。
16.权利要求1或2的测定,其中每种探针选自所述组,并且至少一种探针选自所述组的每一组。
17.权利要求1或2的测定,其中两种或多种探针选自所述组的每一组。
18.权利要求1或2的测定,其中所述探针选自下述SEQ IDs:2,4,7,8,9,12,13,16,17,18,19,20,21,24,25,26,27,30,31,32,33,36,37,40,41,42,43,45,48,49,50,51,52,53,54,57,58,59,61,62,63,64,66,67,68,70,71,73,74,75,76,81,82,83,84,85,86,87,88,89,91,92,93,94,95,96,97,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,112,114,115,116,117,118,119,120,121,124,126,128,129,130,131,132,133。
19.权利要求1或2的测定,其中多种探针是对同一种HPV类型特异的。
20.权利要求1或2的测定,其中多种探针是对每种待检测的HPV类型特异的。
21.权利要求19的测定,其中所述多种探针的每一种固定在固体支持物的同一区域。
22.权利要求19的测定,其中所述多种探针的每一种固定在固体支持物的不同区域。
23.权利要求19的测定,其中对于同一种HPV类型特异的每种探针检测所述HPV目标序列的不同部分。
24.权利要求19的测定,其中至少一种探针存在于固体支持物的至少两个不同位置。
25.权利要求19的测定,其中所有探针都存在于固体支持物的至少两个不同位置。
26.权利要求1或2的测定,其还包括检测一种或多种对照序列。
27.权利要求26的测定,其中所述对照序列包括固定在固体支持物上不与任何HPV类型的目标序列杂交的探针。
28.权利要求26的测定,其中所述对照序列包括人类基因组的目标序列。
29.权利要求28的测定,其中所述人类目标序列包括至少CFTR基因的片段。
30.权利要求1或2的测定,其还包括扩增已知的对照序列,和检测扩增的产物。
31.权利要求1或2的测定,其包括将扩增反应混合物与样品组合以进行扩增反应。
32.权利要求1或2的测定,其中所述扩增反应是PCR。
33.权利要求1或2的测定,其中单链寡核苷酸通过将任何存在的双链寡核苷酸变性而获得。
34.权利要求33的测定,其中所述变性步骤在包含在反应容器内的样品上进行。
35.权利要求1或2的测定,其中所述单链寡核苷酸被允许在严格条件下杂交。
36.用于检测并且分析样品中人乳头瘤病毒(HPV)的类型的非诊断目的测定,所述测定包括:
在包含其上固定了多种HPV类型-特异性探针的固体支持物的反应容器中,在样品上进行核酸扩增反应,所述扩增反应意欲以非类型特异性方式扩增HPV目标序列;
从任意扩增产物获得单链寡核苷酸;
在可能的情形中,允许单链寡核苷酸与所述多种HPV类型-特异性探针进行杂交,所述多种HPV类型-特异性探针是对于HPV类型6,11,16,18,26,30,31,32,33,34/64,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,54,56,57,58,59,61,62,66,67,68,69,70,71,72,73,74,81,82,83,84,85和89中的至少20种特异的探针,并且多种所述探针选自一个或多个下述SEQ IDs组:用于检测HPV类型6的1或2;用于HPV类型11的3或4;用于HPV类型16的5-9;用于HPV类型18的10-13;用于HPV类型26的14-18;用于HPV类型30的19-21;用于HPV类型31的22-25;用于HPV类型32的26或27;用于HPV类型33的28-31;用于HPV类型34/64的32或33;用于HPV类型35的34-37;用于HPV类型39的38-43;用于HPV类型40的44或45;用于HPV类型42的46-50;用于HPV类型43的51或52;用于HPV类型44的53或54;用于HPV类型45的55-59;用于HPV类型51的60-64;用于HPV类型52的65或66;用于HPV类型53的67或68;用于HPV类型54的69-71;用于HPV类型56的72或73;用于HPV类型57的74或75;用于HPV类型58的76-78;用于HPV类型59的79-83;用于HPV类型61的84-86;用于HPV类型62的87-89;用于HPV类型66的90-94;用于HPV类型67的95-97;用于HPV类型68的98-102;用于HPV类型64的103或104;用于HPV类型70的105或106;用于HPV类型71的107或108;用于HPV类型72的109或110;用于HPV类型73的111-115;用于HPV类型74的116-119;用于HPV类型81的120或121;用于HPV类型82的122-124;用于HPV类型83的125或126;用于HPV类型84的127或128;用于HPV类型85的129或130;用于HPV类型89的131-133;并且
检测杂交的寡核苷酸;
其中所述扩增反应在与所述固体支持物接触的样品中进行。
37.用于进行检测和分析样品中HPV的类型的测定的反应容器,所述探针对于HPV类型6,11,16,18,26,30,31,32,33,34/64,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,54,56,57,58,59,61,62,66,67,68,69,70,71,72,73,74,81,82,83,84,85和89中的至少20种是特异的,并且多种所述探针选自一个或多个下述SEQ IDs组:用于检测HPV类型6的1或2;用于HPV类型11的3或4;用于HPV类型16的5-9;用于HPV类型18的10-13;用于HPV类型26的14-18;用于HPV类型30的19-21;用于HPV类型31的22-25;用于HPV类型32的26或27;用于HPV类型33的28-31;用于HPV类型34/64的32或33;用于HPV类型35的34-37;用于HPV类型39的38-43;用于HPV类型40的44或45;用于HPV类型42的46-50;用于HPV类型43的51或52;用于HPV类型44的53或54;用于HPV类型45的55-59;用于HPV类型51的60-64;用于HPV类型52的65或66;用于HPV类型53的67或68;用于HPV类型54的69-71;用于HPV类型56的72或73;用于HPV类型57的74或75;用于HPV类型58的76-78;用于HPV类型59的79-83;用于HPV类型61的84-86;用于HPV类型62的87-89;用于HPV类型66的90-94;用于HPV类型67的95-97;用于HPV类型68的98-102;用于HPV类型64的103或104;用于HPV类型70的105或106;用于HPV类型71的107或108;用于HPV类型72的109或110;用于HPV类型73的111-115;用于HPV类型74的116-119;用于HPV类型81的120或121;用于HPV类型82的122-124;用于HPV类型83的125或126;用于HPV类型84的127或128;用于HPV类型85的129或130;用于HPV类型89的131-133,所述容器包括其上固定了多种HPV类型-特异性探针的固体支持物,并且适合容纳与所述固体支持物接触的样品。
38.权利要求37的容器,其中所有的探针都选自包括SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 133的组。
39.权利要求37的容器,其中探针选自所述组的每一组。
40.权利要求37的容器,其中每种探针选自所述组,并且至少一种探针选自所述组的每一组。
41.权利要求37的容器,其中两种或多种探针选自所述组的每一组。
42.权利要求37-41中任一项的容器,其中所述探针选自下述SEQ IDs:2,4,7,8,9,12,13,16,17,18,19,20,21,24,25,26,27,30,31,32,33,36,37,40,41,42,43,45,48,49,50,51,52,53,54,57,58,59,61,62,63,64,66,67,68,70,71,73,74,75,76,81,82,83,84,85,86,87,88,89,91,92,93,94,95,96,97,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,112,114,115,116,117,118,119,120,121,124,126,128,129,130,131,132,133。
43.权利要求37的容器,其中所述容器适合在与所述固体支持物接触的样品上进行核酸扩增反应。
44.权利要求37的容器,其中选择所述探针,以在包含适于进行核酸扩增反应的反应混合物的样品中特异性地结合HPV目标序列。
45.权利要求37的容器,其包括对至少20种HPV类型特异的探针。
46.权利要求37的容器,其包括对于HPV类型6,11,16,18,26,30,31,32,33,34/64,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,54,56,57,58,59,61,62,66,67,68,69,70,71,72,73,74,81,82,83,84,85和89中的至少20种特异的探针。
47.权利要求37的容器,其中至少一种探针种类存在于固体支持物的至少两个不同位置。
48.权利要求37的容器,其中所有探针种类都存在于固体支持物的至少两个不同位置。
49.权利要求37的容器,其还包括在固体支持物上的一种或多种对照序列。
50.权利要求49的容器,其中所述对照序列包括固定在固体支持物上不与任何HPV类型的目标序列杂交的探针。
51.权利要求50的容器,其中所述对照序列包括人类基因组的目标序列。
52.权利要求51的容器,其中所述人类目标序列包括至少CFTR基因的片段。
53.用于检测并且分析HPV类型的试剂盒,其包括权利要求37的反应容器,与下述一项或多项组合:
i)用于DNA提取和/或纯化的试剂;
ii)核酸扩增混合物;
iii)用于显现核酸与反应容器的探针杂交的试剂。
54.权利要求53的试剂盒,其中所述扩增混合物是在与包括具有HPV类型-特异性探针的固体支持物的反应容器分开的反应容器中提供。
55.权利要求53的试剂盒,其中所述扩增混合物是在包括具有HPV类型-特异性探针的固体支持物的反应容器中提供。
56.权利要求53的试剂盒,其中所述扩增混合物包括标记的dNTPs。
57.权利要求53的试剂盒,其中所述扩增混合物包括与HPV目标序列的片段杂交的HPV共有引物。
58.权利要求57的试剂盒,其中所述HPV共有引物包括MY09和MY11;和任选地HMB01。
59.权利要求53的试剂盒,其中所述扩增混合物包括用于扩增人目标序列的引物。
60.权利要求59的试剂盒,其中所述人目标序列与HPV目标序列长度不同。
61.权利要求59或60的试剂盒,其中所述人目标序列是CFTR基因的至少片段。
62.权利要求61的试剂盒,其中所述引物包括SEQ ID NO 134所示的CFTR-F4和SEQ ID NO 135所示的CFTR-R5的至少一种。
63.权利要求53的试剂盒,其中所述引物是标记的引物。
64.权利要求53的试剂盒,其包括对照扩增目标序列。
65.权利要求64的试剂盒,其中对照扩增目标序列包括与人目标序列的侧翼部分相对应的序列,以致使用相同的引物将发生两种目标序列的扩增。
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