CN102168148B

CN102168148B - 用于检测人巨细胞病毒和/或单纯疱疹病毒的引物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN102168148B
Application number: CN 201010122190
Authority: CN
Inventors: 倪剑锋; 赵珊珊; 杨文辉; 谢育媛; 邓其涛
Original assignee: GENEINN BIOTECHNOLOGY (NINGBO) CO Ltd
Current assignee: GENEINN BIOTECHNOLOGY (NINGBO) CO Ltd
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2030-02-26
Also published as: CN102168148A

Abstract

本发明提供一种用于检测人巨细胞病毒和/或单纯疱疹病毒的引物、试剂盒及方法。一种用于检测人巨细胞病毒的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：2；用于检测单纯疱疹病毒1型的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：3，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：4；用于检测单纯疱疹病毒2型的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：5，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：6。本发明所提供的利用引物或其组合物、工具、试剂盒检测人巨细胞病毒和/或单纯疱疹病毒的方法可以在基因水平上进行迅速判断，灵敏度较高和特异性较好，具有节约时间、技术成熟及检测结果稳定的优点。

Description

用于检测人巨细胞病毒和/或单纯疱疹病毒的引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种用于检测人巨细胞病毒和/或单纯疱疹病毒的引物、试剂盒及方法。

背景技术

巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)是一种DNA病毒，是新生儿包涵体病(CID)的病原体，其直径约200nm，为最大的动物病毒。人类感染巨细胞病毒非常普遍，根据1981年中国医学科学院病毒学研究所等单位在北京市的调查研究，30岁以下怀孕26周左右的妇女血清中抗CMV的补体结合抗体阳性率为72.60％(115/208)，怀孕38周者的阳性率为76.84％(136/177)(以上均为北京市市内妊妇)。妊娠母体感染CMV可以通过胎盘侵袭胎儿引起先天性感染，少数造成早产、流产、死产或生后死亡。患儿可发生黄疸，肝脾肿大，血小板减少性紫斑及溶血性贫血。儿童常遗留永久性智力低下，神经肌内运动障碍，耳聋和脉络视网膜炎等。

单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)属于疱疹病毒科，有HSV1和HSV 2两个血清型。HSV 1型感染常为口腔粘膜感染、上身皮肤感染、淋巴结肿大，约占10％。其主要引起上半身皮肤、粘膜或器官疱疹，但极少感染胎儿。HSV 2型为生殖器疱疹，约占90％。HSV 1好发于1～14岁儿童，HSV 2好发于14岁以上人群。我国血清学调查发现成人中90％有HSV 1的IgG，20％有HSV 2的IgG，说明成年人绝大多数既往感染过HSV。单纯疱疹病毒可引起皮肤、粘膜及多种器官感染。它可以通过性接触感染而发生生殖器疱疹(Genital herpes)。大多数生殖器疱疹由HSV 2引起，目前HSV成为不少国家和地区生殖器溃疡发病的首要病因，同时还与宫颈癌的发病及新生儿疱疹病的传染有关。

世界许多国家已将巨细胞病毒(Human Cytomegalo virus，HCMV)和单纯疱疹病毒1型和2型(Herpes simplex virus1/2，HSV1/2)检测作为孕期筛查项目。对未孕前曾感染的妇女作预防接种，对未孕感染者进行治疗，建议治愈后怀孕。对孕早期急性感染者则建议终止妊娠。对孕中、晚期感染者酌情处理。我国部分医院开展的新生儿缺陷检测工作已将这两种病毒列入必检项目。

目前已有的检测方法有病原学检测、酶联免疫检测、杂交和PCR检测等。病原学检测分离、培养费时长，费用高，不适用于常规检测。酶联免疫检测方法简单、易行，是目前普遍运用的方法，但是其灵敏度有限，对某些IgM的检出率不高。核酸原位杂交方法欠灵敏，特异性不高，不能作为临床的常规诊断。普遍认为PCR法具有重复性好、特异性强、敏感性高的特点，其检测病原体的关键是必须选择该病原体的特异且稳定存在的基因片段。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种用于检测巨细胞病毒和/或单纯疱疹病毒的引物或引物组合物。

本发明的另一个目的是提供上述引物或引物组合物在制备用于检测巨细胞病毒和/或单纯疱疹病毒的工具中的用途。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测巨细胞病毒和/或单纯疱疹病毒的试剂盒。

本发明的又一个目的是提供一种用于检测巨细胞病毒和/或单纯疱疹病毒的方法。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。

一方面，本发明提供一种用于检测巨细胞病毒的引物，该引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明提供一种用于检测单纯疱疹病毒1型的引物，该引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：3，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明提供一种用于检测单纯疱疹病毒2型的引物，该引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：5，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：6。

此外，本发明还提供一种用于检测巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和/或单纯疱疹病毒2型的引物组合物，该引物组合物包括至少一种上述引物以及内参引物，该内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：7，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：8。

本发明还提供上述引物或引物组合物在制备用于检测人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和/或人单纯疱疹病毒2型的工具中的用途。

另一方面，本发明提供一种用于检测人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和/或单纯疱疹病毒2型的试剂盒，该试剂盒包括至少一种上述引物或上述引物组合物。该试剂盒还可以包括细胞裂解液、核酸结合液、核酸漂洗液、核酸洗脱液和PCR反应液。

又一方面，本发明提供一种用于检测人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和/或单纯疱疹病毒2型的方法，该方法包括以下步骤：

1)提取样本DNA；

2)使用上述引物、引物组合物或试剂盒对步骤1)得到的DNA进行PCR扩增；

3)检测步骤2)得到的扩增产物。

其中，步骤1)中的样本优选为人宫颈上皮细胞。步骤3)中的检测方法优选为微流体芯片检测法。

在本发明的一个优选实施方案中，通过对患者宫颈组织细胞的DNA进行巨细胞病毒(HCMV)和单纯疱疹病毒1型(HSV1)、单纯疱疹病毒2型(HSV2)检测，从而诊断患者是否感染了这3种病毒，具体包括以下步骤：

1)提取人临床样本的DNA。

2)将巨细胞病毒特异性引物和两种单纯疱疹病毒特有基因的特异性引物混合，对被测样本的DNA进行多重PCR扩增，被扩增的目标基因片段大小各不相同。

3)扩增产物通过微流体芯片进行检测。

4)通过各检测峰的位置确定检测到的片段的大小，从而判断检测到的基因，鉴别临床样本所感染的病毒类别。

5)结果判断：a)未出现任何特异性峰，说明临床样本的DNA没有提取出来，检测无效；b)只出现DNA内参特异性峰，说明没有巨细胞病毒和单纯疱疹病毒(HSV1、HSV2)感染；c)出现DNA内参和巨细胞病毒特异性峰，说明有巨细胞病毒感染；d)出现DNA内参和单纯疱疹病毒1(HSV1)特异性峰，说明有单纯疱疹病毒1感染；e)出现DNA内参和单纯疱疹病毒2(HSV2)特异性峰，说明有单纯疱疹病毒2感染；f)出现DNA内参、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒1(HSV1)特异性峰，说明有巨细胞病毒和单纯疱疹病毒1(HSV1)感染；g)出现DNA内参、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒2(HSV2)特异性峰，说明有巨细胞病毒和单纯疱疹病毒2(HSV2)感染；h)出现DNA内参、单纯疱疹病毒1和2(HSV1、HSV2)特异性峰，说明有单纯疱疹病毒1和2(HSV1、HSV2)感染；i)出现DNA内参、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1和2(HSV1、HSV2)特异性峰，说明有巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1和2(HSV1、HSV2)感染。

本发明的检测方法属于PCR类检测方法，检测手段采用微流体芯片，比起传统的电泳检测法，检测时间短、结果清晰明了，更容易判断。此外，本发明所提供的检测方法操作简单，成本较低，适宜推广应用。具体地，本发明具有以下有益效果：

首先，本发明分别提供了用于检测人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型的引物，它们可以分别特异性扩增出人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型的保守序列。其次，本发明提供了用于检测人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型的引物组合物，其中包括至少一种上述用于检测人巨细胞病毒的引物、用于检测单纯疱疹病毒1型的引物或用于检测单纯疱疹病毒2型的引物，以及优选的人DNA保守序列特有基因的特异性引物作为内参引物。该内参引物的设计选用了人β球蛋白(β-globin)基因，因为人体细胞中都含有此基因，引入该内参基因可以确定模板的提取质量，避免扩增结果的假阴性。

相应地，本发明提供了用于人巨细胞病毒和/或单纯疱疹病毒的工具、试剂盒和方法，其中均采用了至少一种上述用于检测人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型的引物，或者包括至少一种上述用于检测人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型，以及内参引物的引物组合物，是具有较高灵敏度和特异性的检测工具或方法，能够高效、特异性地扩增出目的DNA。

本发明提供了一种可快速便捷检测巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和2型的方法，可以在基因水平上进行迅速的判断，具有较好的灵敏度和特异性。该方法可直接对患者的临床样本(例如血液、体液等)进行检测，不需要对样本进行培养后再对病毒株进行检测，节约了时间。同时，微流体芯片检测法比传统的DNA电泳检测法更简单、快捷、直观，可以为临床用药提供准确、及时的指导。本发明所提供的方法技术成熟，检测结果稳定，比传统的滤纸片法、凝胶法等更快捷、灵敏、准确。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明实施例2中单独使用B297引物扩增DNA样品的电泳结果图。

图2为本发明实施例2中单独使用B658引物扩增DNA样品的电泳结果图。

图3A～图3H为本发明实施例3中DNA样品的电泳检测结果图，其中图3A为未感染病毒的样品，图3B为感染HCMV的样品，图3C为感染HSV1的样品，图3D为感染HSV2的样品，图3E为感染HCMV和HSV1的样品，图3F为感染HCMV和HSV2的样品，图3G为感染HSV1和HSV2的样品，图3H为感染HCMV、HSV1和HSV2的样品。

图4A～图4H为本发明实施例6中DNA样品的微流体芯片检测结果图，其中图4A为未感染病毒的样品，图4B为感染HCMV的样品，图4C为感染HSV1的样品，图4D为感染HSV2的样品，图4E为感染HCMV和HSV1的样品，图4F为感染HCMV和HSV2的样品，图4G为感染HSV1和HSV2的样品，图4H为感染HCMV、HSV1和HSV2的样品。

图5A～图5D为检测引物组合物灵敏度的微流体芯片检测结果图，其中图5A为HCMV、HSV1和HSV2的拷贝数分别为1×10⁷、B297拷贝数为1×10⁴，图5B为HCMV、HSV1和HSV2的拷贝数分别为1×10⁴、B297拷贝数为1×10³，图5C为HCMV、HSV1和HSV2的拷贝数分别为1×10³、B297拷贝数为1×10²，图5D为HCMV、HSV1和HSV2的拷贝数分别为1×10²、B297拷贝数为1×10¹。

图6A和图6B为检测引物组合物特异性的微流体芯片检测结果图，其中图6A为阳性结果，其中HCMV、HSV1和HSV2的拷贝数分别为1×10⁸、B297拷贝数为1×10⁵，图8B为阴性结果。

图7A～图7C为检测引物组合物重复性的微流体芯片检测结果图，其中图7A为第一批次，图7B为第二批次，图7C为第三批次，且其中HCMV、HSV1和HSV2的拷贝数分别为1×10⁶、B299拷贝数为1×10⁵。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

实施例1：临床样本的制备

本实施例制备本发明检测方法所使用的人体宫颈组织样本DNA，具体详述如下。

1、提取试剂：

A液：细胞裂解液，15ml/瓶，每次用200μl。

成份终浓度

Tris-HCl(pH8.0) 0.01mol/l

NaCl 0.1mol/l

EDTA(pH8.0) 0.01mol/l

SDS 2％(g/ml)

B液：核酸结合液，25ml/瓶，每次用400μl。

成份终浓度

GuSCN 5mol/l

Tris-HCl(pH6.4) 0.05mol/l

EDTA(pH8.0) 0.02mol/l

TrtionX-100 2.5％(g/ml)

C液：核酸漂洗液，20ml/瓶，每次用300μl。

成份含量

GuSCN 5mol/l

Tris-HCl(pH6.4) 0.05mol/l

D液：核酸洗脱液，5ml/瓶，每次用50μl。

成份终浓度

Tris-HCl(pH8.0) 0.01mol/l

NaCl 0.1mol/l

EDTA(pH8.0) 0.01mol/l

2、提取方法：

1)取样：样本取自于20～50岁的女性子宫颈上皮细胞。对于被测者有皮损且有疣状体增生的患者，用生理盐水湿润的棉拭子，用力来回在疣体表面擦拭3次，以取得脱落细胞；对于无皮损的被测者则采集分泌物标本，要求患者在采样前2h不排尿，采样前用棉拭子将阴道或宫颈口过多的分泌物轻轻擦拭干净，更换用生理盐水湿润的棉拭子，紧贴阴道或宫颈口粘膜，稍用力转动2周，以取得脱落细胞。然后将棉拭子放入备有1ml无菌生理盐水的样本管中，充分漂洗，然后将棉拭子贴管壁挤干丢弃。

2)裂解：在1.5ml的离心管中加入步骤1)中采集的样本液1ml，5000转/分钟离心15分钟，去上清，在沉淀中加入A液200μL，混匀后于沸水中煮沸10～15分钟，直到A液变得澄清。

3)吸附：先在吸附柱中加入B液400μl，然后将裂解液缓慢倾倒入吸附柱中(若裂解15min后仍有杂质，勿将杂质倒入)。振荡混匀后放置2分钟，然后12000转/分钟离心2分钟。

4)漂洗：去废液，在吸附柱中加入C液300μl，12000转/分钟离心2分钟，去废液；再加入70％(V/V)的乙醇700μl，12000转/分钟离心2分钟去废液；最后以12000转/分钟离心2分钟，彻底去废液。

5)洗脱：换一个干净的1.5ml EP管，套住吸附柱，在吸附柱中央加入D液50μL，于56℃放置10分钟，12000转/分钟离心2分钟。流出液即为提取的DNA样品，可直接用于PCR反应。

实施例2：内参引物序列的确定

本实施例为采用根据人DNA保守序列β球蛋白特有基因设计的两对DNA扩增引物扩增实施例1所制备的DNA样品，并用凝胶电泳检测这两对引物的扩增效果，以筛选出内参引物。

1、单引物PCR扩增

1)在200μL Eppendorf管内配制25μl反应体系如下，其中提取的DNA样品分别为10份不同的细胞样本DNA：

成份体积(μl)

ddH₂O 18.3

5U/μl Taq酶 0.2

Taq酶10×buffer 2.5

10μM内参上、下游引物各0.5

2.5mM dNTP 2

提取的DNA样品 1

内参引物的具体序列如表1所示。

表1 PCR扩增内参引物序列

基因名称	片段长度	基因信息	引物信息方向5′→3′
				B297	297bp	NC_000007.13	上游：TGACAAGGCCATGAGGCTGGTGTA(SEQ ID NO：7)下游：GAGTCCATCACGATGCCAGTGGTA(SEQ ID NO：8)
B658	658bp	NC_000007.13	上游：CGCCCTTTCTCACTGGTTCTCTCT(SEQ ID NO：9)下游：CCTTAATGTCACGCACGATTTCCC(SEQ ID NO：10)

2)混合引物PCR扩增

在200μL Eppendorf管内配制25μl反应体系如下，其中提取的DNA样品为经过PCR鉴定含有病毒的细胞样本：

成份体积/μl

ddH₂O 17.0

5U/μl Taq酶 0.5

Taq酶10×buffer 2.5

10μM内参上、下游引物各 0.5

10μM三种病毒上、下游引物混合物各 0.5

2.5mM dNTP 2

提取的DNA样品 1

3)PCR条件：

第一阶段：94℃，2分钟；

第二阶段：94℃，20秒；54℃，30秒；72℃，45秒；35个循环；

第三阶段：72℃，5分钟。

2、琼脂糖凝胶电泳

1)制胶(2％琼脂糖凝胶)

称取琼脂糖0.8g于三角瓶中，加入50ml电泳缓冲液TAE(购自上海生工生物工程技术服务有限公司，规格为50×TAE，稀释50倍使用)，混匀后于微波炉上高火煮2分钟(TAE挥发约10ml)。取出后冷却到60℃以下，加入0.3μl核酸荧光染料Goldview(购自上海赛百盛基因技术有限公司，规格1ml/支)，混匀后倒入两端封闭的胶板中，插入电泳齿梳。待彻底冷却后，去掉两端的封闭，拔掉齿梳，将胶板放入电泳槽中，倒入适量的TAE溶液，以刚好浸没胶板为宜。

2)点样

取以上得到的PCR产物5μl，加入1μl 6×上样缓冲液(含溴酚蓝染料，购自北京全式金生物技术有限公司，规格1ml/支)，混匀后点入胶孔中。同时，点DNA marker(购自于北京金式全生物技术有限公司，产品代码MD101-01)2μl作为参照。

3)电泳

电泳条件：100V，100mA，25分钟。

4)拍照

电泳结束后，将胶板中的胶块取出，放在紫外仪下用透射光照射，同时用照相机拍照。对照DNA marker，看是否有相应的内参条带，其中B297引物扩增临床样本的电泳结果图如图1所示，而B658引物扩增临床样本的电泳结果图如图2所示。在图1和图2中，1、2、……、10分别为提取的10个不同细胞样本DNA的扩增结果；“-”为PCR扩增阴性对照。由图1和图2对比可知，B297引物能够扩增出10个样品的内参条带，而B658仅能扩增出4个样品的内参条带，说明单引物扩增临床样本时，B297引物扩增结果明显优于B658引物。因此，本发明确定内参引物采用B297引物，即如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

实施例3：用混合引物扩增DNA

本实施例为采用本发明所提供的DNA序列扩增实施例1所提取的DNA样品，并采用凝胶电泳检测PCR产物的正确性。

1、混合引物PCR扩增

1)在20μL Eppendorf管内配制25μl反应体系：

成份体积/μl

ddH₂O 10.3

2×buffer 12.5

混合引物 1.2

提取的临床样本DNA 1

注：2×buffer中含有Tris-HCl(pH 8.4)40mM，MgCl₂ 20mM，KCl 50mM，(NH)₂SO₄ 10Mm，每个dNTP 0.2mM，Taq DNA多聚酶0.08U/μL，引物组合物含有：B297上、下游引物各0.08μM，HCMV上、下游引物各0.32μM，HSV1上、下游引物各0.12μM，HSV1上、下游引物各0.6μM，各引物的具体序列如表2所示。

表2 PCR扩增的各引物序列

基因名称	选取长度	基因信息	引物信息方向5′→3′
				HCMV	211bp	AY446894.2	上游：ACAGCACCCGACAGAACTCACTT(SEQ ID NO：1)下游：CCTGATGATGATGAGATTATGGC(SEQ ID NO：2)
HSV1	469bp	E03113	上游：ATGGTGAACATCGACATGTACGG(SEQ ID NO：3)下游：CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC(SEQ ID NO：4)
				HSV2	391bp	EU281626	上游：ATGGTGAACATCGACATGTACGG(SEQ ID NO：5)下游：CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC(SEQ ID NO：6)
B297	297bp	NC_000007.13	上游：TGACAAGGCCATGAGGCTGGTGTA(SEQ ID NO：7)下游：GAGTCCATCACGATGCCAGTGGTA(SEQ ID NO：8)

2)PCR条件：

第一阶段94℃，5分钟；

第二阶段94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分钟；32个循环；

第三阶段72℃，10分钟。

2、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的正确性。

1)制胶(2％琼脂糖凝胶)

称取琼脂糖0.8g于三角瓶中，加入50ml电泳缓冲液TAE(购自上海生工生物工程技术服务有限公司，规格为50×TAE，稀释50倍使用)，混匀后于微波炉上高火煮2分钟(TAE挥发约10ml)。取出后冷却到60℃以下，加入0.3μl核酸染料Goldview(购自上海赛百盛基因技术有限公司，规格1ml/支)，混匀后倒入两端封闭的胶板中，插入电泳齿梳。待彻底冷却后，去掉两端的封闭，拔掉齿梳，将胶板放入电泳槽中，倒入适量的TAE溶液，以刚好浸没胶板为宜。

2)点样

取PCR产物6μl，加入1μl 6×上样缓冲液(含溴酚蓝染料，购自北京全式金生物技术有限公司，规格1ml/支)，混匀后点入胶孔中。同时，点DNA marker(购自北京全式金生物技术有限公司，规格100bp，50次)2μl作为参照。

3)电泳

电泳条件：100V，100mA，25分钟。

4)拍照

电泳结束后，将胶板中的胶块取出，放在紫外仪下用透射光照射，同时用照相机拍照。对照标准品，看是否有相应的病毒条带，其中未感染病毒的样品的电泳结果图如图3A所示，感染HCMV的样品的电泳结果图如图3B所示，感染HSV1的DNA样品的电泳结果图如图3C所示，感染HSV2的DNA样品的电泳结果图如图3D所示，感染HCMV和HSV1的DNA样品的电泳结果图如图3E所示，感染HCMV和HSV2的DNA样品的电泳结果图如图3F所示，感染HSV1和HSV2的DNA样品的电泳结果图如图3G所示，感染HCMV、HSV1和HSV2的DNA样品的电泳结果图如图3H所示。

实施例4：微流体芯片检测样本的方法

本实施例采用微流体芯片检测实施例3中所扩增出的DNA样品。微流体芯片检测样本具体包括以下操作步骤：

1)接通MS-CE-1型毛细管电泳仪(购自宁波美生医疗器材有限公司)电源，仪器预热30分钟。

2)连接检测池与主机箱正面输出接口，在缓冲溶液瓶中加入新配制好的缓冲溶液(2％HPMC-50，80mM MES，40mM Tris)，将电极和毛细管的两端浸在缓冲溶液中，保持毛细管两端出口在同一水平面上，且毛细管内必须充满缓冲溶液，关好仪器正门，确认仪器各部分连接正确后，按动高压启动按钮，如果发生异常应立即按动高压关断钮，检查并排除故障后，再重新加压。

3)电进样：用样品瓶更换样品支架上的缓冲溶液瓶，插入电极及毛细管，关好正门后施加380伏的电压，达到预定时间30秒后断开高压，换上缓冲溶液瓶后即可开始实验。

4)流体压差进样：将样品瓶放在高度差进样部件上，根据需要调整进样高度，然后把毛细管的进样端插入样品池中，待达到预定时间后取出放入有缓冲溶液的进样支架中即可开始实验。

5)根据实验需要设定仪器工作参数。其中进样电压为380v，电泳电压为700v。

6)等待仪器各部分工作正常后，将微流体芯片置于支架上，调节芯片位置，使检测光束通过距芯片进样点1cm处。运行进样及电泳程序，当DNA条带通过检测点时，其信息由数据采集系统记录下来，并转化为电信号，即开始样品的分析工作。

7)实验结束后关闭电源，用蒸馏水冲洗毛细管30分钟，或将缓冲溶液保持在毛细管中，即将毛细管置于压力清洗装置中。

按照上述方法检测实施例3中所扩增出的DNA样品，其中未感染病毒的样品的微流体芯片检测结果图如图4A所示，感染HCMV的DNA样品的微流体芯片检测结果图如图4B所示，感染HSV1的DNA样品的微流体芯片检测结果图如图4C所示，感染HSV2的DNA样品的微流体芯片检测结果图如图4D所示，感染HCMV和HSV1的DNA样品的微流体芯片检测结果图如图4E所示，感染HCMV和HSV2的DNA样品的微流体芯片检测结果图如图4F所示，感染HSV1和HSV2的DNA样品的微流体芯片检测结果图如图4G所示，感染HCMV、HSV1和HSV2的DNA样品的微流体芯片检测结果图如图4H所示。

实施例5：本发明的引物组合物的灵敏度、特异性和重复性

本实施例对本发明所提供引物组合物的灵敏度、特异性和重复性进行了检测。

1、引物组合物的灵敏度

参照实施例4中的方法对含有不同HCMV、HSV1、HSV2和B297拷贝数的质粒(质粒构建：委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，连接至PGH载体)进行稀释并扩增验证混合引物的灵敏度，所得到的微流体芯片检测结果见图5A～图5D。

由图可知，本发明提供的引物组合物能够检测出HCMV、HSV1、HSV2的最低拷贝数为1×10⁴。

2、引物组合物的特异性

参照实施例4中的方法对含有HCMV、HSV1、HSV2和B297的质粒进行稀释并扩增验证混合引物的特异性，具体结果如图6A和图6B所示，其中图6A为阳性结果，即用混合引物对4种质粒进行扩增，结果显示可全部扩增出来。图6B为阴性结果，即用混合引物对阴性对照(ddH2O)进行扩增，显示没有任何扩增条带。以上结果说明，混合引物的特异性良好。

由图可知，本发明提供的混合引物能够特异性的扩增出目标产物。

3、引物组合物的重复性

参照实施例4中的方法对含有HCMV、HSV1、HSV2和B297的质粒进行稀释并扩增不同批次以验证混合引物的重复性，具体结果如图7A、图7B和图7C所示。

由图可知，本发明提供的混合引物对不同的扩增均具有较好的重复性。

序列表

<110>宁波基内生物技术有限公司

<120>用于检测人巨细胞病毒和/或单纯疱疹病毒的引物、试剂盒及方法

<130>DIC09110171

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

acagcacccg acagaactca ctt 23

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cctgatgatg atgagattat ggc 23

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atggtgaaca tcgacatgta cgg 23

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cctcgcgttc gtcctcgtcc tcc 23

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

atggtgaaca tcgacatgta cgg 23

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cctccttgtc gaggccccga aac 23

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

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tgacaaggcc atgaggctgg tgta 24

<210>8

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gagtccatca cgatgccagt ggta 24

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cgccctttct cactggttct ctct 24

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ccttaatgtc acgcacgatt tccc 24

Claims

1.一种用于检测人巨细胞病毒的引物，该引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

2.一种用于检测人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型的引物组合物，该引物组合物包括用于检测单纯疱疹病毒1型的上游引物核酸序列SEQ ID NO：3、下游引物核酸序列SEQ ID NO：4、用于检测单纯疱疹病毒2型的上游引物核酸序列SEQ ID NO：5、下游引物核酸序列SEQ ID NO：6和权利要求1所述的引物，以及内参引物，该内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：7，下游引物核苷酸序列为SEQ IDNO：8。

3.根据权利要求1所述的引物在制备用于检测人巨细胞病毒的试剂盒中的用途。

4.根据权利要求2所述的引物组合物在制备用于检测人巨细胞病毒和单纯疱疹病毒的试剂盒中的用途。

5.一种用于检测人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型的试剂盒，该试剂盒包括权利要求2所述的引物组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括细胞裂解液、核酸结合液、核酸漂洗液、核酸洗脱液和PCR反应液。