CN102168149A

CN102168149A - 用于检测eb病毒的引物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN102168149A
Application number: CN2010101221944A
Authority: CN
Inventors: 倪剑锋; 赵珊珊; 杨文辉; 谢育媛; 邓其涛
Original assignee: GENEINN BIOTECHNOLOGY (NINGBO) CO Ltd
Current assignee: GENEINN BIOTECHNOLOGY (NINGBO) CO Ltd
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2011-08-31

Abstract

本发明提供一种用于检测EB病毒的引物、试剂盒及方法。其中该引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：2。本发明还提供了包括该引物的用于检测EB病毒的组合物、工具、试剂盒和方法。它们可以在基因水平上进行迅速的检测，灵敏度高和特异性号，具有节约时间、技术成熟及检测结果稳定的优点。

Description

用于检测EB病毒的引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及用于检测爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV，在此简称EB病毒)的引物、试剂盒及方法。

背景技术

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)属于γ疱疹病毒亚科的成员之一，是人类的一种特异性嗜淋巴细胞性疱疹病毒，一直被认为是人类某些严重疾病以及肿瘤的致病因子，与许多疾病的发生都有着密切的关系，威胁着人类的健康。EBV主要通过人类唾液传播，因此呼吸道是EBV潜伏的最大场所。调查结果显示，世界人口的90％以上都存在EBV的潜伏感染，或成为EBV携带者。更重要的是EBV感染与越来越多的人类恶性肿瘤有关，应用原位杂交证明了携带高拷贝EBV除了能转化淋巴细胞外，也能赋予肿瘤细胞一定的生长优势，使其成为优势细胞群，呈现转化特征。EBV引发了全球癌症的1％，并占所有感染性癌症的5.6％。根据国际癌症研究署对致癌因子的分类标准，EBV被列在第一组致癌因子中。

随着近几年癌症在全球的急剧蔓延，EBV感染的早期检测和预防成为当务之急。目前ELISA检测EBV各项抗体是临床诊断EBV感染的重要指标之一，但它实际上检测的是人体对EBV感染的免疫反应状态，无法检测病毒自身，也就无法准确灵敏地反映EBV感染的情况。由于鼻咽癌外周血循环的游离EBV-DNA的拷贝数随着全身化疗周期的进行而呈现动态变化，所以检测鼻咽癌患者EBV-DNA的表达水平对判断病灶残留、复发、转移、判断治疗的敏感性、综合治疗方案的及时更改、确认以及判断疗效、预后均具有重要的指导意义，EBV目前已经成为鼻咽癌诊治中重要的血清分子标志物，可以作为诊断和治疗中的一项参考依据。

目前国外已经上市的检测EBV-DNA的试剂盒有几种，检测的方法主要是荧光免疫杂交(HIGH)，国内检测EBV主要采用ELISA方法，未见有批准上市检测EBV-DNA的试剂盒。基于EBV感染情况如此严重，开发一种简单、易行、成本较低的检测方法就显得尤为重要。

发明内容

因此，本发明的一个目的在于提供一种用于检测EB病毒的引物或其组合物。

本发明的另一个目的在于提供上述引物或其组合物在制备用于检测EB病毒的工具中的用途。

本发明的另一个目的在于提供一种用于检测EB病毒的试剂盒。

本发明的又一个目的在于提供一种检测EB病毒的方法。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。

一方面，本发明提供一种用于检测EB病毒的引物，该引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明还提供了一种用于检测EB病毒的引物组合物，该引物组合物包括上述用于检测EB病毒的引物以及内参引物，该内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：3，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

另一方面，本发明提供了上述引物或引物组合物在制备用于检测EB病毒的工具中的用途。

另一方面，本发明提供了一种用于检测EB病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述用于检测EB病毒的引物或引物组合物。该试剂盒还可以包括细胞裂解液、核酸结合液、核酸漂洗液和核酸洗涤液和PCR反应液。

又一方面，本发明提供了一种检测EB病毒的方法，该方法包括以下步骤：1)提取样本DNA；2)使用上述引物、引物组合物或试剂盒对步骤1)得到的DNA进行PCR扩增；3)检测步骤2)得到的扩增产物。步骤1)中的样本优选为人的血液或体液。步骤3)中的检测方法优选为微流体芯片检测法。

在本发明的一个优选实施方案中，通过对患者血液中的DNA进行EBV检测，从而判断患者是否感染了EBV，具体包括以下步骤：

1)提取人临床样本的DNA。

2)将EBV特异性引物和人DNA保守序列特有基因的特异性引物混合，对被测样本的DNA进行多重PCR扩增，被扩增的目标基因片段大小各不相同。

3)扩增产物通过微流体芯片进行检测。

4)通过各检测峰的位置确定检测到的片段的大小，从而判断被检测到的基因，鉴别临床样本感染的病毒类别。

5)结果判断：a)未出现任何特异性峰，说明临床样本的DNA没有提取出来，检测无效；b)只出现DNA内参特异性峰，说明没有EBV感染；c)出现DNA内参和EBV特异性峰，说明有EBV感染。

本发明所提供的新型引物、引物组合物、试剂盒及方法，能够对EBV进行DNA水平上的检查，灵敏度更高，效率也相应提高。此外，它们操作简单，成本较低，适宜于推广应用。具体地，本发明具有以下有益效果：

首先，本发明提供了一种用于检测EB病毒的引物，其可特异性的扩增出EBV的保守序列BamH1-W片段(genbank登录号为M15973.1)。该BamH1-W片段在一个EB病毒拷贝中约重复10～11次，在不同的EB病毒株之间高度保守，选择其作为扩增的目的基因可提高检测的敏感性。因此，本发明人在该BamH1-W中选取了一段基因序列并设计了一对特异性引物，即SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

其次，本发明提供了一种用于检测EB病毒的引物组合物，其为EBV的保守序列BamH1-W片段的特异性引物和人DNA保守序列β球蛋白(β-globin)特有基因B297(NCBI查询号NC_000007.13)的特异性引物的组合。由于人体细胞中都含有B297基因，因此引入该基因可以确定模板的提取质量，避免扩增结果的假阴性。实验表明：通过PCR反应，本发明设计的内参引物较之其它根据人β球蛋白(β-globin)基因设计的引物能够更快速有效地识别人体DNA，并且扩增出的目的基因片段长度为297bp，能够很好的区别于EBV的片段长度，有利于后续的检测。

相应地，本发明提供了用于检测EB病毒的工具、试剂盒和方法，其中均采用了EBV保守序列BamH1-W片段的特异性引物，或者EBV保守序列BamH1-W片段的特异性引物和人DNA保守序列特有基因B297的特异性引物的组合，是一种具有较好灵敏度和特异性的检测EB病毒的工具或方法。

本发明可以在基因水平上进行迅速判断，具有较好的灵敏度。试剂盒能够检测出EB病毒的最低拷贝数为6×10³。本发明能够对患者的临床样本例如血液、体液等进行检测，不需要对样本进行培养后再对病毒株进行检测，节约了时间。同时，微流体芯片检测法比传统的DNA电泳检测法更简单、快捷、直观，为临床用药提供了准确、及时的指导。本发明所提供的技术成熟，虽然其检测结果的灵敏度和准确性与传统的凝胶法相同，但是该检测过程更快捷，检测结果更容易判断，将生物芯片技术应用于EB病毒检测也是新的发展趋势。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明实施例2中单独使用B297引物扩增DNA样品的电泳结果图；

图2为本发明实施例2中单独使用B658引物扩增DNA样品的电泳结果图；

图3为本发明实施例2中使用B297引物和EBV引物扩增临床样本(含EB)的电泳结果图。

图4为本发明实施例2中使用B658引物和EBV引物扩增临床样本(含EB)的电泳结果图。

图5为本发明实施例3中未感染EBV的DNA样品的电泳结果图。

图6为本发明实施例3中感染EBV的DNA样品的电泳结果图。

图7为本发明实施例4中未感染EBV的DNA样品的微流体芯片检测结果图。

图8为本发明实施例4中感染EBV的DNA样品的微流体芯片检测结果图。

图9A为本发明实施例4中对DNA样品的B297基因测序后的比对结果。

图9B为本发明实施例4中对DNA样品的EBV基因测序后的比对结果。

图10A～图10F为本发明提供的检测试剂盒灵敏度的微流体芯片检测结果图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器、设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

实施例1：DNA样品的制备

本实施例采用人体血液样本制备本发明检测方法所使用的DNA样品，具体详述如下。

1、提取试剂：

A液：细胞裂解液，15ml/瓶，每次用200μl。

成份终浓度

Tris-HCl(pH8.0) 0.01mol/l

NaCl 0.1mol/l

EDTA(pH8.0) 0.01mol/l

SDS 2％(g/ml)

B液：核酸结合液，25ml/瓶，每次用400μl。

成份终浓度

GuSCN 5mol/l

Tris-HCl(pH6.4) 0.05mol/l

EDTA(pH8.0) 0.02mol/l

TrtionX-100 2.5％(g/ml)

C液：核酸漂洗液，20ml/瓶，每次用300μl。

成份含量

GuSCN 5mol/l

Tris-HCl(pH6.4) 0.05mol/l

D：核酸洗脱液，5ml/瓶，每次用50μl。

成份终浓度

Tris-HCl(pH8.0) 0.01mol/l

NaCl 0.1mol/l

EDTA(pH8.0) 0.01mol/l

E：20mg/ml蛋白酶K，1.2ml/管，每次使用20μl。

2、提取方法：

1)取样：将加入EDTA抗凝剂的血液样本解冻，混合均匀后取100μl于1.5ml的EP管内。

2)裂解：加入A液200μl和蛋白酶K 20μl，混匀后于56℃放置10分钟(每隔2分钟混匀一次，确保裂解充分)。

3)吸附：先在吸附柱中加入B液400μl，然后将裂解液缓慢的倾倒入吸附柱中。振荡混匀后放置2分钟，然后12000转/分钟离心2分钟。

4)漂洗：去废液，在吸附柱中加入C液300μl，12000转/分钟离心2分钟，去废液；再加入70％(V/V)的乙醇700μl，12000转/分钟离心2分钟去废液；最后再12000转/分钟离心2分钟，彻底去废液。

5)洗脱：换一个干净的1.5ml EP管，套住吸附柱，在吸附柱中央加入D液50μL，于56℃放置10分钟，12000转/分钟离心2分钟。流出液即为提取的DNA样品，可直接用于PCR反应。

实施例2：内参引物序列的确定

本实施例采用根据人DNA保守序列β球蛋白特有基因设计的两对DNA扩增引物扩增实施例1所制备的DNA样品，并用凝胶电泳检测这两对引物的扩增效果，以筛选出内参引物。

1、单引物PCR扩增

1)在200μL Eppendorf管内配制25μl反应体系如下，其中提取的DNA样品分别为10份不同的血样DNA：

成份体积/μl

ddH₂O 18.3

5U/μl Taq酶 0.2

Taq酶10×buffer 2.5

10μM内参上、下游引物各0.5

2.5mM dNTP 2

提取的DNA样品 1

内参引物的具体序列如表1所示。

表1 PCR扩增内参引物序列

基因名称	片段长度	基因信息	引物信息方向5′→3′
				B297	297bp	NC_000007.13	上游：TGACAAGGCCATGAGGCTGGTGTA(SEQ ID NO：3)下游：GAGTCCATCACGATGCCAGTGGTA(SEQ ID NO：4)
B658	658bp	NC_000007.13	上游：CGCCCTTTCTCACTGGTTCTCTCT(SEQ ID NO：5)下游：CCTTAATGTCACGCACGATTTCCC(SEQ ID NO：6)

2)混合引物PCR扩增

在200μL Eppendorf管内配制25μl反应体系如下，其中提取的DNA样品为经过PCR鉴定含有EB病毒的血液样本：

成份体积/μl

ddH₂O 17.0

5U/μl Taq酶 0.5

Taq酶10×buffer 2.5

10μM内参上、下游引物各0.5

10μM EB上、下游引物各0.5

2.5mM dNTP 2

提取的DNA样品 1

其中所述EB上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示。

3)PCR条件：

第一阶段：94℃，2分钟；

第二阶段：94℃，20秒；54℃，30秒；72℃，45秒；35个循环；

第三阶段：72℃，5分钟。

2、琼脂糖凝胶电泳

1)制胶(2％琼脂糖凝胶)

称取琼脂糖0.8g于三角瓶中，加入50ml电泳缓冲液TAE(购自上海生物工程技术服务有限公司，规格为50×TAE，稀释50倍使用)，混匀后于微波炉上高火煮2分钟(TAE挥发约10ml)。取出后冷却到60℃以下，加入0.3μl核酸荧光染料Goldview(购自上海赛百盛基因技术有限公司，规格1ml/支)，混匀后倒入两端封闭的胶板中，插入电泳齿梳。待彻底冷却后，去掉两端的封闭，拔掉齿梳，将胶板放入电泳槽中，倒入适量的TAE溶液，以刚好浸没胶板为宜。

2)点样

取以上得到的PCR产物5μl，加入1μl 6×上样缓冲液(含溴酚蓝染料，购自北京全式金生物技术有限公司，规格1ml/支)，混匀后点入胶孔中。同时，点DNA marker(购自于北京金式全生物技术有限公司，产品代码MD101-01)2μl作为参照。

3)电泳

电泳条件：100V，100mA，25分钟。

4)拍照

电泳结束后，将胶板中的胶块取出，放在紫外仪下用透射光照射，同时用照相机拍照。对照DNA marker，看是否有相应的内参条带，其中B297引物扩增临床样本的电泳结果图如图1所示，而B658引物扩增临床样本的电泳结果图如图2所示，B297引物和EB引物扩增临床样本(含EB)的电泳结果图如图3所示，B658引物和EB引物扩增临床样本(含EB)的电泳结果图如图4所示。在图1和图2中，1、2、……、10分别为提取的10个不同血液样本DNA扩增结果；“-”为PCR扩增阴性对照。由图1和图2对比可知，B297引物能够扩增出10个样品的内参条带，而B658仅能扩增出4个样品的内参条带，说明单引物扩增临床样本时，B297引物扩增结果明显优于B658引物；通过图3和图4对比可知，B297引物和EB引物可以扩增出2条目的条带，而B658引物和EB混合引物只能扩增出EB目标条带，而无法扩增出内参条带。因此，本发明确定内参引物采用B297引物，对应于SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

实施例3：采用引物混合物扩增DNA

本实施例采用本发明所提供的引物组合物扩增实施例1所提取的DNA样品，并采用凝胶电泳检测PCR产物的正确性。

1、混合引物PCR扩增

a)在200μL Eppendorf管内配制25μl反应体系：

成份体积(μl)

ddH₂O 10.3

2×buffer 12.5

引物组合物 1.2

提取的临床样本DNA 1

注：2×buffer中含有Tris-HCl(pH 8.4)40mM，MgCl₂ 20mM，KCl 50mM，(NH)₂SO₄ 10mM，每个dNTP 0.2mM，Taq DNA多聚酶0.08U/μL，引物组合物含有：B297上、下游引物各0.2μM，EBV上、下游引物各0.4μM。各引物的具体序列如表2所示。

表2 PCR扩增的引物组合物的序列

基因名称	选取长度	基因信息	引物信息
				EBV	200bp	EBV BamH1-W片段	F1：5’-TTCTGCTAAGCCCAACACTC-3’(SEQ ID NO：1)R1：5’-CTGAAGGTGAACCGCTTA-3’(SEQ ID NO：2)
B297	297bp	NC_000007.13	F2：5’-TGACAAGGCCATGAGGCTGGTGTA-3’(SEQ ID NO：3)R2：5’-GAGTCCATCACGATGCCAGTGGTA-3’(SEQ ID NO：4)

b)PCR条件：

第一阶段：94℃，2分钟；

第二阶段：94℃，30s；60℃，30s；72℃，1分钟；32个循环；

第三阶段：72℃，5分钟。

2、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的正确性(采用的试剂来源同实施例2)

a)制胶(2％琼脂糖凝胶)

称取琼脂糖0.8g于三角瓶中，加入50ml电泳缓冲液TAE，混匀后于微波炉上高火煮2分钟(TAE挥发约10ml)。取出后冷却到60℃以下，加入0.3μl核酸染料Goldview，混匀后倒入两端封闭的胶板中，插入电泳齿梳。待彻底冷却后，去掉两端的封闭，拔掉齿梳，将胶板放入电泳槽中，倒入适量的TAE溶液，以刚好浸没胶板为宜。

b)点样

取以上得到的PCR产物6μl，加入1μl 6×上样缓冲液，混匀后点入胶孔中。同时，点DNA marker 5μl作为参照。

c)电泳

电泳条件：100V，100mA，25分钟。

d)拍照

电泳结束后，将胶板中的胶块取出，放在紫外仪下用透射光照射，同时用照相机拍照。对照标准品，看是否有相应的病毒条带，其中未感染EBV的DNA样品的电泳结果图如图5所示，感染EBV的DNA样品的电泳结果图如图6所示。在图5和图6中，1为DNA样品，2为DNA marker，3为未加入DNA样品的阴性对照。

实施例4：微流体芯片检测样本的方法

本实施例采用微流体芯片检测实施例3中所扩增出的DNA样品。微流体芯片检测样本具体包括以下操作步骤：

1)接通MS-CE-1型毛细管电泳仪(购自宁波美生医疗器材有限公司)电源，预热30分钟。

2)连接检测池与主机箱正面输出接口，在缓冲溶液瓶中加入新配制好的缓冲溶液(含有2％HPMC-50，80mM MES和40mM Tris)，将电极和毛细管的两端浸在缓冲溶液中，保持毛细管两端出口在同一水平面上，且毛细管内必须充满缓冲溶液，关好仪器正门，确认仪器各部分连接正确后，按动高压启动按钮，如果发生异常应立即按动高压关断钮，检查并排除故障后，再重新加压。

3)电进样：用样品瓶更换样品支架上的缓冲溶液瓶，插入电极及毛细管，关好正门后施加所需的电压380伏，待达到预定时间30秒后断开高压，换上缓冲溶液瓶后即可开始实验。

4)流体压差进样：将样品瓶放在高度差进样部件上，根据需要调整进样高度，然后把毛细管的进样端插入样品池中，待达到预定时间后取出放入有缓冲溶液的进样支架中即可开始实验。

5)根据实验需要设定仪器工作参数：进样电压为380v，电泳电压为700v。

6)等待仪器各部分工作正常后，即可开始样品的分析工作，具体如下：将微流体芯片置于支架上，调节芯片位置，使检测光速通过距芯片进样点1cm处，运行进样及电泳程序，当DNA条带通过检测点时，其信息由数据采集系统记录下来，并转化为电信号。

7)实验结束后关闭电源，用蒸馏水冲洗毛细管30分钟，或将缓冲溶液保持在毛细管中即将毛细管置于压力清洗装置中。

按照上述方法检测实施例3中所扩增出的DNA样品，其中未感染EBV的样品的微流体芯片检测结果图如图7所示，感染EBV的样品的微流体芯片检测结果图如图8所示。委托Invitrogen上海分公司对图6中所示感染EBV的样品进行测序比对，结果如图9A和图9B所示，其中图9A为内参基因B297测序后的比对结果，图9B为感染EBV基因测序后的比对结果。通过比对可知，该临床样本确实感染了EB病毒。

实施例5：本发明的引物组合物的检测灵敏度

本实施例对本发明所提供引物组合物的灵敏度进行了检测。

参照实施例4中的方法对含有不同EB病毒拷贝数的质粒(构建方法如下：用EB引物扩增临床样本，得到目标片段后，纯化测序，测序结果显示：扩增序列为目标EB病毒片段，将该段序列连接至载体PGH，构成了含有该段EB序列的质粒。)进行稀释并扩增验证引物组合物的灵敏度，所得到的微流体芯片检测结果见图10A～图10F。由图可知，本发明提供的混合引物能够检测出EB病毒的最低拷贝数为6×10³。

序列表

<110>宁波基内生物技术有限公司

<120>用于检测EB病毒的引物、试剂盒及方法

<130>DIC09110172

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ttctgctaag cccaacactc 20

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ctgaaggtga accgctta 18

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tgacaaggcc atgaggctgg tgta 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gagtccatca cgatgccagt ggta 24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cgccctttct cactggttct ctct 24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ccttaatgtc acgcacgatt tccc 24

Claims

1.一种用于检测EB病毒的引物，该引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

2.一种用于检测EB病毒的引物组合物，该引物组合物包括根据权利要求1所述的引物和内参引物，该内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQID NO：3，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

3.根据权利要求1所述的引物或权利要求2所述的引物组合物在制备用于检测EB病毒的工具中的用途。

4.一种用于检测EB病毒的试剂盒，该试剂盒包括根据权利要求1所述的引物或权利要求2所述的引物组合物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括细胞裂解液、核酸结合液、核酸漂洗液、核酸洗脱液和PCR反应液。

6.一种检测EB病毒的方法，该方法包括以下步骤：

1)提取样本DNA；

2)使用根据权利要求1所述的引物、权利要求2所述的引物组合物、或者权利要求3或4所述的试剂盒对步骤1)得到的DNA进行PCR扩增；

3)检测步骤2)得到的扩增产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述步骤1)中的样本为人的血液或体液。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，其中所述步骤3)中的检测方法为微流体芯片检测法。