CN111549179A - 一种检测血液eb病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测血液EB病毒的方法，按照先后顺序依次包括以下步骤：步骤一：样本DNA的获取，去新鲜血液，然后依次细胞裂解和DNA的提取，步骤二：PCR试剂的配置，步骤三：目的条带扩增，步骤四：目的DNA的纯化和转化。该检测血液EB病毒的方法采用本发明的引物能够快速、准确的检测出EB病毒，可以高效的扩增出目的基因，具有很高的特异性和准确定，其扩增效率优于其他引物，采用本发明的方法将极大地提高EB病毒的检出效率，为临床检测EB病毒提供一种可靠方法。

Description

一种检测血液EB病毒的方法
技术领域
本发明属于生物病毒检测技术领域，具体涉及一种检测血液EB病毒的方法。
背景技术
EB病毒(epstein-barr virus,EBv)，又称人类疱疹病毒4型(Humanherpesvirus4(HHV-4))。EB病毒的形态与其他疱疹病毒相似，圆形、直径180nm，基本结构含核样物、衣壳和囊膜三部分。核样物为直径45nm的致密物，主要含双股线性DNA，其长度随不同毒株而异平均为17.5×104bp分子量108。衣壳为20面体立体对称，由162个壳微粒组成。囊膜由感染细胞的核膜组成，其上有病毒编码的膜糖蛋白，有识别淋巴细胞上的EB病毒受体，及与细胞融合等功能。此外在囊膜与衣壳之间还有一层蛋白被膜。EB病毒是Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，认为该病毒是多种恶性肿瘤的病因之一，它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。在中国南方鼻咽癌患病人群中大多都检测到有EB病毒基因组存在。本病分布广泛，多呈散发性，亦可引起流行。病毒携带者和病人是本病的传染源。经口密切接触为主要传播途径，飞沫传播虽有可能，但并不重要。发病以15-30岁的年龄组为多，6岁以下多呈不显性感染。全年均有发病，似以晚秋初冬为多。一次得病后可获较持久的免疫力。
目前临床针对病毒的检测方法主要是分离培养和血清学诊断。这些检测方法繁琐，检测时间长，灵敏度低，容易发生漏检和错检，无法满足快速检测的要求。所以我们需要一款新型的检测血液EB病毒的方法来解决上述问题，满足人们的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测血液EB病毒的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测血液EB病毒的方法，按照先后顺序依次包括以下步骤：
步骤一：样本DNA的获取：去新鲜血液，然后依次细胞裂解和DNA的提取；
步骤二：PCR试剂的配置：共有阳性对照、样本和阴性对照三管，每个管中的反应体系均为20ul，其中包括DNA聚合酶(2×Taq Mix)10-14μL、引物序列F 2μL、引物序列R 2μL、样本DNA 2μL、加入ddH2O补至20ul，引物序列为：
F：5’-GCGAGAGGTAATGATTACGC-3’；
R：3’-GTCGTGTTCCCTCACCAGGG-5’；
步骤三：目的条带扩增：将上述步骤中的试剂放置到PCR仪中进行扩增，从而获得目的条带，其中反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，3s；55℃，45s；72℃，30s，循环次数为30次；72℃，10min；
步骤四：目的DNA的纯化和转化：对上述PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，利用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化目的基因，并通过转化后进行测序，从而检测血液的DNA中是否有EB病毒。
优选的，所述步骤一中细胞裂解具体操作为：
在1.5ml EP管中分别加入30-40μL的新鲜ACD抗凝血样；
在每个EP管中加入700μL细胞裂解液，充分混匀10min；
加入30μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K，振荡10min；
55℃，220rpm，水浴振荡过夜消化。
优选的，所述步骤一中DNA的提取具体操作为：
将消化后的血液加入600μL的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μL上清液至干净的离心管中；
加入600μL的酚仿，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μL上清液至干净的离心管中；
加入600μL的氯仿异戊醇，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取300μL上清液至干净的离心管中；
加入1000μL的无水乙醇，轻摇离心管，待有白色絮状沉淀出现停止摇动；
用枪头小心将DNA沉淀挑出，置于盛有300μL 70％乙醇的离心管中洗涤，8000rpm，离心3-5min，弃上清；
将乙醇倒干净，然后室温晾0.5-1h；
加入50μL TE缓冲液，溶解DNA，放置到-20℃保存。
优选的，所述阳性对照管中样本DNA为EB病毒的DNA。
优选的，所述阴性对照管中样本DNA为ddH2O。
本发明的技术效果和优点：该检测血液EB病毒的方法采用本发明的引物能够快速、准确的检测出EB病毒，可以高效的扩增出目的基因，具有很高的特异性、准确定和灵敏度，其扩增效率优于其他引物，采用本发明的方法将极大地提高EB病毒的检出效率，为临床检测EB病毒提供一种可靠方法。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种检测血液EB病毒的方法，按照先后顺序依次包括以下步骤：
步骤一：样本DNA的获取：去新鲜血液，然后依次细胞裂解和DNA的提取；
步骤二：PCR试剂的配置：共有阳性对照、样本和阴性对照三管，每个管中的反应体系均为20ul，其中包括DNA聚合酶(2×Taq Mix)10μL、引物序列F 2μL、引物序列R 2μL、样本DNA 2μL、加入ddH2O补至20ul，引物序列为：
F：5’-GCGAGAGGTAATGATTACGC-3’；
R：3’-GTCGTGTTCCCTCACCAGGG-5’；
扩增出DNA的长度为200bp；
步骤三：目的条带扩增：将上述步骤中的试剂放置到PCR仪中进行扩增，从而获得目的条带，其中反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，3s；55℃，45s；72℃，30s，循环次数为30次；72℃，10min；
步骤四：目的DNA的纯化和转化：对上述PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，利用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化目的基因，并通过转化后进行测序，从而检测血液的DNA中是否有EB病毒。
优选的，所述步骤一中细胞裂解具体操作为：
在1.5ml EP管中分别加入30-40μL的新鲜ACD抗凝血样；
在每个EP管中加入700μL细胞裂解液，充分混匀10min；
加入30μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K，振荡10min；
55℃，220rpm，水浴振荡过夜消化。
优选的，所述步骤一中DNA的提取具体操作为：
将消化后的血液加入600μL的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μL上清液至干净的离心管中；
加入600μL的酚仿，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μL上清液至干净的离心管中；
加入600μL的氯仿异戊醇，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取300μL上清液至干净的离心管中；
加入1000μL的无水乙醇，轻摇离心管，待有白色絮状沉淀出现停止摇动；
用枪头小心将DNA沉淀挑出，置于盛有300μL 70％乙醇的离心管中洗涤，8000rpm，离心3-5min，弃上清；
将乙醇倒干净，然后室温晾0.5-1h；
加入50μL TE缓冲液，溶解DNA，放置到-20℃保存。
优选的，所述阳性对照管中样本DNA为EB病毒的DNA。
优选的，所述阴性对照管中样本DNA为ddH2O。
实施例二
一种检测血液EB病毒的方法，按照先后顺序依次包括以下步骤：
步骤一：样本DNA的获取：去新鲜血液，然后依次细胞裂解和DNA的提取；
步骤二：PCR试剂的配置：共有阳性对照、样本和阴性对照三管，每个管中的反应体系均为20ul，其中包括DNA聚合酶(2×Taq Mix)12μL、引物序列F 2μL、引物序列R 2μL、样本DNA 2μL、加入ddH2O补至20ul，引物序列为：
F：5’-GCGAGAGGTAATGATTACGC-3’；
R：3’-GTCGTGTTCCCTCACCAGGG-5’；
扩增出DNA的长度为200bp；
步骤三：目的条带扩增：将上述步骤中的试剂放置到PCR仪中进行扩增，从而获得目的条带，其中反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，3s；55℃，45s；72℃，30s，循环次数为30次；72℃，10min；
步骤四：目的DNA的纯化和转化：对上述PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，利用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化目的基因，并通过转化后进行测序，从而检测血液的DNA中是否有EB病毒。
优选的，所述步骤一中细胞裂解具体操作为：
在1.5ml EP管中分别加入30-40μL的新鲜ACD抗凝血样；
在每个EP管中加入700μL细胞裂解液，充分混匀10min；
加入30μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K，振荡10min；
55℃，220rpm，水浴振荡过夜消化。
优选的，所述步骤一中DNA的提取具体操作为：
将消化后的血液加入600μL的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μL上清液至干净的离心管中；
加入600μL的酚仿，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μL上清液至干净的离心管中；
加入600μL的氯仿异戊醇，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取300μL上清液至干净的离心管中；
加入1000μL的无水乙醇，轻摇离心管，待有白色絮状沉淀出现停止摇动；
用枪头小心将DNA沉淀挑出，置于盛有300μL 70％乙醇的离心管中洗涤，8000rpm，离心3-5min，弃上清；
将乙醇倒干净，然后室温晾0.5-1h；
加入50μL TE缓冲液，溶解DNA，放置到-20℃保存。
优选的，所述阳性对照管中样本DNA为EB病毒的DNA。
优选的，所述阴性对照管中样本DNA为ddH2O。
实施例三
一种检测血液EB病毒的方法，按照先后顺序依次包括以下步骤：
步骤一：样本DNA的获取：去新鲜血液，然后依次细胞裂解和DNA的提取；
步骤二：PCR试剂的配置：共有阳性对照、样本和阴性对照三管，每个管中的反应体系均为20ul，其中包括DNA聚合酶(2×Taq Mix)13μL、引物序列F 2μL、引物序列R 2μL、样本DNA 2μL、加入ddH2O补至20ul，引物序列为：
F：5’-GCGAGAGGTAATGATTACGC-3’；
R：3’-GTCGTGTTCCCTCACCAGGG-5’；
扩增出DNA的长度为200bp；
步骤三：目的条带扩增：将上述步骤中的试剂放置到PCR仪中进行扩增，从而获得目的条带，其中反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，3s；55℃，45s；72℃，30s，循环次数为30次；72℃，10min；
步骤四：目的DNA的纯化和转化：对上述PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，利用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化目的基因，并通过转化后进行测序，从而检测血液的DNA中是否有EB病毒。
优选的，所述步骤一中细胞裂解具体操作为：
在1.5ml EP管中分别加入30-40μL的新鲜ACD抗凝血样；
在每个EP管中加入700μL细胞裂解液，充分混匀10min；
加入30μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K，振荡10min；
55℃，220rpm，水浴振荡过夜消化。
优选的，所述步骤一中DNA的提取具体操作为：
将消化后的血液加入600μL的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μL上清液至干净的离心管中；
加入600μL的酚仿，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μL上清液至干净的离心管中；
加入600μL的氯仿异戊醇，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取300μL上清液至干净的离心管中；
加入1000μL的无水乙醇，轻摇离心管，待有白色絮状沉淀出现停止摇动；
用枪头小心将DNA沉淀挑出，置于盛有300μL 70％乙醇的离心管中洗涤，8000rpm，离心3-5min，弃上清；
将乙醇倒干净，然后室温晾0.5-1h；
加入50μL TE缓冲液，溶解DNA，放置到-20℃保存。
优选的，所述阳性对照管中样本DNA为EB病毒的DNA。
优选的，所述阴性对照管中样本DNA为ddH2O。
实施例四：
一种检测血液EB病毒的方法，按照先后顺序依次包括以下步骤：
步骤一：样本DNA的获取：去新鲜血液，然后依次细胞裂解和DNA的提取；
步骤二：PCR试剂的配置：共有阳性对照、样本和阴性对照三管，每个管中的反应体系均为20ul，其中包括DNA聚合酶(2×Taq Mix)14μL、引物序列F 2μL、引物序列R 2μL、样本DNA 2μL，引物序列为：
F：5’-GCGAGAGGTAATGATTACGC-3’；
R：3’-GTCGTGTTCCCTCACCAGGG-5’；
扩增出DNA的长度为200bp；
步骤三：目的条带扩增：将上述步骤中的试剂放置到PCR仪中进行扩增，从而获得目的条带，其中反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，3s；55℃，45s；72℃，30s，循环次数为30次；72℃，10min；
步骤四：目的DNA的纯化和转化：对上述PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，利用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化目的基因，并通过转化后进行测序，从而检测血液的DNA中是否有EB病毒。
优选的，所述步骤一中细胞裂解具体操作为：
在1.5ml EP管中分别加入30-40μL的新鲜ACD抗凝血样；
在每个EP管中加入700μL细胞裂解液，充分混匀10min；
加入30μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K，振荡10min；
55℃，220rpm，水浴振荡过夜消化。
优选的，所述步骤一中DNA的提取具体操作为：
将消化后的血液加入600μL的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μL上清液至干净的离心管中；
加入600μL的酚仿，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μL上清液至干净的离心管中；
加入600μL的氯仿异戊醇，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取300μL上清液至干净的离心管中；
加入1000μL的无水乙醇，轻摇离心管，待有白色絮状沉淀出现停止摇动；
用枪头小心将DNA沉淀挑出，置于盛有300μL 70％乙醇的离心管中洗涤，8000rpm，离心3-5min，弃上清；
将乙醇倒干净，然后室温晾0.5-1h；
加入50μL TE缓冲液，溶解DNA，放置到-20℃保存。
优选的，所述阳性对照管中样本DNA为EB病毒的DNA。
优选的，所述阴性对照管中样本DNA为ddH2O。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种检测血液EB病毒的方法，其特征在于：按照先后顺序依次包括以下步骤：
步骤一：样本DNA的获取：去新鲜血液，然后依次细胞裂解和DNA的提取；
步骤二：PCR试剂的配置：共有阳性对照、样本和阴性对照三管，每个管中的反应体系均为20ul，其中包括DNA聚合酶(2×Taq Mix)10-14μL、引物序列F 2μL、引物序列R 2μL、样本DNA 2μL、加入ddH2O补至20ul，引物序列为：
F：5’-GCGAGAGGTAATGATTACGC-3’；
R：3’-GTCGTGTTCCCTCACCAGGG-5’；
步骤三：目的条带扩增：将上述步骤中的试剂放置到PCR仪中进行扩增，从而获得目的条带，其中反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，3s；55℃，45s；72℃，30s，循环次数为30次；72℃，10min；
步骤四：目的DNA的纯化和转化：对上述PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，利用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化目的基因，并通过转化后进行测序，从而检测血液的DNA中是否有EB病毒。
2.根据权利要求1所述的一种检测血液EB病毒的方法，其特征在于：所述步骤一中细胞裂解具体操作为：
在1.5ml EP管中分别加入30-40μL的新鲜ACD抗凝血样；
在每个EP管中加入700μL细胞裂解液，充分混匀10min；
加入30μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K，振荡10min；
55℃，220rpm，水浴振荡过夜消化。
3.根据权利要求1所述的一种检测血液EB病毒的方法，其特征在于：所述步骤一中DNA的提取具体操作为：
将消化后的血液加入600μL的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μL上清液至干净的离心管中；
加入600μL的酚仿，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μL上清液至干净的离心管中；
加入600μL的氯仿异戊醇，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取300μL上清液至干净的离心管中；
加入1000μL的无水乙醇，轻摇离心管，待有白色絮状沉淀出现停止摇动；
用枪头小心将DNA沉淀挑出，置于盛有300μL 70％乙醇的离心管中洗涤，8000rpm，离心3-5min，弃上清；
将乙醇倒干净，然后室温晾0.5-1h；
加入50μL TE缓冲液，溶解DNA，放置到-20℃保存。
4.根据权利要求1所述的一种检测血液EB病毒的方法，其特征在于：所述阳性对照管中样本DNA为EB病毒的DNA。
5.根据权利要求1所述的一种检测血液EB病毒的方法，其特征在于：所述阴性对照管中样本DNA为ddH2O。
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Title
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