CN104726613A - 一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒，含有特异性引物，其中上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；特异性探针的序列如SEQ ID NO：3所示，特异性探针的荧光物质为FAM，淬灭物质为TAMRA。本发明还提供了采用上述的试剂盒检测猫传染性鼻气管炎病毒的方法。本发明的引物及探针针对猫传染性鼻气管病毒DNA的样品可发生特异性扩增，而对没有猫传染性鼻气管病毒DNA的样品不发生特异性扩增，因而所述引物和探针可良好地应用于检测猫传染性鼻气管病毒，并且具有良好的再现性、特异性好、灵敏度高、时间短。

Description

一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种病毒的检测试剂盒，特别是一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒及方法。
背景技术
虽然Crandell和Maurer在1958年就从美国患呼吸道疾病的仔猫体中分离到猫传染性鼻气管炎病毒(FHV-1)，但是国内却没有从猫体内分离到FHV-1的报道，只有1例2014年在华南虎体内分离到虎源性FHV-1的报道，所以对于了解国内该病毒的感染现状、病原特性及与疫苗毒的基因差异尤为重要。近几年，随着人们生活水平的提高，猫和犬一样已逐渐成为人民的生活伴侣和精神慰藉的重要载体，宠物猫在上海宠物市场已占有相当大的比例，而且这种比例呈逐年增长的趋势，所以猫的传染性疾病已引起相当的重视，而FHV-1引起的猫的呼吸道疾病已成为宠物猫重要的传染病之一，其引起的城市公共安全问题也日益凸显。目前，很多城市小区的流浪猫很多，且繁殖能力强，极易造成病毒的自循环，使流浪猫成为病毒库和传染源，因此应当加强该病的研究和防控，防止其成为家庭宠物和观赏类猫科动物的致命杀手。
目前，对于该病的病原学检测市场上还没有成熟的检测试剂盒和荧光定量PCR方法，所以迫切需要建立一种猫传染性鼻气管炎病毒检测试剂盒及其检测方法，加强对该病诊断的准确性，提高其诊疗效果。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒及方法，所述的这种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒及方法要解决现有技术中检测猫传染性鼻气管炎病毒的方法复杂、准确性不高的技术问题。
本发明提供了一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒，含有：
(1)特异性引物，其中上游引物FHV-1F的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物FHV-1R的序列如SEQ ID NO：2所示；
(2)特异性探针FHV-1Probe，序列如SEQ ID NO：3所示，在特异性探针FHV-1Probe的5’设计有荧光物质FAM，在特异性探针FHV-1Probe的3’设计有带有淬灭物质TAMRA。
进一步的，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂、Taq酶、PCR缓冲液、DNA聚合酶中的任意一种或者一种以上的组合。
本发明还提供了采用上述的试剂盒检测猫传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤：
1)一个样本处理的步骤，从样本中提取DNA；
2)一个荧光PCR的步骤，按照检测样品数n(n＝待检样品数+2)取荧光PCR试剂、上下游引物和探针混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用，将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中，荧光信号在60℃时收集，检测通道：FAM；
3)一个结果判定的步骤，若样品Ct值＞35或无数值的标本为阴性；若样品Ct值≤30的标本为FHV-1阳性样品；若30＜Ct值≤35的样本建议重做，重做结果Ct值为none为阴性，否则为阳性。
进一步的，荧光PCR反应条件：95℃，30s；40个循环，95℃，5s；60℃，34s。
进一步的，荧光PCR试剂由2×TaqMan Master Mix商品化试剂代替。
进一步的，上述的检测方法还包括一个如下的质控标准：
(1)阴性对照的Ct值应等于none；
(2)阳性对照的Ct值应≤30，否则，此实验视为无效(Ct值应以S型曲线拐点的循环数为准)；
(3)应该同时满足上述2项条件，否则试验无效。
进一步的，上游引物FHV-1F的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物FHV-1R的序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步的，特异性探针FHV-1Probe，序列如SEQ ID NO：3所示，在探针F的5’设计有荧光物质FAM，在探针FHV-1Probe的3’设计有带有淬灭物质TAMRA。
本发明还提供了上述试剂盒的用途，用于从待测样品中检测猫传染性鼻气管炎病毒。
本发明是根据猫传染性鼻气管炎病毒(FHV-1)基因序列设计了一对特异性引物，其作用是能够特异性扩增FHV-1的DNA片段。根据设计的引物扩增出的DNA片段设计探针，其作用是特异性结合扩增出的DNA片段，在PCR扩增中释放FAM荧光信号，当荧光PCR仪通过相应的通道采集荧光时，就可以特异性观察到扩增曲线，达到检测FHV-1的目的。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的引物及探针针对猫传染性鼻气管病毒DNA的样品可发生特异性扩增，而对没有猫传染性鼻气管病毒DNA的样品不发生特异性扩增。因而所述引物和探针可良好地应用于检测猫传染性鼻气管病毒，并且具有良好的再现性、特异性好、灵敏度高、时间短。
附图说明
图1是TaqMAN荧光探针法检测PCV-2的原理图之一，显示了TaqMAN探针一端连接发光基团，一端连接淬灭基团，并且连接的DNA链能够与特异性DNA目的片段结合。
图2是TaqMAN荧光探针法检测PCV-2的原理图之二，显示了一对特异性引物在TaqDNA聚合酶作用下一方面进行DNA片段的合成，当到达探针结合位置时，它同时发挥限制性酶切作用，将探针中连接发光基团和淬灭基团的DNA链切断，释放发光基团。
图3是TaqMAN荧光探针法检测PCV-2的原理图之三，显示了发光基团游离在反应体系中时，受到激发就可以发出荧光，并被仪器收集到，形成扩增曲线，达到检测目的。
图4是荧光PCR图，为猫传染性鼻气管炎病毒检测方法的特异性试验，其中呈S型的曲线为FHV-1阳性的DNA样本，其余样本均为阴性，表明该试剂盒特异性好。
图5是荧光PCR图，为猫传染性鼻气管炎病毒检测方法的敏感性试验，其中，5条呈S型曲线的样本为FHV-1阳性DNA，其浓度分别为0.75ng/μL、75pg/μL、7.5pg/μL、0.75pg/μL、75fg/μL和7.5fg/μL。通过6个浓度梯度DNA的荧光PCR反应，结果表明试剂盒对FHV-1DNA最低检测浓度为75fg/μL。
图6是荧光PCR图，为猫传染性鼻气管炎病毒检测方法在测定标准曲线过程中，三列10倍梯度稀释的阳性样品的扩增曲线，图中可以看出在同一稀释度时S型曲线也是一致的，表明该方法重复性好，不同稀释度之间S型曲线出现的时间间隔也是一致的，表明该方法稳定性好。
图7是标准曲线图，FHV-1样品反应效率达到107％，在90％～110％之间，表明该方法反应效率较好；R2值为0.9965，介于0.99和1之间，表明该方法可信度较高；重复性测试结果表明，每个浓度DNA扩增所得Ct值的标准偏差(SD)值介于0.086至0.173之间，在可接受范围内。
具体实施方式
下列实施例旨在进一步举例描述发明，而不是以任何方式限制发明，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利范围之内。
实施例1  试剂盒组成
实时荧光PCR反应体系为25μL，包含2×TaqMan Master Mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL(10μM)，探针1μL(10μM)，5μL模板DNA，用去离子水补足至25μL。
上游引物FHV-1F：5’-ACGCTACAATTATACTCAAGCCAGAA-3’(SEQ IDNO：1)；
下游引物FHV-1R：5’-TCAGCTGTTATCTTCGGATCCA-3’(SEQ ID NO：2)。
探针的序列如下：
FHV-1Probe：FAM-CGTGCCAAAAATTCCCCAGGCG-TAMRA(SEQ ID NO：3)。
实时荧光PCR反应参数：95℃，30s；40个循环，95℃，5s；60℃，34s。荧光信号在60℃时收集，检测通道：FAM。
实施例2  猫传染性鼻气管炎病毒检测试剂盒的使用方法
1、待检样本的处理
待检样品一般包括临床采集的猫的眼结膜棉拭、鼻拭子、口腔拭子，以及病毒的细胞培养液，自行提取DNA，阳性对照无需提取，直接加样。
2、荧光PCR的检测
(1)按照检测样品数n(n＝待检样品数+2)取2×TaqMan Master Mix商品化试剂(也可以用等同效率的荧光PCR试剂代替)、上下游引物和探针混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用。
(2)现将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中。
(3)荧光PCR反应条件：95℃，30s；40个循环，95℃，5s；60℃，34s。荧光信号在60℃时收集，检测通道：FAM。
3、质控标准
(1)阴性对照的Ct值应等于none。
(2)阳性对照的Ct值应≤30，否则，此实验视为无效。(Ct值应以S型曲线拐点的循环数为准)
(3)应该同时满足上述2项条件，否则试验无效。
4、结果判定
(1)样品Ct值＞35或无数值的标本为阴性。
(2)样品Ct值≤30的标本为FHV-1阳性样品。
(3)30＜Ct值≤35的样本建议重做。重做结果Ct值为none为阴性，否则为阳性。
实施例3  试剂盒特异性试验
取猫杯状病毒、猫瘟病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、猫肾细胞(F81)等5个对照样本的核酸各5μL为模板进行PCR扩增，同时设阴性对照组。
PCR扩增条件：95℃，30s；40个循环，95℃，5s；60℃，34s。荧光信号在60℃时收集，检测通道：FAM。
荧光PCR结果表明仅FHV-1样品扩增出S型曲线，而作为对照样本的猫杯状病毒、猫瘟病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、猫肾细胞(F81)均无此扩增曲线出现(见图4)。
实施例4  试剂盒敏感性试验
提取FHV-1细胞培养液的DNA，并进行DNA浓度的测定，其DNA浓度为7.5ng/μL。将提取的DNA进行10倍梯度稀释，共稀释6个滴度，其浓度分别为0.75ng/μL、75pg/μL、7.5pg/μL、0.75pg/μL、75fg/μL和7.5fg/μL。通过6个浓度梯度DNA的荧光PCR反应，结果表明试剂盒对FHV-1DNA最低检测浓度为75fg/μL(见图5)。
实施例5  FHV-1标准曲线的绘制
提取FHV-1病毒DNA，其DNA溶液浓度为6.5ng/μL，然后使用DEPC水进行10倍的梯度稀释。对FHV-1阳性样品构建标准曲线，以DNA溶液浓度的对数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，每个反应均重复3次。直线方程及扩增效率如表1所示，扩增曲线如图6，标准曲线如图7。图6为以FHV-1的DNA为模板的扩增，从左到右分别为6.5、0.65、0.065、0.0065、0.00065ng/μL浓度DNA的扩增曲线；图7为FHV-1标准曲线。
结果表明，FHV-1样品反应效率达到107％，在90％～110％之间，表明该方法反应效率较好；R2值为0.9965，介于0.99和1之间，表明该方法可信度较高；重复性测试结果表明，每个浓度DNA扩增所得Ct值的标准偏差(SD)值介于0.086至0.173之间，在可接受范围内。表明建立的实时荧光PCR方法重复性与稳定性好。
表1、标准曲线方程及扩增效率
表1 标准曲线方程及扩增效率
样品 直线方程 R2 反应效率E
FHV-1 y＝-3.155x+40.46 0.9965 107.5％
实施例6  与普通PCR检测方法的对比
采集了上海牧医宠物诊所猫眼结膜棉拭样本共59份，编号后放入4℃冰箱待检。
(一)、样本的前处理
1、将采集的猫眼结膜棉拭样本2000×g离心5min，取上清，4℃保存备用；
2、样本DNA的提取(参考AXYGEN公司AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒说明书)
(1)取处理好的上清200μL，加入DNA裂解液Buffer V-L，涡旋震荡混合均匀，静置5min。
(2)加75μL Buffer V-N，涡旋振荡混合均匀，12000×g离心5min。
(3)将上清转移到新的2ml离心管中，加300μL异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6～8次，混合均匀。
(4)将制备管置于2ml离心管中，取步骤3中混合液移入制备管中，6000×g离心1min。
(5)弃滤液，将制备管置回到于2ml离心管中，加500μL Buffer W1A，室温静置1min。12000×g离心1min。
(6)弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加800μL Buffer W2，12000×g离心1min。
(7)将制备管置回到2ml离心管中，12000×g离心1min。
(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加40～60μLBuffer TE，室温静置1min，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA,-20℃保存备用。
(二)普通PCR方法检测
参考刘宝山等的方法(刘宝山,林颖,尹荣焕,等.猫疱疹病毒1型PCR检测方法的建立[J].畜牧与兽医,2010,42(1):74-76.)合成上下游引物FHV-1GDL/FHV-1GDD。
(1)组织样品中PCR的扩增
FHV-1检测的PCR反应体系如下：FHV-1检测用的上下游引物各1μL(20μmol·L-1)，10×PCR Buffer 2μL，25mmol·L-1Mg2+2μL，2.5mmol·L-1dNTP 1μL，rTaq DNA聚合酶5U，加入1μL提取的病毒核酸，加入灭菌双蒸水至20μL，PCR循环条件为：96℃预变性5min；94℃变性30s，40℃退火30s，72℃延伸45s，35循环，72℃延伸5min。当PCR结束后在1％的琼脂糖胶上进行电泳，并拍照观察。
(2)阳性样品的判断
在电泳结果中观察到1125bp大小的基因片段即可判断为阳性样品。
(三)荧光PCR方法检测
(1)按照检测样品数n(n＝待检样品数+2)取Mix、上下游引物和探针混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用。
(2)现将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中。
(3)荧光PCR反应条件：95℃，30s；40个循环，95℃，5s；60℃，34s。荧光信号在60℃时收集，检测通道：FAM。
(四)检测结果
同时用普通PCR方法和荧光PCR方法对59份上海牧医宠物诊所采集的猫眼结膜棉拭样本进行FHV-1的检测，结果见表2。
表2 普通PCR方法和荧光PCR方法对猫眼结膜棉拭样品样本进行FHV-1检测结果的比较
综上所述：目前，FHV-1检测还没有商品化的试剂盒，只有相关的普通PCR检测方法，这种方法的缺点也比较明显：1、检测周期长，不符合目前快速检测的要求；2、灵敏度差，与荧光PCR相比要相差2个滴度；3、特异性也不好，容易出现假阳性，进一步确诊需要进行测序，更不适用于大批量的快速检测；4、操作步骤繁琐，不利于大批量的快速检测。
本发明的猫传染性鼻气管炎病毒检测试剂盒克服了以上检测方法的不足。并应用于上海牧医宠物诊所采集的59份猫眼结膜棉拭样本的FHV-1的检测，同时与普通PCR方法进行了比较，结果表明普通PCR法和荧光PCR法的阳性率都为40.68％，两种方法的阳性符合率为100％，充分体现了本试剂盒特异性好、灵敏度高、周期短、操作简便等优点。本试剂盒采用荧光PCR方法检测FHV-1，对于FHV-1的检测、流行病学调查和风险评估具有重要的应用价值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒，其特征在于含有：
（1）特异性引物，其中上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；
（2）特异性探针，其序列如SEQ ID NO：3所示，在特异性探针的5’设计有荧光物质FAM，在特异性探针的3’设计有带有淬灭物质TAMRA。
2.如权利要求1所述的一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂、Taq酶、PCR缓冲液、DNA聚合酶中的任意一种或者一种以上的组合。
3..采用权利要求1所述的试剂盒检测猫传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）一个样本处理的步骤，从样本中提取DNA；
2）一个荧光PCR的步骤，按照检测样品数n（n=待检样品数+2）取荧光PCR试剂、上下游引物和探针混于一离心管中，于振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用，将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中，荧光信号在60℃时收集，检测通道：FAM；
3）一个结果判定的步骤，若样品Ct值＞35或无数值的标本为阴性；若样品Ct值≤30的标本为FHV-1阳性样品；若30＜Ct值≤35的样本建议重做，重做结果Ct值为none为阴性，否则为阳性。
4.如权利要求3所述的检测猫传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：荧光PCR反应条件：95℃，30s；40个循环，95℃，5s；60℃，34s。
5.如权利要求3所述的检测猫传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于： 荧光PCR试剂由2×TaqMan Master Mix商品化试剂替代。
6.如权利要求3所述的检测猫传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：上述的检测方法还包括一个如下的质控标准：
（1）阴性对照的Ct值应等于none；
（2）阳性对照的Ct值应≤30，否则，此实验视为无效；
（3）应该同时满足上述2项条件，否则试验无效。
7.如权利要求3所述的检测猫传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：上游引物FHV-1F的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物FHV-1R的序列如SEQ ID NO：2所示。
8.如权利要求3所述的检测猫传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：特异性探针的序列如SEQ ID NO：3所示，在探针的5’设计有荧光物质FAM，在探针的3’设计有带有淬灭物质TAMRA。
9..权利要求1所述试剂盒用于从待测样品中检测猫传染性鼻气管炎病毒。
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