CN101144817B

CN101144817B - 一种eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN101144817B
Application number: CN2006100799382A
Authority: CN
Inventors: 吴文翰; 陈泓霖; 陈国雄; 吴子柏
Original assignee: HONGKONG SHENNONG CO Ltd
Current assignee: HONGKONG SHENNONG CO Ltd
Priority date: 2003-08-20
Filing date: 2003-08-20
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2023-08-20
Also published as: CN1920562A; CN1584593A; CN101144817A; CN1300582C

Abstract

本发明涉及采用特定的EB病毒蛋白作为靶抗原检测血清中抗体水平的试剂盒，以及EB病毒重组多肽制备酶联免疫吸附试剂盒的方法。选择血清学诊断鼻咽癌(或传染性单核细胞增多症)最具临床诊断价值的EB病毒蛋白EBNA1(BKRF1)蛋白、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白作为靶抗原，用以检测血清中的抗体水平，并通过在谷胱甘肽转移酶基因融合系统中对EB病毒蛋白进行克隆、表达和纯化，创制出诊断试剂盒，从而使重组EB病毒抗原在EB病毒的原发性感染、确立EB病毒感染的抗体谱和鉴别诊断各种EB病毒感染、鉴别传染性单核细胞增多症和传染性单核细胞综合症、协助诊断疑为鼻咽癌、早期发现和评估患鼻咽癌的风险度等诊断方面得以应用。

Description

一种EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

[技术领域]

本发明涉及对鼻咽癌及其他EB病毒相关疾病进行血清学诊断的试剂盒及其制备方法，特别是采用特定的EB病毒蛋白作为靶抗原检测血清中抗体水平的试剂盒以及EB病毒重组多肽制备酶联免疫吸附试剂盒的方法。

[背景技术]

在我国，几乎100％四岁以上的人群均已感染了EB病毒，80％以上的健康成人是EB病毒携带者。EB病毒携带者血清中可以存在一种或2至3种(不是多种，即不是3种以上)低水平的(不是高水平的)抗EB病毒抗体。我国南方，特别是珠江三角洲及香港地区，是世界上鼻咽癌的高发区，而鼻咽癌的发生与EB病毒感染密切相关。我国南方及香港地区也是其他EB病毒相关疾病，例如鼻腔、鼻窦的NK/T细胞淋巴瘤、肺的淋巴上皮瘤样癌和传染性单核细胞增多症等的高发区。前两者患者血清EB病毒抗体谱与鼻咽癌患者的类同，而传染性单核细胞增多症患者血清EB病毒抗体的出现有一定的先后规律性。

目前常规地在临床上应用的血清EB病毒抗体的检测(免疫荧光法或免疫酶标法)在一定程度上欠客观性(凭个人在显微镜下计算阳性细胞的百分率)、指标较粗(采用几何级数的滴度，例如1:20，1:40，1:80等，尚未采用目前数码时代的十分具体的数字表示)，且对EB病毒感染的特征针对性不强。例如鼻咽癌主要是潜伏感染伴少量溶解性感染，鼻咽癌患者血清中大多具有广谱的高水平的抗EB病毒抗体，特别是IgA抗体。又例如不能确切地显示传染性单核细胞增多症患者血清中具特征性的抗体水平(包括：p18VCAIgM、低亲和性p18VCAIgG、p18VCAIgG和EBNA1IgG)。

酶联免疫吸附法可用于鉴别EB病毒的各种感染状态，在血清学诊断EB病毒相关疾病时，具有十分潜在的优势。目前虽已有采用酶联吸附试制盒血清学诊断EB病毒相关疾病的研究报告，但缺乏处理EB病毒抗体水平的一套新方法。如何区分高、低水平，尚无比较客观的标准。此外，应用酶联免疫吸附法时，如何克服各批号之间的差异和采用同一批号试剂盒每次检测之间的差异，目前尚无良方。

[发明内容]

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒，其优化的酶联免疫吸附法(ELISA)具有客观性和EB病毒抗原的特异性，它提供了定量检测针对个体EB病毒抗原的不同免疫球蛋白抗体的亚型。这种优化的酶联免疫吸附法(ELISA)完全是新的，是传统的血清学检测法做不到的，因为传统的血清学检测法并不能明确抗原的特异性。而且，新的优化的酶联免疫吸附法(ELISA)采用了参考血清，可以纠正每批检测间的差异，保证了诊断的可靠性。

本发明选择血清学诊断鼻咽癌(或传染性单核细胞增多症)最具临床诊断价值的EB病毒蛋白(相关氨基酸序列95％的同源性)为EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截，即：

PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGP

RGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF

VYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFL

QTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDG

DDGDEGGDGDEGEEGQE

以及Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。采用这三种EB病毒蛋白作为靶抗原，用以检测血清中的抗体水平，并通过在谷胱甘肽转移酶基因融合系统中对EB病毒蛋白进行克隆、表达和纯化，创制出诊断试剂盒，从而使重组EB病毒抗原在以下诊断方面得以应用：

1、EB病毒的原发性感染；

2、确立EB病毒感染的抗体谱和鉴别诊断各种EB病毒感染；

3、鉴别传染性单核细胞增多症(Infectious mononucleosis)和传染性单核细胞综合症(Infectious mononucleosissyndrome)；

4、血清学协助诊断疑为鼻咽癌；

5、早期发现和评估患鼻咽癌的风险度。

这三种蛋白(六种抗体检测)的试剂盒可以相互互补。可以单独使用，也可以组合使用。例如：EBNA1-IgA和Zta-IgG的组合检测大大地提高了血清学诊断鼻咽癌的可靠性。即：绝大多数鼻咽癌患者既呈EBNA1-IgA阳性，又呈Zta-IgG阳性；少数鼻咽癌患者即使是EBNA1-IgA阴性，也会呈Zta-IgG阳性。而少数鼻咽癌患者即使是Zta-IgG阴性，也会呈EBNA1-IgA阳性，两者有互补作用。

许多临床上疑有鼻咽癌的人，经此组合检测后，如果EBNA1-IgA和Zta-IgG均为阴性，则90％以上可以有把握地排除是鼻咽癌患者。这对鼻咽癌高发区的医院和人群来说，无疑贡献良多。

如何在鼻咽癌高发区人群中早期发现患者，以便早期治疗，获得最佳的预后？本试剂盒的组合使用，提供了可能性。同时做EBNA1-IgA、EBNA1-IgG和Zta-IgG后显示：三者阳性是高风险人群；两者阳性是中风险人群；仅单阳者是低风险人群。这对鼻咽癌高发区人群早期发现鼻咽癌患者，又是一重大贡献。

组合使用本试剂盒也有助于传染性单核细胞增多症的诊断和判别各种类型的EB病毒感染。

总之，选择这三种EB病毒蛋白作为试剂盒的靶抗原，不但有单独使用的价值，更是一个整体性的、具有互补性的设计和临床实践(见下表)，可以组合使用，非其他试剂盒可以比拟，具有创新性，应获得权利保护。请见下表。

利用谷胱甘肽转移酶基因融合系统克隆、表达和纯化的这三种EB病毒蛋白。融合克隆蛋白的大小分别为：

EBNA-1＝40Kd；BFRF3＝44Kd；BZLF1＝53Kd。

但披覆在检测板上的抗原，已采用凝血酶(Thrombin)法从融合蛋白中脱离，因此是去除了谷胱甘肽转移酶(GST)的抗原。这就避开了在抗原抗体反应时由谷胱甘肽转移酶所引起的非特异性反应。

这三种EB病毒蛋白的特征可以概括如下表：

[附图说明]

图1：采用ELISA检测EBNA1-IgA抗体水平时血清的稀释度。

图2：鼻咽癌患者与健康供血者的BNA1-IgA抗体水平比较。

图3：优化体外诊断鼻咽癌的EB病毒ELISA法。

图4：血清中具有高水平广谱的抗体是鼻咽癌患者的一种特异性的特征。

图5：鼻咽癌诊断和风险评估的EB病毒抗体谱。

[具体实施方式]

一、EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒，包括有：阳性对照血清、对照血清、酶底物、终止反应液、稀释缓冲液、冲洗缓冲液以及EB病毒靶抗原，其中EB病毒蛋白为：EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。

试剂盒还包括有相当于优化临界光密度值的诊断参考血清。参考血清以灵敏度曲线和特异度曲线交接点的相对光密度值(rOD)为最佳临界值。

EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒的制备方法，包括重组抗原的制备、纯化标记、效价滴定、包被板制备、封闭、干燥及包装、酶标抗体浓缩液制备、稀释液制备、阳性对照制备、正常对照制备、参考血清制备、底物分装、终止液及浓缩液置备等步骤。

二、EB病毒蛋白在谷胱甘肽转移酶基因融合系统中的克隆、表达和纯化

2.1选择血清学诊断鼻咽癌(或传染性单核细胞增多症)的EB病毒蛋白

最具临床诊断价值的EB病毒蛋白为：EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。因此我们采用这三种EB病毒蛋白作为靶抗原，用以检测血清中的抗体水平。

2.2三种EB病毒蛋白的制备

采用现代分子生物学方法在谷胱甘肽转移酶基因融合系统中克隆、表达和纯化这三种EB病毒蛋白。

2.2.1选定这三种EB病毒蛋白在基因库(V01555，B95-8细胞株的序列)中的mRNA序列，逆转录酶将之转为cDNA序列。

2.2.2设计可以扩增该cDNA序列的引物

在引物5’端加BamHI酶切序列(GGATCC)或EcoRI序列(GAATTC)，以便在Bam HI和EcoR1切割后，将之插入物连结至质粒pGEX DNA(4948bp，AMnersham Biosciences)。而引物5’端再加TAG，既有利插入，又经限制性酶消化后不出现在克隆中。

2.2.3具体的引物设计、序列扩增过程

2.2.3.1关于EB病毒EBNA1蛋白(又称BKRF1蛋白)

2.2.3.1.1EBNA-1(BKRF1)引物设计

5’-TAC GGA TCC CCT GTA GGG GAA GCC GAT TA-3’

BamHI

5’-TAC GAA TTC TCA CTC CTG CCC TTC CTC CAC-3’

EcoRI

引物5’端的3个碱基TAC经限制性酶消化后不出现在克隆中。

GGATCC为BamHI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)，GAATTC则为EcoRI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)。

2.2.3.1.2扩增的EBNA-1编码序列(cDNA)

B95-8细胞的EBNA1(BKRF1)的核苷酸编码序列应为107950-109875。现在扩增的序列为109171-109875。即无需107950-109170甘氨酸(Gly)重复区截取的EBNA-1编码序列。所克隆的编码DNA序列与B95-8细胞的完全一致，共705碱基。以下划线表示。

107950→ a tgtctgacga ggggccaggt acaggacctg gaaatggcct aggagagaag

108061 aaccatggac gaggacgggg aagaggacga ggacgaggag gcggaagacc aggagccccg

108121 ggcggctcag gatcagggcc aagacataga gatggtgtcc ggagacccca aaaacgtcca

108001 ggagacacat ctggaccaga aggctccggc ggcagtggac ctcaaagaag agggggtgat

108061 aaccatggac gaggacgggg aagaggacga ggacgaggag gcggaagacc aggagccccg

108121 ggcggctcag gatcagggcc aagacataga gatggtgtcc ggagacccca aaaacgtcca

108181 agttgcattg gctgcaaagg gacccacggt ggaacaggag caggagcagg agcgggaggg

108241 gcaggagcag gaggggcagg agcaggagga ggggcaggag caggaggagg ggcaggaggg

108301 gcaggagggg caggaggggc aggagcagga ggaggggcag gagcaggagg aggggcagga

108361 ggggcaggag gggcaggagc aggaggaggg gcaggagcag gaggaggggc aggaggggca

108421 ggagcaggag gaggggcagg aggggcagga ggggcaggag caggaggagg ggcaggagca

108481 ggaggagggg caggaggggc aggagcagga ggaggggcag gaggggcagg aggggcagga

108541 gcaggaggag gggcaggagc aggaggggca ggaggggcag gaggggcagg agcaggaggg

108601 gcaggagcag gaggaggggc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggagca

108661 ggaggggcag gagcaggagg ggcaggagca ggaggggcag gaggggcagg agcaggaggg

108721 gcaggagggg caggagcagg aggggcagga ggggcaggag caggaggagg ggcaggaggg

108781 gcaggagcag gaggaggggc aggaggggca ggagcaggag gggcaggagg ggcaggagca

108841 ggaggggcag gaggggcagg agcaggaggg gcaggagggg caggagcagg aggaggggca

108901 ggagcaggag gggcaggagc aggaggtgga ggccggggtc gaggaggcag tggaggccgg

108961 ggtcgaggag gtagtggagg ccggggtcga ggaggtagtg gaggccgccg gggtagagga

109021 cgtgaaagag ccaggggggg aagtcgtgaa agagccaggg ggagaggtcg tggacgtgga

109081 gaaaagaggc ccaggagtcc cagtagtcag tcatcatcat ccgggtctcc accgcgcagg

109171

↓

109141 ccccctccag gtagaaggcc atttttccac cctgtagggg aagccgatta ttttgaatac

109201 caccaagaag gtggcccaga tggtgagcct gacgtgcccc cgggagcgat agagcagggc

109261 cccgcagatg acccaggaga aggcccaagc actggacccc ggggtcaggg tgatggaggc

109321 aggcgcaaaa aaggagggtg gtttggaaag catcgtggtc aaggaggttc caacccgaaa

109381 tttgagaaca ttgcagaagg tttaagagct ctcctggcta ggagtcacgt agaaaggact

109441 accgacgaag gaacttgggt cgccggtgtg ttcgtatatg gaggtagtaa gacctccctt

109501 tacaacctaa ggcgaggaac tgcccttgct attccacaat gtcgtcttac accattgagt

109561 cgtctcccct ttggaatggc ccctggaccc ggcccacaac ctggcccgct aagggagtcc

109621 attgtctgtt atttcatggt ctttttacaa actcatatat ttgctgaggt tttgaaggat

109681 gcgattaagg accttgttat gacaaagccc gctcctacct gcaatatcag ggtgactgtg

109741 tgcagctttg acgatggagt agatttgcct ccctggtttc cacctatggt ggaaggggct

109801 gccgcggagg gtgatgacgg agatgacgga gatgaaggag gtgatgggaga tgagggtgag

109861 gaagggcagg agtga←109875

^*>为终止密码子

2.2.3.1.3所翻译形成的氨基酸序列(amino acid sequenc)

除109873-109875的tga为终止密码子外，实际翻译到

234个氨基酸，以下划线表示。

MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGGSGPQRRGGDNHGRGRG

RGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQKRPSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGG

AGAGGGAGAGGGAGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAG

GGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGGAGGAGAGGA

GAGGGAGGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAG

GAGAGGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGAGGGGRGRGGS

GGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSG

SPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGP

RGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF

VYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFL

QTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDG

DDGDEGGDGDEGEEGQE

2.2.3.2关于EB病毒Zta(BamH1Z transactivator)或ZEBRA(BamHI Z Epstein-Barr Replication Activator)蛋白或BZLF1蛋白

2.2.3.2.1Zta(BZLF1)引物设计

5’-TAC GGA TCC ATG ATG GAC CCA AAC TCG AC-3’

BamHI

5’-TAC GAA TTC TTA GAA ATT TAA GAG ATC CTC-3’

EcoRI

引物5’端的3个碱基TALC经限制性酶消化后不出现在克隆中。

GGATCC为BamHI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)，GAATTC则为EcoRI限制性酶切序列(Bam HI restrictionsite)。

2.2.3.2.2扩增的Zta编码序列(cDNA)

B95-8细胞的Zta(BZLF1)的核苷酸编码序列应为102210-102338，102423-102530，102655-103155三段拼接而成。以下划线表示。所克隆的编码DNA序列与B95-8细胞的三段拼接而成的序列完全一致，共738碱基。以下划线表示。

02210

↓

102181 tgaagcaggc gtggtttcaa taacgggagt tagaaattta agagatcctc gtgtaaaaca

102241 tctggtgtcc gggggataat ggagtcaaca tccaggcttg ggcacatctg cttcaacagg

102301 aggcgcagcc tgtcattttc agatgatttg gcagcagcca cctgcggaca aaaatcaggc

↑

102338

102361 gtttagatgg ggcatttatg tttgggacgc tagccgcctg ggcattcgtg ttagtatata

102423

↓

102421 ctgacctcac ggtagtgctg cagcagttgc ttaaacttgg cccggcattt tctggaagcc

102481 acccgattct tgtatcgctt tatttctagt tcagaatcgc attcctccag ctgcgagcaa

↑

102530

102541 gggaatgcgt tactacaagt ggtgcctagt cagttgaaac aagccccacc atccgctgcc

102655

↓

102601 gcccctccat gagccccacc gtccgctgcc gcccctcctt gagcccctcc ttaccgattc

102661 tggctgttgt ggtttccgtg tgcgtcgtgc cggggcagcc actggtgcag gctgtggaac

102721 accaatgtct gctagctgtt gtccttggtt agccccgggg caagcaaaca ccactgctgc

102781 tgctgtttga acagtagaat tgtctccagg ttgaggtgct tctcccccgg cttggttagt

102841 ctgttgattc tgggttatgt cggagactgg gaacagctga ggtgctgcat aagcttgata

102901 agcattctca ggagcaggct gaggggcaga aaaccacgac ccagtcggag cggttgaaac

102961 atgataggca gttagctggc cttgtggcag aggctctggc agcaccggcc acagcacaca

103021 aggcaaagga gcttgcgatg gccctcccag gtcctgatag actctggtag cttggtcaaa

103081 agcttgtaca aaaggcacct ggtatgggtc aggtgtaaat tttacatctt cagaagtcga

103141 gtttgggtcc atcatcttca gcaaagatag caaaggtggc cggcaaggtg caatgtttag

↑

103155

三段拼接而成的序列如下：

*>为终止密码子

t tagaaattta agagatcctc gtgtaaaaca

tctggtgtcc gggggataat ggagtcaaca tccaggcttg ggcacatctg cttcaacagg

aggcgcagcc tgtcattttc agatgatttg gcagcagc

gacctcac ggtagtgctg cagcagttgc ttaaacttgg cccggcattt tctggaagcc

acccgattct tgtatcgctt tatttctagt tcagaatcgc attcctccag

cgattc

tggctgttgt ggtttccgtg tgcgtcgtgc cggggcagcc actggtgcag gctgtggaac

accaatgtct gctagctgtt gtccttggtt agccccgggg caagcaaaca ccactgctgc

tgctgtttga acagtagaat tgtctccagg ttgaggtgct tctcccccgg cttggttagt

ctgttgattc tgggttatgt cggagactgg gaacagctga ggtgctgcat aagcttgata

agcattctca ggagcaggct gaggggcaga aaaccacgac ccagtcggag cggttgaaac

atgataggca gttagctggc cttgtggcag aggctctggc agcaccggcc acagcacaca

aggcaaagga gcttgcgatg gccctcccag gtcctgatag actctggtag cttggtcaaa

agcttgtaca aaaggcacct ggtatgggtc aggtgtaaat tttacatctt cagaagtcga

gtttgggtcc atcat

2.2.3.2.3所翻译形成的氨基酸序列(amino acid sequenc)

除102212-102210的taa)为终止密码子外，实际翻译到245个氨基酸，以下划线表示。

MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPL

PCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQ

NQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTR

KPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLL

KQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF

2.2.3.3关于EB病毒VCA-p18蛋白(又称BFRF3蛋白)，即18kd的VCA蛋白

2.2.3.3.1VCA-p18(BFRF3)引物设计

5’-TAC GGA TCC ATG GCA CGC CGG CTG CCC AAG-3’

BamHI

5’-TAC GAA TTC CTA CTG TTT CTT ACG TG-3’

EcoRI

引物5’端的3个碱基TAC经限制性酶消化后不出现在克隆中。GGATCC为BamHI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)，GAATTC则为EcoRI限制性酶切序列(Bam HI restrictionsite)。

2.2.3.3.2扩增的BFRF3编码序列(cDNA)

B95-8细胞的BFKF3的核苷酸编码序列应为61507-62037。

所克隆的编码DNA序列与B95-8细胞的完全一致，共531碱基。以下划线表示。

61507

↓

61501 cgcgttatgg cacgccggct gcccaagccc accctccagg ggaggctgga ggcggatttt

61561 ccagacagtc ccctgcttcc taaatttcaa gagctgaacc agaataatct ccccaatgat

61621 gtttttcggg aggctcaaag aagttacctg gtatttctga catcccagtt ctgctacgaa

61681 gagtacgtgc agaggacttt tggggtgcct cggcgccaac gcgccataga caagaggcag

61741 agagccagtg tggctggggc tggtgctcat gcacaccttg gcgggtcatc cgccaccccc

61801 gtccagcagg ctcaggccgc cgcatccgct gggaccgggg ccttggcatc atcagcgccg

61861 tccacggccg tagcccagtc cgcgaccccc tctgtttctt catctattag cagcctccgg

61921 gccgcgactt cgggggcgac tgccgccgcc tccgccgccg cagccgtcga taccgggtca

61981 ggtggcgggg gacaacccca cgacaccgcc ccacgcgggg cacgtaagaa acagtagagg

↑

62037

61507→atgg cacgccggct gcccaagccc accctccagg ggaggctgga ggcggatttt

ccagacagtc ccctgcttcc taaatttcaa gagctgaacc agaataatct ccccaatgat

gtttttcggg aggctcaaag aagttacctg gtatttctga catcccagtt ctgctacgaa

gagtacgtgcagaggacttttggggtgcctcggcgccaacgcgccataga caagaggcag

agagccagtg tggctggggc tggtgctcat gcacaccttg gcgggtcatc cgccaccccc

gtccagcagg ctcaggccgc cgcatccgct gggaccgggg ccttggcatc atcagcgccg

tccacggccg tagcccagtc cgcgaccccc tctgtttctt catctattag cagcctccgg

gccgcgactt cgggggcgac tgccgccgcc tccgccgccg cagccgtcga taccgggtca

ggtggcgggg gacaacccca cgacaccgcc ccacgcgggg cacgtaagaa acagtag←62037

*>为终止密码子

2.2.3.3.3所翻译形成的氨基酸序列(amino acid sequenc)

除62035-620370的tag为终止密码子外，实际翻译到176个氨基酸，以下划线表示。

MARRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVFREAQ

RSYLVFLTSQFCYEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQA

QAAASAGTGALASSAPSTAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAASAAAAVDTGSGG

GGQPHDTAPRGARKKQ

总结关于EB病毒EBNA1蛋白、Zta蛋白、和VCA-p18蛋白的基因片段、基因库序列大小、扩增克隆序列大小和表达多肽的氨基酸数如下。

表1

2.3将PCR扩增子与谷胱甘肽转移酶(GST)基因克隆到Eco R1／Bam HI消化的原核细胞表达pGEX2T质粒载体(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上系在一起。采用氯化钙技术将重组的质粒转至大肠杆菌。加乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷诱导已经转到了重组质粒的大肠杆菌数小时，然后收获细菌并以去垢triton(一系列有机的非离子型表面活化剂的商品名)X-100和超声波裂解细菌。细菌裂解产物经离心后除去碎片而澄清，含融合蛋白的上清液采用谷胱甘肽琼脂糖4B经谷胱甘肽转移酶-谷胱甘肽亲和色谱仪纯化。纯度达94.0％以上。融合克隆蛋白的大小为：EBNA-1＝40Kd；BFRF3＝44Kd；BZLF1＝53Kd。具体步骤如下。

2.3.1.cDNA的扩增

2.3.1-1RNA的制备。

2.3.1.1.1根据Rnaid Plus试剂盒(BIO101)说明书的要求从培养细胞中分离RNA。

采用RNaid Plus试剂盒从悬浮的细胞中抽提RNA。培养的细胞用PBS洗一次，然后每10⁶细胞加1ml quanidine thiocyanate溶解液，并与vortex混合。再加等容积酸性酚(acid phenol)，并混合。加1mlchloroform isoamyl alcohol(BDH)至溶液中，再次混合。溶解产物在冰块上孵15min后，在4℃下旋转10,000xg20min。将上层转移至一新管，再用1/2容积的chloroform isoamyl alcohol(BDH)旋转2min。将上层再转移至一新管。加入15ul RNAMATRIX，并在室温下孵育5min，孵育中偶加混合，使RNA吸附。RNA/RNAMATRIX复合物在10,000xg下1min形成小球，在500μl RNA洗液中洗两次。小球再次悬浮在30-100μl Diethpyrocarbonate(DEPC，Sigma)处理过的水中。RNA在55℃下洗提5min，并适合于光谱分析。

2.3.1.1.2.采用RT PCR扩增RNA转录物。

2.3.1.2在Bam HI和EcoR1切割后，将插入物连结至质粒pGEX DNA(4948bp，Amersham Biosciences)。

2.3.2将连结产物转至XL1反应潜能细胞。

2.3.3采用摘取个别克隆法使质粒小孔化。

2.3.4小孔化DNA的限制性酶切。

2.3.5从pGEX重组物中筛选融合蛋白表达。

2.3.6SDS PAGE分析。

2.3.7采用抗谷胱甘肽转移酶抗体做Western blot。

2.3.8大量纯化融合蛋白。

2.3.9如果需要的话用凝血酶将谷胱甘肽转移酶融合蛋白中的谷胱甘肽转移酶除去。

3.所选三类EB病毒抗原的特点

所选三类EB病毒抗原的ELISA法对测定EB病毒抗体既敏感、特异、又客观。

表2 EB病毒抗原的ELISA法对测定EB病毒抗体既敏感、特异、又客观

临界值＝所测血清的平均光密度值/血清空白的平均光密度值＝S/N＝3

为了检测Zta IgA，开始的血清稀释度是1:20；为了检测p18VCAIgA和EBNA1 IgA，开始的血清稀释度是1:100；为了检测p18VCAIgG和Zta IgG，开始的血清稀释度是1:200；为了检测EBNA1 IgG，开始的血清稀释度是1:1000。滴度＝高于临界值的最大血清稀释度。

从表2可知：

(1)取自1例从未感染过EB病毒的婴儿血清(N11)，没有检测到VCA IgG；而在一例传染性单核细胞增多症患者急性感染期所取的血清样本中(N31)，VCA IgG抗体很早就产生了。可以为了客观地作抗体的定量。

(2)在急性时期的传染性单核细胞增多症患者血清样本中(N31)无EBNA1IgG抗体。在产生VCA IgG抗体8个月或更长时期后才产生EBNA1IgG(Chan KH等)。

(3)因此，同时出现VCA IgG和EBNA1IgG是过去感染EB病毒的指标。

(4)与健康携带者相对比，鼻咽癌患者血清中具有广谱的抗EB病毒抗体。

(5)EBNA1 IgG的抗体水平高于其他的抗体水平。这说明，EBNA1是EB病毒感染，特别是鼻咽癌患者的一种重要抗原。这也是与EBNA1是寄生在肿瘤细胞中的EB病毒所表达的主要抗原相一致的。

(6)总之，上述结果显示，酶联免疫吸附法可用于鉴别EB病毒的各种感染状态。

(7)所以，针对EB病毒特异性抗原而创建的酶联免疫吸附法，在血清学诊断EB病毒相关疾病时，确实具有十分潜在优势的可用性。

4.优化血清学诊断鼻咽癌的ELISA法

(1)创建了以灵敏度和特异度曲线的交界点为临界光密度值由于鼻咽癌患者血清中抗EB病毒抗体水平与健康携带者血清中抗EB病毒抗体水平有相互重叠，不会具有能回答“阳”或“阴”的绝对标准(见附图2)，我们所创建的以灵敏度和特异度曲线的交界点为临界光密度值(见附图3)的方法，区分“高”和“低”，就能客观地反映鼻咽癌患者血清中抗EB病毒抗体的特征。

(2)创建了根据鼻咽癌患者组和健康成人组的滴度曲线确定检测血清的稀释度(见图1)。

表3 优化血清学诊断鼻咽癌的ELISA法

^*根据74例鼻咽癌患者和81例对照组的数据而得

z：抗免疫球蛋白购自Zymed，zG表示Zymed IgG，zA表示Zymed IgA

(3)为了诊断标准的判定，在试剂盒中提供一支相当于优化临界光密度值的诊断参考血清。这就使使用同一批号的试剂盒分批检测样本时，可以纠正每一批检测所应用的区分高、低水平的相对光密度值，得出更精确可靠的数据。

(4)由于鼻咽癌患者血清中大多具有广谱的高水平的抗EB病毒抗体，特别是IgA抗体的特征(见图4)，我们创建了两步检测法，即首先使用EBNA IgA，如属“高”水平则再进行第二步，使用Zta IgG以诊断，或同时使同Zta-IgG和EBNA IgG以筛选(见附图5)。

总之，新的优化的酶联免疫吸附法(ELISA)具有客观性和EB病毒抗原的特异性，它提供了定量捡测针对个体EB病毒抗原的不同免疫球蛋白抗体的亚型。这种优化的酶联免疫吸附法(ELISA)完全是新的，是传统的血清学检测法做不到的，因为传统的血清学检测法并不能明确抗原的特异性。而且，新的优化的酶联免疫吸附法(ELISA)采用了参考血清，可以纠正每批检测间的差异，保证了诊断的可靠性。

5.重组EB病毒抗原在诊断方面的应用

5.1EB病毒的原发性感染

5.1.1免疫荧光显示存在VCA抗体；由于延迟的EBNA抗体转阳，所以采用抗补体免疫荧光显示无EBNA抗体。

5.1.2EBV IgM阳性。

5.1.3低亲和性VCAIgG抗体

这里要强调的是：采用荧光免疫(IF)检测低亲和性VCA IgG不敏感，而采用ELISA则较敏感；采用荧光免疫(IF)检测VCA IgM不敏感，而采用ELISA较敏感。

为了测定低亲和性VCA IgG抗体，将一系列血清样本在平行的徽板上起作用。一个板孔以4M尿素处理30min，而另一个板孔则不经处理。当尿素处理引起抗体水平下降4倍或4倍以上时，则显示低亲和性VCA IgG抗体存在。

5.2 确立EB病毒感染的抗体谱和鉴别诊断各种EB病毒感染

表4 EB病毒各种感染状态的抗体谱

表5 各种EB病毒感染状态的鉴别诊断

^*所有过去感染过EB病毒的人，经酶联免疫吸附法检测VCA IgG和EBNA1 IgG，均呈阳性。

^**所有过去未感染过EB病毒的人，经酶联免疫吸附法检测VCA IgG和EBNA1 IgG，均呈阴性。

由此可见，由于EBNA IgG要在感染后一段时间血清抗体才转阳，采用传统的免疫荧光法不能鉴别急性原发性感染和近期感染；而采用酶联免疫吸附法检测血清低亲和性p18 VCA IgG和VCAIgM，则大多数急性原发性感染患者(低亲和性p18 VCA IgG为97.8％，VCA IgM为67.4％)可呈阳性。即，采用酶联免疫吸附法可鉴别急性原发性感染和近期感染。

5.3鉴别传染性单核细胞增多症(Infectious mononucleosis)和传染性单核细胞综合症(Infectious mononucleosis syndrome)

5.3.1除症状、白细胞升高(12000-18000)、外周血涂片见不典型CD4T淋巴细胞、异嗜抗羊红细胞抗体(heteophil anti-sheepred blood cell antibodies)、涂片EBERs原位杂交等外。

5.3.2首先出现传染性单核细胞增多症的急性表指，即p18VCA IgM和低亲和性VCAIgG，然后是VCA IgG，8个月后才出现EBNA1 IgG。因此：

未感染EB病毒：VCA阴性、EBNA1为阴性。

传染性单核细胞增多症：VCA阳性、EBNA1阴性。

健康携带者：VCA阳性、EBNA1阳性。

VCA阴性、EBNA1为阴性，为未感染EB病毒。

因此，采用ELISA法检测EBNA1 IgG阳性和p18VCA IgM阳性则为传染性单核细胞增多症；而传染性单核细胞综合症则否。

5.4血清学协助诊断疑为鼻咽癌

5.4.1鼻咽癌患者血清EB病毒抗体水平特征及血清学检测的应用范围

表6 鼻咽癌患者血清EB病毒抗体水平特征及血清学检测的应用范围

5.4.2免疫荧光法和酶联免疫吸附法的单独使用

在香港玛丽医院218例连续检测的血清样本中(51例鼻咽癌、4例鼻咽以外的淋巴上皮瘤样癌、23例其他癌和140例其他疾病)作了如下分析。

表7 免疫荧光法和酶联免疫吸附法单独使用的比较

阳性预测＝真阳性/真阳性+假阳性x100％＝A/(A+C)x100％

阴性预测＝真阴性/假阴性+真阴性x100％＝D/(B+D)x100％

5.4.3免疫荧光法和酶联免疫吸附法的联合使用的比较

在香港玛丽医院218例连续检测的血清样本中(51例鼻咽癌、4例鼻咽以外的淋巴上皮瘤样癌、23例其他癌和140例其他疾病)同样作了如下分析。

表8 免疫荧光法联合使用在血清学诊断鼻咽癌方面的比较

阳性预测＝真阳性/(真阳性+假阳性)x100％＝TP/(TP+FP)

40/(40+5)＝88.9％

11/(11+64)＝14.7％

阴性预测＝真阴性/(假阴性+真阴性)x100％＝TN/(TN+FN)

94/(94+4)＝95.9％

值得指出的是，无论是鼻咽癌患者或健康成人，EA IgA阳性者中没有一例呈VCA IgA阴性，这是因为所采用的B95-8细胞所产生的“VCA”中既有溶解晚期的抗原，又包含了溶解早期的抗原。所以，在免疫荧光法中所采用的VCA IgA的抗原特异性与EA IgA的抗原特异性相互重叠了。也就是说，虽然联合使用了两种免疫荧光法，却不能达到“1+1＝2”的作用，即互补作用不强。而且，VCA IgA和EAIgA双阴性98中，4例为假阴性，假阴性率达4.1％(4/4+94)，并不能在临床上起到有效的排除诊断鼻咽癌的作用。以下所述酶联免疫吸附法的联合使用却可以克服这一缺点。

5.4.4先做酶联免疫吸附法的EBNA1 IgA，再做免疫荧光VCA IgA

表9

阳性预测＝真阳性/(真阳性+假阳性)x100％＝TP/(TP+FP)

33/(33+5)＝88.8％

13/(13+17)＝43.3％

8/(8+25)＝

阴性预测＝真阴性/(假阴性+真阴性)x100％＝TN/(TN+FN)

116/(1+116)＝

比较后可知，酶联免疫吸附法联合使用(EBNA1 IgA+Zta IgG)的阴性预测值(99.1％)大大高于免疫荧光法联合使用(VCA IgA+EAIgA)，即临床上联合使用EBNA IgA和Zta IgG时，如果是双阴性，则排除鼻咽癌诊断的可靠性达99.1％。两种酶联免疫吸附法联合检测在血清学诊断鼻咽癌时具有很强的互补作用。

5.4.5采用免疫荧光和采用酶联免疫吸附血清学诊断鼻咽癌之间的关联

表11 采用免疫荧光和采用酶联免疫吸附血清学诊断鼻咽癌之间的关联

5.4.6酶联免疫吸附联合应用的血清学诊断鼻咽癌的预测和排除

表12

5.5早期发现和评估患鼻咽癌的风险度

联合应用EBNA1IgA、EBNA1 IgG和Zta IgG显示优势比大大增高。

表13联合应用EBNA1 IgA、EBNA1 IgG和Zta IgG显示优势比大大增高

两个层次的筛查：

第一层次：EBNA IgA

第二层次：Zta IgG+EBNA IgG

表14 早期发现和评估患鼻咽癌的风险度的两个层次的筛查

在1000人中140人(14.0％，140/1000)认为具有患鼻咽癌的风险度。在这140人中：4人(2.86％，4/140)认为具有高风险度；40人(28.57％，40/140)认为具有中等风险度；96人(68.57％，96/140)认为具有微风险度。860人EBNA1IgA低，未进一步做Zta-IgG和EBNA1 IgG，认为无风险度。

另香港某私人机构筛查了香港居民2000人，发现6例具有高风险度的人，其中1人证实为鼻咽癌忠患者，经治疗后5年无复发；所有其他人均未患鼻咽癌。

5.6协助诊断Burkitt淋巴瘤

应用Zta IgG1.

EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>香港神农有限公司(Sinoclone Limited)

<120>EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

<130>EBV Serological Diagnositic Kits

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>705

<212>DNA

<213>Epstein-Barr Virus

<400>1

<210>2

<211>234

<212>PRT

<213>Epstein-Barr Virus

<400>2

<210>3

<211>531

<212>DNA

<213>Epstein-Barr Virus

<400>3

<210>4

<211>176

<212>PRT

<213>Epstein-Barr Virus

<400>4

<210>5

<211>738

<212>DNA

<213>Epstein-Barr Virus

<400>5

<210>6

<211>245

<212>PRT

<213>Epstein-Barr Virus

<400>6

Claims

1.一种EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒，包括有：阳性对照血清、阴性对照血清、酶底物、终止反应液、稀释缓冲液、冲洗缓冲液以及EB病毒靶抗原，其特征在于EB病毒靶抗原蛋白为：EBNA1蛋白、Zta蛋白和VCA-p18蛋白，其中所述的Zta蛋白的氨基酸序列为：

MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPL

PCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQ

NQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTR

KPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLL

KQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF。