【発明の詳細な説明】
精神分裂病の診断のためのアッセイ
発明の分野および背景
本発明は精神分裂病の診断のためのアッセイに関する.
DSM−III(米国精神医学会編:精神疾患の診断および統計マニュアル,第
3版,1980)に定義されているように,精神分裂性障害は,機能の低下があり,
思考,感情および行動の解体を包含する精神病症状によって特徴づけられる慢性
化傾向を有する精神疾患である.
精神分裂病は世界的に存在する.この疾患は症候学的に明瞭に記述されている
最も重篤でかつ一般的な精神疾患の一つであり,過去10年間にわたり広範な研究
が行われてきたにもかかわらず,この疾患の病因は未だに謎である.
精神分裂病における自己免疫要素の関与に関する仮説は何十年も前から文献で
論じられている.一部の精神分裂病患者の血清からの抗体がインビトロで脳組織
と反応可能なことが明らかにされた(De Lisiら,1986;Jankovic,1984).し
かしながら,これらの所見には不一致があり,精神分裂病患者における自己抗体
の存在を肯定する結果は試験した患者の約25%で得られたにすぎない(De Lisi
ら,1986および1986).
最近,精神分裂病および痴呆患者の両者に血小板に対する自己抗体レベルの上
昇があることが本発明者らにより報告された(Shinitzkyら,1991).その研究
では,血小板の表面上に存在する自己抗体[以下「血小板関連抗体」(PAA)
という]のレベルが,精神分裂病患者,他の精神疾患を有する患者たとえばアル
ツハイマー型および多発梗塞性痴呆患者(神経遮断薬処置および非処置患者の両
者)ならびに正常対照者について,西洋ワサビペルオキシダーゼ接合抗−ヒト免
疫グロブリン(抗−ヒトIgA,IgE,IgGおよびIgM抗体)と反応後の
発色に基づく酵素結合免疫測定法を用いて測定された.この研究の結果は,精神
分裂病患者および痴呆患者では年齢の一致した正常対照に比較してPAAのレベ
ルは平均約2倍であることが証明された.精神分裂病および痴呆患者と正常対照
の間のPAAレベルにおけるこの統計的な差にもかかわらず,精神分裂病および
痴呆の診断の基礎としてのその価値は依然として大きなものではなかった.しか
も,この研究では精神分裂病と痴呆患者で類似の結果が得られ,これらの疾患そ
れぞれを最終的に確定することはできなかった.
痴呆患者を含めずに精神分裂病患者のみを確定する精神分裂病の特異的診断を
可能にし,しかも,血小板に対する自己免疫疾患たとえば突発性血小板減少性紫
斑病(ITP)患者に偽陽性の結果を生じないアッセイ法の提供が強く望まれる
所以である.
これは本発明のアッセイによって達成された.
発明の概要
本発明は,精神分裂病患者から単離されたPAAを血小板から単離された蛋白
質(以下「血小板抗原」という)と接触させたところ,すべての場合,類似の結
合パターンを生じたことに基づくものである.驚くべきことに,精神分裂病患者
からのPAAは,ITPに伴う血小板からのよく知られた抗原性蛋白質を認識し
て結合することがなく,しかし未知の血小板抗原を認識結合し,他方この未知抗
原は痴呆患者からのPAAによって認識されないことが見出されたのである.
本発明は,個体の精神分裂病の診断のためのアッセイにおいて以下の工程:
(a)上記個体から,血液サンプル,その血小板含有分画または血小板から脱
着させた血小板関連抗体(PAA)を含む分画であるサンプルを得る工程,
(b)上記サンプルを固体支持体に固定された血小板抗原および抗体検出系と
接触させる工程,ならびに
(c)上記サンプル中の上記PAAのそれらの特異的血小板抗原に対する結合
パターン,上記個体が精神分裂病である高い可能性を指示する正常個体とは異な
るパターンを測定する工程,
からなるアッセイを提供する.
試験される個体のサンプルは,血液サンプルたとえば血清,その血小板含有分
画または血小板から脱着させたPAA含有分画とすることができる.特定の実施
態様においては,既知の方法,たとえば抗凝固剤たとえばヘパリンまたはクエン
酸ナトリウム溶液による血液の処置および遠心分離によって得られる富血小板血
漿(PRP)が用いられる.他の実施態様においては,サンプルはPAAを含有
する分画,すなわちPRPの遠心分離,ペレット化された血小板のグリシン塩酸
塩緩衝液,pH2.5〜3.0との室温でのインキュベーションついで遠心分離によっ
て得られるPAA含有上清とする.
血小板抗原は,たとえばPRP由来の血小板の崩壊,ポリアクリルアミドゲル
電気泳動(PAGE)による分子量に応じた分離および固体支持体たとえばニト
ロセルロースへの移送によって得られる.
PAAレベルを検出するための抗体検出系はマーカーに連結させた抗−ヒト免
疫グロブリン(抗−hIg)抗体またはそのフラグメントからなる.この場合の
マーカーは,たとえば放射性基,蛍光性基,検出可能な産物を生成する反応を触
媒できる酵素たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)およびアルカリホ
スファターゼ,アビジンにより検出可能なビオチン基等とすることができる.
特定の実施態様においては,抗体はHRPに共有結合で連結させたウサギ抗−
ヒトIgG(抗−hIgG)とし,結合したHRPの検出試薬にはオルトフェニ
レンジアミンが使用される.
他の実施態様によれば,Fcが除去されているIgGのフラグメントたとえば
FabまたはF(ab’)2フラグメントもしくはそのフラグメントの結合ドメ
インを含むその部分,または単一鎖抗体等が使用される.単一ドメイン抗体が用
いられる場合は,PAAへの抗体の結合の程度は上記単一ドメイン抗体に対する
第二の抗体を使用し,第二の抗体は上述のマーカーに結合させて測定できる.
さらに他の実施態様によれば,精神分裂病に特異的なPAA標的抗原(単数ま
たは複数),すなわち精神分裂病患者のPAAに向けられた抗原(単数または複
数)が固定化された固体支持体を用いる.精神分裂病に特異的なPAA標的抗原
(単数または複数)は,精神分裂病患者からのPAAによって認識される抗原性
蛋白質から単離され,精製され,特性が明らかにされることになる.この実施態
様の第一の変法では,血小板を支持体と接触させてインキュベートしたのち,固
定化された血小板を,好ましくは標識されていて結合したPAA数の測定を可能
にする抗−hIg抗体と反応させる.この実施態様の第二の変法では,血小板を
まず処理してそれらのPAAを脱着させ,ついでPAA含有分画を支持体と反応
させ,インキュベーションおよび洗浄後,支持体を,好ましくは標識されていて
結合したPAA数の測定を可能にする抗-hIg抗体と反応させる.
本発明はまた,上記アッセイに有用なキットを提供する.本発明のキットは,
抗−hIg抗体またはそのフラグメント,および支持体上に固定化されたPAA
と反応性の唯一の抗原または複数の血小板抗原からなる支持体によって構成され
る.一実施態様によれば,キット中の抗体は検出可能なマーカーに接合されてい
る.他の実施態様においては,抗体のフラグメントを用いる場合,キットはまた
上記単一ドメイン抗体に対する第二型の抗体からなり,第二型の抗体は一方,検
出可能なマーカーに接合されている.さらに他の実施態様によれば,抗体は支持
体上に固定化され,キットはそのような支持体からなる.上述のすべての実施態
様におけるキットには,さらにアッセイの実施に必要な各種試薬を包含する.
次に本発明を,特定の実施態様に関する以下の非限定的説明および添付の図面
により例示する.
図面の簡単な説明
図1AおよびBは,10例の正常対照(A)および8例の精神分裂病患者(B)
から得られたPAAのニトロセルロース支持体中の血小板抗原への結合のウエス
タンブロットによる結合パターンを示す.10%アクリルアミドゲルにより分離し
てHRP標識ウサギ抗−ヒトIgGで測定した.
図2A〜Cは,4例の精神分裂病患者(A),4例の正常対照(B)および4
例の痴呆患者(C)からのPAAのニトロセルロース支持体中の血小板抗原への
結合のウエスタンブロットによる結合パターンを示す.10%アクリルアミドゲル
により分離し,HRP標識ウサギ抗−ヒトIgGで測定した.
図3は,10例の精神分裂病患者からのPAA(レーン1〜10)の,ニトロセル
ロース支持体上の血小板抗原への結合のウエスタンブロットによる結合パターン
を示す.7.5〜15%アクリルアミド勾配ゲルにより分離して,HRP標識ウサギ
抗−ヒトIgGで測定した.
実施例
一般操作
(i)患者および対照
この研究に参加したイスラエルの精神病院および老人病院に入院中の慢性精神
分裂病および痴呆患者.これらの患者は,各種の神経遮断剤で処置されている患
者および新たに診断された非処置患者の両者からなる.すべての患者に免疫疾患
およびアレルギー疾患はなかった.対照群は,精神疾患または慢性疾患の病歴の
ない健康なボランティアから構成された.
(ii)PAAレベルの測定
静脈血(20ml)を朝,抗凝固剤としてクエン酸ナトリウム溶液(クエン酸ナト
リウム−2.2%,クエン酸−0.73%,デキストロース一水和物−2.45%)を用い
て採取した.富血小板血漿(PRP)は全血を室温(20〜24℃)でゆっくり遠心
分離して(100×g,15分)得られ,血小板数は顕微鏡で計測した.
PAAレベルはHRP連結ウサギ抗−ヒトIgG(Shinitzkyら,1991)また
はこの抗体のFabフラグメントのいずれかで測定した.抗体またそのFabフ
ラグメントの結合後の発色に基づく酵素結合免疫測定法(ELI)を用いた.
HRPに結合した抗−ヒトIgG Fabフラグメントの調製には活性化した
プラスチックビーズ(Immunotip,U.S.A.,Scientific Plastics)を以下のよう
にパパインとカップリングさせた.すなわち,1mgのパパイン(Worthington,U
.S.A.)を0.2Mシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム(Fluka,U.S.A.)1ml中
に混合し,単一プラスチックビーズと5〜10分間インキュベートし,リン酸緩衝
食塩溶液(PBS)で完全に洗浄した.西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ウサギ
抗−ヒトIgG(BioMakor,Israel; 40μl中740μg)を穏やかに振盪しながら
パパイン接合ビーズと37℃で5時間インキュベートし,ついでプロテインAカラ
ム(Pierce)に通した.処置抗体のFabフラグメントを,15mlの10mM Tris
緩衝液,pH=7.4で洗浄して集めた.
ELI操作(Leporrierら,1979)には,300μlのPRPを遠心分離し,ペレ
ットを1mlのPBS,pH7.4に再懸濁した.この操作を3回反復した.ペレッ
トをついでHRPに連結したウサギ抗−ヒトIgGまたはHRPに連結したその
Fabフラグメントを含有するPBS 0.15mlに再懸濁し,37℃で30分間インキ
ュベートした.PBSにより4℃で4回洗浄したのち,血小板懸濁液を新たに調
製した基質試薬(2mgオルトフェニレンジアミン+3μl 30%H2O2含有
19.8ml PBS−0.2mlメタノール)と37℃で1時間インキュベートした.反応は0
.1mlの6N硫酸を加えて終結させた.遠心分離後,O.D.を480nmで読み取っ
た.バックグランドを差し引いたのち108血小板/mlでのO.D.を計算した(S
hinitzkyら,1991).
(iii)血小板からのPAAの単離
PRP(4〜15ml)を室温で遠心分離した(2000×g,15分).上清を捨てて
ペレットを5mlのPBS,pH7.2に再懸濁した.この工程を3回繰り返した.
ペレット化した血小板からのPAAの除去には,2mlの150mMグリシン塩酸塩
緩衝液,pH2.5と室温で5分間インキュベートしてpHを低下させた.遠心分
離(2000×g,15分)により血小板をペレット化し,PAA含有上清を集めて,
直ちに2mlの200mMリン酸塩緩衝液,pH7.5によってpH6.5に中和した.
(iv)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)による血小板抗原調製
血小板は,PRPからPBSで3回洗浄することによって誘導し,既述のよう
にPAGEにより[Laemmli U.K.,Nature,227,680(1970)],それらの分子
量に応じて分離した.関心分子量に応じて5%,10%または12.5%アクリルアミ
ド濃度を使用した.別法として,7.5〜15%アクリルアミド勾配ゲルを用いると
アクリルアミド濃度が均一な場合より良好な分離が達成された.
(v)ウエスタンブロット
電気泳動による移送の前に,ゲルから垂直の小切片を切り取り,クーマッシー
ブルーで染色してゲル電気泳動の成功を評価した.電気泳動による蛋白質移送の
ためには,ゲルをニトロセルロース,Whatmannろ紙4号およびホルダーとしての
パッドのシートの間に位置させた.移送は移送緩衝液(0.025Mトリス,0.192M
グリシン,0.1%SDS,20%メタノール,pH8.3)で充填したウエスタンブロ
ットセル(BioRad)中,室温で,冷却することなく,300mA(ミリアンペア)
において1時間実施した.
蛋白質の移送効率をモニタリングするため,ニトロセルロースシートを可逆的
結合染料Poinceau S.で染色した.二重蒸留水でPoinceau S.染色を除去したのち
,ニトロセルロースシートを風乾し,0.3cm幅のストリップに切断して使用時
まで乾燥状態で室温に保存した.
(vi)ウエスタンブロット解析
対照者(血液型O)からの血小板蛋白質を10%PAGEによって分離し,ニト
ロセルロースに上記(v)に記載のようにしてブロットした.インキュベーショ
ン工程はすべて,BioRadインキュベーショントレー中,室温で絶えず振盪しなが
ら(Bellco Rocking Table,速度セット4)実施した.サンプルストリップおよ
び陽性対照ストリップ(0.002mlヒト血清をドット)を1mlのブロック緩衝液[
インキュベーション緩衝液(60mMクエン酸,90mM Na2HPO4,200mM
NaCl,pH7.7)中に5%ミルク粉末を溶解,使用前にろ過]で30分間ブロ
ックした.ブロック緩衝液をついで注意深く(パスツールピペットで)除去し,
ストリップに1mlのインキュベーション緩衝液を補充した.ついでストリップに
サンプルとしてPAA(0.2ml)または血清(0.1ml)を添加し,14時間インキュ
ベートした.インキュベーション後,ストリップを1mlのインキュベーション緩
衝液によって15分間3回,ついで1mlのペルオキシダーゼ緩衝液(200mM Tris
,150mM KCI,0.3%Triton X-100,10mMのフェノール,2mM CaCl2
,使用前にろ過)により15分間1回洗浄した.ストリップを,1mlのペルオキ
シダーゼ緩衝液中,ペルオキシダーゼに共有結合で連結したウサギ抗−ヒトIg
G(1:1000に希釈)と2時間インキュベートした.このインキュベーション後に
,ストリップを1mlのインキュベーション緩衝液によって15分間3回,ついで1
mlのペルオキシダーゼ緩衝液により15分間1回洗浄した.結合したペルオキシダ
ーゼはストリップを1mlの発色試薬(12mgクロロナフトール,4mlメタノール,
20mlのPBS,0.005ml 30%H2O2)と30〜45分間インキュベートして可視化し
た.発色反応はストリップを二重蒸留水で洗浄して停止させた.
例1
10例の血液ドナー(図1A)および8例の慢性精神分裂病患者(図1B)から
のPAAを正常ヒト血小板蛋白質とインキュベートし,ゲル電気泳動で分離し,
上述のようにニトロセルロース上にブロットした.結合したPAAの肉眼検出は
上述のように実施した.結果は図1に示す.この場合,以下の分子量マーカー:
リゾチーム(14.4kD);トリプシンインヒビター(21.5kD);炭酸デヒドラター
ゼ(31kD);オバルブミン(45kD);血清アルブミン(66.2kD)およびホスホリ
ラーゼB(97.4kD)を用いた.10例の正常ドナーからのPAAにはバンドは観察
されなかった(図1A)が,慢性精神分裂病患者からの8例のPAAにはすべて
一連のバンドが検出された(図1B).
驚くべきことに,8例の精神分裂病患者のすべてに同一のパターンが観察され
た.分子量評価により確認された蛋白質には以下の相対分子量:35kD,43kD,47
kD,50kD,64kD,68kD,97kD,120kDを与えることができた.これらの分子量は
,構造血小板抗原に対する自己免疫疾患である突発性血小板減少性紫斑病(IT
P)に関与するよく知られた蛋白質とは一致しない.突発性血小板減少性紫斑病
(ITP)に関与する蛋白質は,プロテインIb(α−ユニット,128〜141kD;
β−ユニット,22kD),IIb(α−ユニット,132kD;β−ユニット,23kD)お
よびIIIa(95kD)である(Williams W.J.ら編,Hematology,4版,1990,McG
raw-Hill Inc.,1189および1382頁).精神分裂病患者からのPAAにも120kDの
抗原は認められるが,それらには22kDの抗原は認められないことに留意すべきで
ある.すなわち,本発明によって同定された精神分裂病患者からのPAAはIT
Pに関与するのとは同一の抗原ではないことを示している.さらに試験した精神
分裂病患者はすべてITPには罹患していなかった.
例2
4例の正常血液ドナー(図2B),4例の慢性精神分裂病患者(図2A)およ
び同様にPAAレベルの上昇が知られている疾患(Shinitzkyら,1991),アル
ツハイマー型または多発梗塞性痴呆患者4例について同様の実験を行った.図2
に示すように,痴呆患者からPAA(図1C)はウエスタンブロットで全く反応
を示さないが,4例の精神分裂病患者は4例すべてに共通のパターンを示してい
る(図1A).
例3
7.5〜15%アクリルアミド勾配ゲルを用い,10例の精神分裂病患者について実
験を行った.結果は図3に示す.この場合,10例の精神分裂病患者のPAAのウ
エスタンブロットは共通のパターンを示している(レーン1〜10).左側には分
子量マーカー(BioRad)の位置を示す.テーン11は血小板蛋白質のクーマッシー
ブルー染色を示す.
分子量評価によって,以下の相対分子量:17,18,21,24,26,35,40〜43,
47,50,55,68,76,82,95〜97(2つのバンド),105,120〜130,165〜175
がレーン1〜10に同定された蛋白質に帰属できた.
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