JP2020022382A - グルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】効率的なグルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造方法を提供すること。【解決手段】高濃度のリン酸塩、ＮａＣｌ、グリセリン又は硫酸塩等を含有する培地を使用する、グルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造方法を提供する。【選択図】図２
Description
本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造方法に関する。
グルコースデヒドロゲナーゼは、糖尿病マーカーである血中グルコース濃度（血糖値）の測定への応用が期待されるなど、産業上有用な酵素である。そのためグルコースデヒドロゲナーゼの効率的な工業生産、大規模生産が望まれている。
糖尿病の診断及び管理の手段として、自己血糖測定（ＳＭＢＧ）と持続血糖測定（ＣＧＭ）が重要である。ＳＭＢＧ機器に用いられるバイオセンサには、従来、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等のＤ−グルコースを基質とする酵素が利用されている。しかしながら、ＧＯＤは酸素を電子受容体とするという特性を備えているため、ＧＯＤを用いたＳＭＢＧ機器では、測定サンプル中の溶存酸素が測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない場合が起こりうる。一方、Ｄ−グルコースを基質とするが、酸素を電子受容体としない別の酵素として、各種のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨと表記することがある）が知られている。補酵素の添加を必要とせず、基質特異性が良好である点からＦＡＤ依存性ＧＤＨ（ＦＡＤ結合型ＧＤＨともいう。以下、ＦＡＤ−ＧＤＨと表記することがある）がＳＭＢＧに用いられている。例えば、特許文献１〜６には、アスペルギルス属やムコール属、ペニシリウム属、グロメラ属由来のＦＡＤ−ＧＤＨが報告されている。
近年は、個人差のある血糖変動をより正確に捉えるため、連続グルコースモニタリング（ＣＧＭ）システムの重要性が増している。ＣＧＭシステムは数日〜１、２週間の期間、血中グルコースレベルを測定することが出来る。ＣＧＭセンサにはＧＯＤが用いられている。
非特許文献１は、セロビオースデヒドロゲナーゼを用いた酵素センサについて、脱糖鎖により応答電流が上がる、すなわちセンサ感度が上がることを記載している。血糖測定センサに関しても、センサ感度が向上することにより、測定精度が高まり有用であるため、付加される糖鎖量が少ない酵素がより望ましい。
酵素の組換え製造方法として、真菌、例えばアスペルギルス属、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅやＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅでの組換え製造方法が広く行われてきた。グルコースデヒドロゲナーゼもアスペルギルス属、例えば麹菌での組換え産生が行われている例がある。
非特許文献２によると、カビ・酵母の培養に使用される一般的な培地として、ＭＹ培地、ＹＰＤ培地、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ（ＣＤ）培地が挙げられる。ＣＤ培地においては、ｐＨの緩衝剤としてリン酸水素二カリウムが１ｇ／ｌ添加される。これをモル濃度で表記すると、６ｍＭ程度である。また、ＤＰＹ培地も利用された例があり、ｐＨの緩衝剤としてリン酸水素二カリウムが５ｇ／ｌ（２９ｍＭ）添加される。これよりも大幅に高濃度でリン酸塩を培地に使用することは一般的ではないが、一部に報告例はある。
非特許文献３は、黄麹菌の液体培養による酵素生産について記載している。同文献は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅのプロテアーゼ産生に及ぼす食塩、リン酸一カリウムの影響について記載している。具体的には食塩（ＮａＣｌ）の濃度を０〜１．５Ｍ、リン酸一カリウムを０〜０．５Ｍや０．３Ｍといった濃度となるよう添加した場合のプロテアーゼ産生量の増大について報告されている。なお、このプロテアーゼは遺伝子組換え体による生産された酵素ではなく、宿主が本来保有する酵素である。
特許文献７はグルタミナーゼの生産方法を記載している。同文献には、アスペルギルス・ソーヤに属するグルタミナーゼ生産菌を培養しグルタミナーゼを生産するに際し、培地に２％以上のリン酸第一カリを添加して液体培養を行うことを特徴とするグルタミナーゼの生産方法の記載がある。なお、このグルタミナーゼは遺伝子組換え体による生産された酵素ではなく、宿主が本来保有する酵素である。
３０ｍＭを大幅に超える高濃度でリン酸塩を培地に使用することは一般的ではないが、上記のような報告例は、一部の酵素の微生物による製造方法については散見される。
グルコースデヒドロゲナーゼの真核生物宿主での組換え製造方法に、高濃度のリン酸塩や高濃度のＮａＣｌを用いることの報告例は見当たらない。フラビン結合型のグルコースデヒドロゲナーゼについては特にそうであり、糖鎖付加部位が１２箇所以下であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼについてはなおさらである。
Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ （２０１３） ４０５：３６３７−３６５８
実験応用生命科学、朝倉書店、２００５年第８刷
山崎ら、醤研ｖｏｌ．２２， Ｎｏ．１，１９９６
本発明は、生産効率の高い、或いは酵素産生量の高い、グルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、グルコースセンサとしての感度を高めるため、糖鎖付加量を減少させたグルコースデヒドロゲナーゼの産生を試みたところ、付加された糖鎖量の少ないグルコースデヒドロゲナーゼは糖鎖量の多いグルコースデヒドロゲナーゼと比べて、組み換えによる産生効率が低いことがわかった。この課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、一例として、アスペルギルス属の麹菌においてグルコースデヒドロゲナーゼの組換え産生する際に、一般的な培地と比較して、高濃度のリン酸塩を含有する培地を使用することで、酵素産生量、特に菌体外の酵素産生量が大幅に増加することを見出し、これを一実施形態として包含する本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下の実施形態を包含する。
［１］ リン酸塩、ＮａＣｌ、グリセリン、硫酸塩、アルギニン塩からなる群より選択される、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用する工程を含む、糸状菌を宿主として用いたグルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造方法。
［２］ リン酸塩が、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸アンモニウム又はこれらの組み合わせであるか、或いは、硫酸塩が硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム又はこれらの組み合わせである、或いはアルギニン塩がアルギニン塩酸塩である、実施形態１に記載の製造方法。
［３］ （ｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、リン酸塩であり、リン酸塩についてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として２００ｍＭ〜１Ｍである、
（ｉｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、ＮａＣｌであり、ＮａＣｌについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として５ｍＭ〜１Ｍである、
（ｉｉｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、硫酸マグネシウムであり、硫酸マグネシウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として３００ｍＭ〜１Ｍである、
（ｉｖ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、リン酸アンモニウムであり、リン酸アンモニウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として２００ｍＭ〜１Ｍである、
（ｖ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、グリセリンであり、グリセリンについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として２．５〜１０重量％である、
（ｖｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、硫酸アンモニウムであり、硫酸アンモニウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として３００ｍＭ〜１Ｍである、又は
（ｖｉｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、アルギニン塩酸塩であり、アルギニン塩酸塩についてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として１００ｍＭ〜１Ｍである、
実施形態１または２に記載の製造方法。
［４］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態１〜３のいずれかに記載の製造方法。
［５］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が１２箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態１〜４のいずれかに記載の製造方法。
［６］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が１０箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態５に記載の製造方法。
［７］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が８箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態６に記載の製造方法。
［８］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、ムコール属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態４〜７のいずれかに記載の製造方法。
［９］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、野生型遺伝子から改変された遺伝子によりコードされるムコール属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態８に記載の製造方法。
［１０］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体に関し、そのアミノ酸配列中の糖鎖付加部位であるアミノ酸残基が、糖鎖付加されないアミノ酸残基に置換されているグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態９に記載の製造方法。
［１１］ グルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造を行う宿主がアスペルギルス属の宿主である、実施形態１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
［１２］ 宿主がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）又はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）である、実施形態１１に記載の製造方法。
［１３］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体が、配列番号５のアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態１０に記載の製造方法。
［１４］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体が、配列番号５のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態１０に記載の製造方法。
［１５］ グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含まない培地、又は、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物をグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度未満の濃度であって通常の濃度で含む培地を用いてグルコースデヒドロゲナーゼを産生した場合と比較して、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量が、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用した場合に、菌体外のグルコースデヒドロゲナーゼ活性が２倍以上増大する、実施形態１〜１４のいずれかに記載の製造方法。
［１６］ グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含まない培地、又は、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物をグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度未満の濃度であって通常の濃度で含む培地を用いてグルコースデヒドロゲナーゼを産生した場合と比較して、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量が、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用した場合に、菌体外のグルコースデヒドロゲナーゼ活性が６倍以上増大する、実施形態１５に記載の製造方法。
［１］ リン酸塩、ＮａＣｌ、グリセリン、硫酸塩、アルギニン塩からなる群より選択される、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用する工程を含む、糸状菌を宿主として用いたグルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造方法。
［２］ リン酸塩が、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸アンモニウム又はこれらの組み合わせであるか、或いは、硫酸塩が硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム又はこれらの組み合わせである、或いはアルギニン塩がアルギニン塩酸塩である、実施形態１に記載の製造方法。
［３］ （ｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、リン酸塩であり、リン酸塩についてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として２００ｍＭ〜１Ｍである、
（ｉｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、ＮａＣｌであり、ＮａＣｌについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として５ｍＭ〜１Ｍである、
（ｉｉｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、硫酸マグネシウムであり、硫酸マグネシウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として３００ｍＭ〜１Ｍである、
（ｉｖ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、リン酸アンモニウムであり、リン酸アンモニウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として２００ｍＭ〜１Ｍである、
（ｖ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、グリセリンであり、グリセリンについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として２．５〜１０重量％である、
（ｖｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、硫酸アンモニウムであり、硫酸アンモニウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として３００ｍＭ〜１Ｍである、又は
（ｖｉｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、アルギニン塩酸塩であり、アルギニン塩酸塩についてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として１００ｍＭ〜１Ｍである、
実施形態１または２に記載の製造方法。
［４］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態１〜３のいずれかに記載の製造方法。
［５］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が１２箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態１〜４のいずれかに記載の製造方法。
［６］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が１０箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態５に記載の製造方法。
［７］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が８箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態６に記載の製造方法。
［８］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、ムコール属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態４〜７のいずれかに記載の製造方法。
［９］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、野生型遺伝子から改変された遺伝子によりコードされるムコール属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態８に記載の製造方法。
［１０］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体に関し、そのアミノ酸配列中の糖鎖付加部位であるアミノ酸残基が、糖鎖付加されないアミノ酸残基に置換されているグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態９に記載の製造方法。
［１１］ グルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造を行う宿主がアスペルギルス属の宿主である、実施形態１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
［１２］ 宿主がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）又はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）である、実施形態１１に記載の製造方法。
［１３］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体が、配列番号５のアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態１０に記載の製造方法。
［１４］ 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体が、配列番号５のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態１０に記載の製造方法。
［１５］ グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含まない培地、又は、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物をグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度未満の濃度であって通常の濃度で含む培地を用いてグルコースデヒドロゲナーゼを産生した場合と比較して、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量が、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用した場合に、菌体外のグルコースデヒドロゲナーゼ活性が２倍以上増大する、実施形態１〜１４のいずれかに記載の製造方法。
［１６］ グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含まない培地、又は、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物をグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度未満の濃度であって通常の濃度で含む培地を用いてグルコースデヒドロゲナーゼを産生した場合と比較して、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量が、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用した場合に、菌体外のグルコースデヒドロゲナーゼ活性が６倍以上増大する、実施形態１５に記載の製造方法。
本発明の効果として、効率的にグルコースデヒドロゲナーゼを組換え産生することができる。
ある実施形態において、本発明はグルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造方法（産生方法ともいう。以下同じ。）を提供する。
ある実施形態において、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの組換え産生（組換え製造ともいう。以下同じ。）には、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含む培地を使用する。ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物は、リン酸塩、ＮａＣｌ、グリセリン、硫酸塩、アルギニン塩及びこれらの組み合わせからなる群より選択されうるがこれに限らない。別の実施形態において、リン酸塩は、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸アンモニウム及びこれらの組み合わせからなる群より選択されうるがこれに限らない。別の実施形態において、硫酸塩は硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム及びこれらの組み合わせからなる群より選択されうるがこれに限らない。別の実施形態において、アルギニン塩はアルギニン塩酸塩であり得る。
グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物は、ＬＢ培地やＮＢ培地やＳＣＤ培地やＣＤ培地やＤＰＹ培地のような一般的な培地において使用される濃度と比較して、高い濃度、例えば大幅に高い濃度で使用することができる。具体的には、一般的な培地であるＤＰＹ培地にはリン酸水素二カリウムが５ｇ／ｌ添加されるが（２９ｍＭ）、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造方法に用いる培地には、リン酸水素二カリウムを、培地中の終濃度が、例えば２００ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、８００ｍＭ以上、９００ｍＭ以上、１０００ｍＭ以上、１，１００ｍＭ以上、例えば１，２００ｍＭ以上、となるように使用しうる。他のグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物についても同様である。
すなわち、本発明において、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物、例えばリン酸塩、ＮａＣｌ、グリセリン、硫酸塩、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム又はアルギニン塩酸塩は、終濃度が、例えば２００ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、８００ｍＭ以上、９００ｍＭ以上、１０００ｍＭ以上、１，１００ｍＭ以上、例えば１，２００ｍＭ以上、例えば２００ｍＭ〜１，２００ｍＭ（両端含む、以下同じ）、３００ｍＭ〜１，１００ｍＭ、４００ｍＭ〜１，０００ｍＭ、５００ｍＭ〜１０００ｍＭ、６００ｍＭ〜１０００ｍＭ、５００ｍＭ〜９００ｍＭ、６００ｍＭ〜８００ｍＭとなるように使用しうるが濃度はこれに限らない。ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物の組み合わせが使用される場合には、上記の終濃度は、組み合わせを構成する各化合物のそれぞれの終濃度である。別の実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物の組み合わせが使用される場合には、上記の終濃度は、組み合わせを構成する各化合物の終濃度の合計である。
ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼの組換え産生には、ＮａＣｌを、培地中の終濃度が、例えば５ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、８００ｍＭ以上、９００ｍＭ以上、例えば１Ｍ以上、例えば５ｍＭ〜１，０００ｍＭ（両端含む、以下同じ）、１０ｍＭ〜９００ｍＭ、２０ｍＭ〜８００ｍＭ、３０ｍＭ〜７００ｍＭ、４０ｍＭ〜６００ｍＭ、５０〜５００ｍＭ、１００〜４００ｍＭ、２００〜３００ｍＭ、４００〜１０００ｍＭ、５００〜１０００ｍＭ、６００〜９００ｍＭ、７００〜８００ｍＭとなるように使用し得る。
ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼの組換え産生には、アルギニン塩酸塩を、培地中の終濃度が、例えば１００ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、８００ｍＭ以上、９００ｍＭ以上、例えば１Ｍ以上、例えば３００ｍＭ〜１，０００ｍＭ（両端含む、以下同じ）、４００ｍＭ〜９００ｍＭ、５００ｍＭ〜８００ｍＭ、６００ｍＭ〜７００ｍＭとなるように使用し得る。
ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼの組換え産生には、グリセリンを、培地中の終濃度が、例えば２．５重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％以上、例えば２．５〜１０重量％（両端含む、以下同じ）、３〜１０重量％、５〜１０重量％、６〜１０重量％、７〜１０重量％、８〜１０重量％、４〜９重量％、５〜８重量％、６〜７重量％となるように使用し得る。
ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼの組換え産生には、リン酸一カリウム及びリン酸二カリウムを、それらの合計の培地中の終濃度が、例えば４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、８００ｍＭ以上、９００ｍＭ以上、例えば１Ｍ以上、例えば４０ｍＭ〜１，０００ｍＭ（両端含む、以下同じ）、５０ｍＭ〜９００ｍＭ、１００ｍＭ〜８００ｍＭ、２００ｍＭ〜７００ｍＭ、３００ｍＭ〜６００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、５００ｍＭ〜１０００ｍＭ、６００ｍＭ〜１０００ｍＭとなるように使用し得る。なお、リン酸一カリウム及びリン酸二カリウムの添加する比率を適宜調整することで、培地中のｐＨを適宜調整することができる。
ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼの組換え産生には、リン酸一ナトリウム及びリン酸二ナトリウムを、それらの合計の培地中の終濃度が、例えば４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、８００ｍＭ以上、９００ｍＭ以上、例えば１Ｍ以上、例えば４０ｍＭ〜１，０００ｍＭ（両端含む、以下同じ）、５０ｍＭ〜９００ｍＭ、１００ｍＭ〜８００ｍＭ、２００ｍＭ〜７００ｍＭ、３００ｍＭ〜６００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、５００ｍＭ〜１０００ｍＭ、６００ｍＭ〜１０００ｍＭとなるように使用し得る。なお、リン酸一ナトリウム及びリン酸二ナトリウムの添加する比率を適宜調整することで、培地中のｐＨを適宜調整することができる。
ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼの組換え産生には、リン酸アンモニウムを、培地中の終濃度が、例えば４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、８００ｍＭ以上、９００ｍＭ以上、例えば１Ｍ以上、例えば４０ｍＭ〜１，０００ｍＭ（両端含む、以下同じ）、５０ｍＭ〜９００ｍＭ、５０〜８００ｍＭ、５０〜６００ｍＭ、５０〜４００ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００ｍＭ〜８００ｍＭ、１００〜６００ｍＭ、１００〜４００ｍＭ、１００〜２００ｍＭ、２００ｍＭ〜７００ｍＭ、３００ｍＭ〜６００ｍＭ、４００〜５００ｍＭとなるように使用し得る。
ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼの組換え産生には、硫酸アンモニウムを、培地中の終濃度が、例えば３００ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、８００ｍＭ以上、９００ｍＭ以上、例えば１Ｍ以上、例えば３００ｍＭ〜１，０００ｍＭ（両端含む、以下同じ）、４００〜１０００ｍＭ、６００〜１０００ｍＭ、８００〜１０００ｍＭ、４００ｍＭ〜９００ｍＭ、５００ｍＭ〜８００ｍＭ、６００ｍＭ〜７００ｍＭとなるように使用し得る。
ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼの組換え産生には、硫酸マグネシウムを、培地中の終濃度が、例えば３００ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、８００ｍＭ以上、９００ｍＭ以上、例えば１Ｍ以上、例えば３００ｍＭ〜１，０００ｍＭ（両端含む、以下同じ）、４００〜１０００ｍＭ、６００〜１０００ｍＭ、８００〜１０００ｍＭ、４００ｍＭ〜９００ｍＭ、５００ｍＭ〜８００ｍＭ、６００ｍＭ〜７００ｍＭとなるように使用し得る。
グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物に関し、上記の濃度を、本明細書において、便宜上、「グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度」、という。グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度で培地に使用すると、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含まない又は実質的に含まない場合や、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度未満でしかグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含まない場合と比較して、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量が増大する。産生量の増大は、菌体外ＧＤＨ活性により評価する（Ｕ／ｍｌ培地）。より具体的には、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含まない培地、又は、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物をグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度未満の濃度であって通常の濃度で含む培地を用いてグルコースデヒドロゲナーゼを産生した場合と比較して、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用した場合に、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量は２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、例えば８倍以上、増大し得る。
ある実施形態において、組換え産生に使用される宿主は、真菌、例えばアスペルギルス属、例えばＡ． ｏｒｙｚａｅ、Ａ． ｓｏｊａｅ、Ａ． ｎｉｇｅｒ、Ａ． ｔｅｒｒｅｕｓ等、例えば麹菌でありうるがこれに限らない。
ある実施形態において、産生されるグルコースデヒドロゲナーゼは、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである（以下、ＦＡＤ−ＧＤＨと表記することがある）。ある実施形態において、産生されるグルコースデヒドロゲナーゼは、ムコール属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである。ある実施形態において、産生されるグルコースデヒドロゲナーゼは、野生型グルコースデヒドロゲナーゼである。ある実施形態において、産生されるグルコースデヒドロゲナーゼは、野生型グルコースデヒドロゲナーゼから改変されたグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である。変異体の基となる野生型グルコースデヒドロゲナーゼは、例えば配列番号１のグルコースデヒドロゲナーゼであり得る。ある実施形態において、前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体は、そのアミノ酸配列中の糖鎖付加部位のアミノ酸を糖鎖付加されるアミノ酸以外のアミノ酸に置換されたグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である。ある実施形態において、産生されるグルコースデヒドロゲナーゼ変異体は、糖鎖量低減型のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である。糖鎖量低減型のグルコースデヒドロゲナーゼとは、野生型グルコースデヒドロゲナーゼと比較して、付加される糖鎖量が少ないグルコースデヒドロゲナーゼをいう。
真核生物由来のグルコースデヒドロゲナーゼ、例えばムコール属由来のグルコースデヒドロゲナーゼは、真核生物において発現される際に、Ｎ型糖鎖付加部位としてＮ−Ｘ−（Ｔ／Ｓ）モチーフのアミノ酸が糖鎖修飾されることが知られている（ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸）。モチーフ中の第３アミノ酸はトレオニンでもセリンでもよい。当該モチーフ中のＮ（アスパラギン）がＮ以外のアミノ酸残基に改変されると、又は、モチーフ中のＴ若しくはＳが、トレオニンでもセリンでもないアミノ酸残基に改変されると、又は、モチーフ中の−Ｘ−がプロリンに改変されると、一般に当該部位には糖鎖が付加されない。
ムコール属由来のグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示す。糖鎖付加部位の改変としては、配列番号１の２５位、１０１位、１５６位、１９８位、２１４位、２５６位、２６８位、３５３位、３６５位、３７９位、４０１位、４１７位、４３０位、４５９位、４９６位、及び５５０位からなる群より選択される１以上の位置におけるアスパラギン以外のアミノ酸への置換、
配列番号１の２７位、１０３位、１５８位、２００位、２１６位、２５８位、２７０位、３５５位、３６７位、３８１位、４０３位、４１９位、４３２位、４６１位、４９８位、及び５５２位からなる群より選択される１以上の位置における、セリン及びトレオニン以外のアミノ酸への置換、並びに
配列番号１の２６位、１０２位、１５７位、１９９位、２１５位、２５７位、２６９位、３５４位、３６６位、３８０位、４０２位、４１８位、４３１位、４６０位、４９７位及び５５１位からなる群より選択される１以上の位置のアミノ酸のプロリンへの置換が挙げられる。糖鎖付加部位を改変された変異体は、このようなアミノ酸置換を１以上、例えば１〜４８、１〜４０、１〜３４、２〜２５、３〜２０、例えば４〜１４有し得る。
配列番号１の２７位、１０３位、１５８位、２００位、２１６位、２５８位、２７０位、３５５位、３６７位、３８１位、４０３位、４１９位、４３２位、４６１位、４９８位、及び５５２位からなる群より選択される１以上の位置における、セリン及びトレオニン以外のアミノ酸への置換、並びに
配列番号１の２６位、１０２位、１５７位、１９９位、２１５位、２５７位、２６９位、３５４位、３６６位、３８０位、４０２位、４１８位、４３１位、４６０位、４９７位及び５５１位からなる群より選択される１以上の位置のアミノ酸のプロリンへの置換が挙げられる。糖鎖付加部位を改変された変異体は、このようなアミノ酸置換を１以上、例えば１〜４８、１〜４０、１〜３４、２〜２５、３〜２０、例えば４〜１４有し得る。
配列番号１のアミノ酸配列において、糖鎖修飾される可能性のあるＮ−Ｘ−Ｔ／Ｓモチーフは、２５〜２７位、１０１〜１０３位、１５６〜１５８位、１９８〜２００位、位、２１４〜２１６位、位、２５６〜２５８位、２６８〜２７０位、３５３〜３５５位、３６５〜３６７位、３７９〜３８１位、４０１〜４０３位、４１７〜４１９位、４３０〜４３２位、４５９〜４６１位、４９６〜４９８位、５５０〜５５２位である（配列番号１における位置）。例えば２５〜２７位のモチーフでは、２５位、２６位、２７位のいずれかに上記のアミノ酸置換が導入されると、２５〜２７位は糖鎖修飾を受けないと考えられる。そこで２５〜２７位のモチーフは一つのまとまりとして、アミノ酸置換を１つ導入すればよい。１０１〜１０３位などの他の位置のモチーフについても同様である。上記のモチーフに関し、例えば１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、例えば１６のモチーフに変異が導入されうる。
ある実施形態において、前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体に関し、糖鎖付加部位が１２箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼ変異体が産生される。
ある実施形態において、前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体に関し、糖鎖付加部位が１０箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼ変異体が産生される。
ある実施形態において、前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体に関し、糖鎖付加部位が９箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼ変異体が産生される。
ある実施形態において、前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体に関し、糖鎖付加部位が８箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼ変異体が産生される。
ある実施形態において、産生されるグルコースデヒドロゲナーゼ変異体は、Ｓ２７Ａ、Ｓ１０３Ｑ、１４３〜１４５位への変異、１５６〜１５８位への変異、１７２〜１７４位への変異、１９８〜２００位への変異、２０５〜２０７位への変異、２１４〜２１６位への変異、２４７〜２４９位への変異、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２６８Ｓ、Ｎ３５３Ｄ、Ｎ３６５Ｄ、３７９〜３８１位への変異、Ｎ４０１Ｒ、４０２〜４０４位への変異、Ｎ４１７Ｒ又はＮ４１７Ｉ、４３０〜４３２位への変異、４５９〜４６１位への変異、Ｎ４９６Ｒ又はＮ４９６Ｌ、５５０〜５５２位への変異、からなる群より選択される変異を、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、例えば１６有しうる。
ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が１２箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼが産生される。
ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が１０箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼが産生される。
ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が９箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼが産生される。
ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が８箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼが産生される。例えば、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ ＮＢＲＣ１０７０００由来ＦＡＤ−ＧＤＨの糖鎖付加部位は４箇所である（特許文献６参照）。
本発明に使用可能な培地組成の例を示すが、組成はこれに限らない。
培地組成１
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸２水素カリウム ４．６％
リン酸水素２カリウム ４．６％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
培地組成１
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸２水素カリウム ４．６％
リン酸水素２カリウム ４．６％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
培地組成２
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸２水素カリウム １．５％
リン酸水素２カリウム １．５％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸２水素カリウム １．５％
リン酸水素２カリウム １．５％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
培地組成３
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸２水素カリウム ７．６％
リン酸水素２カリウム ７．６％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸２水素カリウム ７．６％
リン酸水素２カリウム ７．６％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
培地組成４
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
リン酸２水素ナトリウム １．５％
リン酸水素２ナトリウム １．５％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
リン酸２水素ナトリウム １．５％
リン酸水素２ナトリウム １．５％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
培地組成５
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
リン酸２水素ナトリウム ４．６％
リン酸水素２ナトリウム ４．６％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
リン酸２水素ナトリウム ４．６％
リン酸水素２ナトリウム ４．６％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
培地組成６
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
リン酸２水素ナトリウム ７．７％
リン酸水素２ナトリウム ７．７％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
リン酸２水素ナトリウム ７．７％
リン酸水素２ナトリウム ７．７％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
培地組成７
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
ＮａＣｌ ０．３％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
ＮａＣｌ ０．３％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
培地組成８
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
ＮａＣｌ ２．９％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
ＮａＣｌ ２．９％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
培地組成９
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
ＮａＣｌ ５．８％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
ＮａＣｌ ５．８％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
培地組成１０
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
グリセリン １０％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
グリセリン １０％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
培地組成１１
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
リン酸アンモニウム ２．６％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
リン酸アンモニウム ２．６％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
培地組成１２
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
硫酸アンモニウム １３．２％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
硫酸アンモニウム １３．２％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％
しょうゆ油 ０．４０％
培地組成１３
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
硫酸マグネシウム・７水和物 ２４．６％
しょうゆ油 ０．４０％
パインデックス＃２ ２％
ハイポリペプトン ２％
酵母エキス １％
リン酸１カリウム ０．２５％
リン酸２カリウム ０．２５％
硫酸マグネシウム・７水和物 ２４．６％
しょうゆ油 ０．４０％
（ＦＡＤ−ＧＤＨの作用原理および活性測定法）
ＦＡＤ−ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。ＦＡＤ−ＧＤＨの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の系を用いて測定することができる。
（反応１） Ｄ−グルコ−ス ＋ ＰＭＳ（酸化型）
→ Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン ＋ ＰＭＳ（還元型）
（反応２） ＰＭＳ（還元型） ＋ ＤＣＩＰ（酸化型）
→ ＰＭＳ（酸化型） ＋ ＤＣＩＰ（還元型）
ＦＡＤ−ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。ＦＡＤ−ＧＤＨの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の系を用いて測定することができる。
（反応１） Ｄ−グルコ−ス ＋ ＰＭＳ（酸化型）
→ Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン ＋ ＰＭＳ（還元型）
（反応２） ＰＭＳ（還元型） ＋ ＤＣＩＰ（酸化型）
→ ＰＭＳ（酸化型） ＋ ＤＣＩＰ（還元型）
（反応１）において、グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合を波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
ＦＡＤ−ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定する。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ２．０５ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース溶液 ０．６ｍＬおよび２ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．１ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出する。この際、ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
（ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列）
ある実施形態において、ＦＡＤ−ＧＤＨは、配列番号５のアミノ酸配列を有するものであり得る。別の実施形態において、ＦＡＤ−ＧＤＨは、該アミノ酸配列において１もしくは数個（例えば２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個又は２個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものであり得る。別の実施形態において、ＦＡＤ−ＧＤＨは、配列番号５において１５６〜１５８位への変異、１９８〜２００位への変異、２１４〜２１６位への変異、２４７〜２４９位への変異、２５６〜２５８位への変異、３７９〜３８１位への変異、４３０〜４３２位への変異、４５９〜４６１位への変異、５５０〜５５２位への変異、からなる群より選択される変異を、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、例えば９以上有しうる。
ある実施形態において、ＦＡＤ−ＧＤＨは、配列番号５のアミノ酸配列を有するものであり得る。別の実施形態において、ＦＡＤ−ＧＤＨは、該アミノ酸配列において１もしくは数個（例えば２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個又は２個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものであり得る。別の実施形態において、ＦＡＤ−ＧＤＨは、配列番号５において１５６〜１５８位への変異、１９８〜２００位への変異、２１４〜２１６位への変異、２４７〜２４９位への変異、２５６〜２５８位への変異、３７９〜３８１位への変異、４３０〜４３２位への変異、４５９〜４６１位への変異、５５０〜５５２位への変異、からなる群より選択される変異を、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、例えば９以上有しうる。
また、ＦＡＤ−ＧＤＨにおいて、アミノ酸配列が配列番号５のアミノ酸配列を有することが重要であり、それが天然から取得されたものか、人工合成による配列であるかを問わない。例えばＧＤＨは、発現宿主に応じてコドン最適化された遺伝子によりコードされるものであり得る。
（ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子）
ある実施形態において、ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子は、配列番号６の塩基配列を有するものであり得る。遺伝子は全合成されたものでもよく、または天然配列を取得して変異を導入し作製したものでもよい。また、その改変体を遺伝子工学的手法により作製しうる。
ある実施形態において、ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子は、配列番号６の塩基配列を有するものであり得る。遺伝子は全合成されたものでもよく、または天然配列を取得して変異を導入し作製したものでもよい。また、その改変体を遺伝子工学的手法により作製しうる。
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法 （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社、ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。
また、一般的なポリメラーゼチェインリアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を合成することもできる。
ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定又は確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いれば良い。
（ＦＡＤ−ＧＤＨの由来となる天然型ＦＡＤ−ＧＤＨの例）
ＦＡＤ−ＧＤＨは、他の公知のＦＡＤ−ＧＤＨより取得することもできる。公知のＦＡＤ−ＧＤＨの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属由来のＦＡＤ−ＧＤＨ等が挙げられる。または、アスペルギルス属、ペニシリウム属、グロメラ属由来のＦＡＤ−ＧＤＨが挙げられる。
ＦＡＤ−ＧＤＨは、他の公知のＦＡＤ−ＧＤＨより取得することもできる。公知のＦＡＤ−ＧＤＨの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属由来のＦＡＤ−ＧＤＨ等が挙げられる。または、アスペルギルス属、ペニシリウム属、グロメラ属由来のＦＡＤ−ＧＤＨが挙げられる。
Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｍｕｃｏｒ ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ． ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ ｆ． ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ、Ｍｕｃｏｒ ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ等が挙げられる。より具体的には、Ｍｕｃｏｒ ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ． ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ ＮＢＲＣ９４０３、Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ、Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ ｆ． ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ ＮＢＲＣ６７５４、Ｍｕｃｏｒ ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ ＮＢＲＣ６３３８、Ｍｕｃｏｒ ＲＤ０５６８６０、Ｍｕｃｏｒ ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ ＮＢＲＣ５３９５等が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｂｓｉｄｉａ ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ ｅｌｅｇａｎｓを挙げることができる。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａを挙げることができる。より具体的には、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ ＮＢＲＣ６４４８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ５８４２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２３及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２を挙げることができる。なお、ＮＢＲＣ菌株およびＲＤ菌株はＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）の保管菌株である。
（ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子が挿入されたベクターおよび宿主細胞）
上述のように得られたＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
上述のように得られたＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
真核宿主細胞の一例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属のようなカビ細胞が挙げられる。カビ細胞の形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、ＧＤＨをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法が挙げられる。具体的には、ＧＤＨをコードする遺伝子を発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いでＧＤＨをコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主糸状菌を形質転換することにより、ＧＤＨをコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主糸状菌を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター−ＧＤＨをコードする遺伝子−ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
ＧＤＨをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主糸状菌内に導入する手法などが挙げられる。
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主糸状菌のゲノム中に挿入することができる。自身の高発現プロモーター制御下で宿主糸状菌内で過剰発現することにより、セルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域などが挙げられる。
ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、糸状菌の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主糸状菌を常法により形質転換することができる。
そのような、好適なベクター−宿主系としては、宿主糸状菌中でＧＤＨを生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１８， ９９−１０４， １９８９）及び糸状菌の系などが挙げられる。
ＤＮＡコンストラクトは宿主糸状菌の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９， １１３３ （１９９５））にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢオリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞中でＧＤＨをコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
ＤＮＡコンストラクトにおいて、ＧＤＨをコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入するＧＤＨをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
ＤＮＡコンストラクトの一実施態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、ＧＤＨをコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主糸状菌のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１８， ９９−１０４， １９８９、特開２００７−２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換糸状菌を再生させるための培地は、用いる宿主糸状菌と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主糸状菌としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換糸状菌の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社）で行うことができる。
また、例えば、本発明の形質転換糸状菌を得るために、相同組換えを利用して、宿主糸状菌が本来染色体上に有するＧＤＨをコードする遺伝子のプロモーターをｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開２０１１−２３９６８１に記載の実施例１や図１を参照して、ＧＤＨをコードする遺伝子の上流領域−形質転換マーカー遺伝子−高発現プロモーター−ＧＤＨをコードする遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、ＧＤＨをコードする遺伝子の上流領域及びＧＤＨをコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために利用される。ＧＤＨをコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好ましい。
本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、ＧＤＨの酵素活性が認められる条件下で本発明の形質転換糸状菌を培養し、次いで培養後に得られた培養物におけるＧＤＨの活性を確認することにより行うことができる。
また、本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、形質転換糸状菌から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。
例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
（ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素の製造方法）
ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素は、上述のように取得したＦＡＤ−ＧＤＨを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からＦＡＤ−ＧＤＨを単離することにより製造すればよい。
ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素は、上述のように取得したＦＡＤ−ＧＤＨを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からＦＡＤ−ＧＤＨを単離することにより製造すればよい。
上記宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、０〜２０ｍＭ程度の塩化ナトリウム、０〜３０ｍＭ程度のリン酸第１カリウム、０〜３０ｍＭ程度のリン酸第２カリウム、０〜２０ｍＭ程度の硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。なお、ここでいう塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩類は、宿主細胞を培養する培地に通常使用される０〜３０ｍＭといった濃度で培地ｐＨの緩衝剤や浸透圧の調整剤として使用されるものであり、必ずしもグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させるためのものではない。便宜上、本明細書においてこれを「通常の濃度」ということがある。したがってこれらの無機塩類の０〜３０ｍＭといった「通常の濃度」での使用は、本明細書にいう「グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度」での、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物の使用とは区別されるものとする。
培地の初発ｐＨは、限定されないが、例えば、ｐＨ５〜９に調整することができる。培養は、１０〜４２℃の培養温度、好ましくは３０℃前後の培養温度で４時間〜１週間、さらに好ましくは３０℃前後の培養温度で１日〜５日間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。
培養終了後、該培養物よりＦＡＤ−ＧＤＨ酵素を採取する。これには、通常の公知の酵素採取手段を用いればよい。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、もしくはリゾチームやヤタラーゼ等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、ＦＡＤ−ＧＤＨの粗酵素を得る。または、培地中に分泌された酵素を採取することも出来る。
ＦＡＤ−ＧＤＨの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたＦＡＤ−ＧＤＨ酵素標品を得ることができる。
（ＦＡＤ−ＧＤＨを用いたグルコース測定方法）
グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のよう行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはＦＡＤ−ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電子受容体より電子を受け取ることによって重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作成したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のよう行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはＦＡＤ−ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電子受容体より電子を受け取ることによって重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作成したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
この方法において使用できるメディエーター及び発色試薬としては、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を電子受容体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。使用可能な電子受容体および発色試薬はこれらに限定されない。
特定の理論に拘束されるものではないが、リン酸塩やＮａＣｌを培地中で通常よりも高濃度で使用することによりグルコースデヒドロゲナーゼの産生量が増大するのは、次の理由によるものと考えられる。すなわち、グルコースデヒドロゲナーゼへの改変を繰り返し、糖鎖付加部位を例えば６箇所、７箇所、又は８箇所など変異させることにより、付加される糖鎖量を低減すると、変異体酵素同士が凝集したり、細胞壁に吸着するなどして、培養中に発現された酵素が失活しやすいと考えられる。このとき、培地中に塩を高濃度にて添加することで、凝集や吸着を緩和し、酵素が分散された状態を維持することができ、結果的に産生量が増大すると考えられる。
したがって、糖鎖が付加しないように改変した糖鎖量低減型のグルコースデヒドロゲナーゼについては、多数存在する糖鎖付加部位のうち、いずれの糖鎖付加部位が変異により改変されたとしても、グルコースデヒドロゲナーゼ全体としての糖鎖付加量が低減される限り、凝集や吸着によりその変異体の産生量は、未改変の酵素と比較して低くなり得る。そしてそのような糖鎖量低減型のグルコースデヒドロゲナーゼ全般について、本明細書に記載のグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含む培地を使用することにより、産生量を増大させることができる、と合理的に考えられる。また、野生型のグルコースデヒドロゲナーゼのうち、糖鎖付加部位が１２箇所以下である酵素を生産する際には同様の課題が起こり得る。そのような場合においても、本明細書に記載のグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含む培地を使用することにより、産生量を増大させることができる、と合理的に考えられる。
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
１．Ｍｕｃｏｒ属由来ＧＤＨ遺伝子の宿主への導入と発現
まずＭｕｃｏｒ属由来ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ、配列番号１）にＮ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ／Ｃ８８Ａ／Ａ１７５Ｃ／Ｓ１９２Ｐ／Ｓ１９６Ｎ／Ｉ２１２Ｌ／Ｎ２１４Ｃ／Ａ２１８Ｈ／Ｉ２２６Ｔ／Ｄ２２８Ｎ／Ｅ２３０Ｑ／Ｖ２３２Ａ／Ｑ２３３Ｒ／Ｖ２３５Ａ／Ｔ２３９Ａ／Ｔ３８７Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｅ５５４Ｄ／Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋの変異を導入した改変ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ−Ｍ３）をコードする遺伝子を取得した（以下、単にＭ３ということがある）。上記において、例えば「Ｎ６６Ｙ」は、配列番号１の６６位のアスパラギンがチロシンに置換されていることを意味する。また「／」記号で並列されたアミノ酸置換はそのすべての置換を有することを意味する。ＭｐＧＤＨ−Ｍ３のアミノ酸配列は配列番号３に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号４に示す。次に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、キットに添付されたプロトコールに従って、プラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅに、対象遺伝子であるＭｐＧＤＨ−Ｍ３遺伝子を連結して、コンストラクト用プラスミド（ｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ３）を得た。
まずＭｕｃｏｒ属由来ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ、配列番号１）にＮ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ／Ｃ８８Ａ／Ａ１７５Ｃ／Ｓ１９２Ｐ／Ｓ１９６Ｎ／Ｉ２１２Ｌ／Ｎ２１４Ｃ／Ａ２１８Ｈ／Ｉ２２６Ｔ／Ｄ２２８Ｎ／Ｅ２３０Ｑ／Ｖ２３２Ａ／Ｑ２３３Ｒ／Ｖ２３５Ａ／Ｔ２３９Ａ／Ｔ３８７Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｅ５５４Ｄ／Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋの変異を導入した改変ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ−Ｍ３）をコードする遺伝子を取得した（以下、単にＭ３ということがある）。上記において、例えば「Ｎ６６Ｙ」は、配列番号１の６６位のアスパラギンがチロシンに置換されていることを意味する。また「／」記号で並列されたアミノ酸置換はそのすべての置換を有することを意味する。ＭｐＧＤＨ−Ｍ３のアミノ酸配列は配列番号３に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号４に示す。次に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、キットに添付されたプロトコールに従って、プラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅに、対象遺伝子であるＭｐＧＤＨ−Ｍ３遺伝子を連結して、コンストラクト用プラスミド（ｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ３）を得た。
次に、ＭｐＧＤＨ−Ｍ３を鋳型として糖鎖付加部位を２〜８箇所改変した表１に記載のＧＤＨをコードする遺伝子をそれぞれ取得し、上記と同様の手順でコンストラクト用プラスミドを得た。
得られた遺伝子を用いて、下記の手順で、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ； アスペルギルス・ソーヤ）の形質転換を行い発現させた。Ｄｏｕｂｌｅ−ｊｏｉｎｔ ＰＣＲ（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４年，第４１巻，ｐ９７３−９８１）を行い、５’アーム領域〜ＰｙｒＧ遺伝子（ウラシル栄養要求性マーカー）〜ＴＥＦ１プロモーター遺伝子〜フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子〜３’アーム領域から成るカセットを構築し、下記の手順でアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）の形質転換に用いた。５００ｍｌ容三角フラスコ中の２０ｍＭウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地１００ｍｌに、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の分生子を接種し、３０℃で約１８時間振とう培養した。その後、菌体を回収し、プロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇの対象遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能がある形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
得られた形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ウリジン要求性を相補する遺伝子であるｐｙｒＧが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株として選択できた。さらに、得られた菌株の中から目的の形質転換体をＰＣＲで確認して選抜した。上記のＭｐＧＤＨ−Ｍ３および糖鎖付加部位を改変したＧＤＨ変異体の遺伝子により形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いて、下記の手順でＧＤＨ生産を行った。一般に挿入されたＧＤＨ遺伝子がマルチコピーで入るほど、ＧＤＨの生産量は高い。今回作製した形質転換体はＰＣＲにより、いずれの変異体も同程度に遺伝子が挿入されていることを確認した。
２００ｍｌ容三角フラスコ中の液体培地（２％（ｗ／ｖ）ハイポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）パインデックス♯２、１．０％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．２５％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、０．２５％（ｗ／ｖ）リン酸水素二カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム七水和物；ｐＨ未調整）４０ｍｌに、各菌株の分生子を接種し、３０℃で４日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。
培養後の培養物をろ過して菌体と菌体外画分に分離した。菌体は５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で懸濁し、ホモジナイザーとビーズショッカーにて菌体を破砕した。この菌体破砕液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を菌体内画分とした。得られた菌体外画分および菌体内画分を用いてグルコースデヒドロゲナーゼ活性を指標にして生産量を算出した。その結果、糖鎖付加部位の変異箇所が０〜３箇所であり、糖鎖付加部位１３〜１６箇所を有するＧＤＨ変異体では菌体外画分の生産量が１００Ｕ／ｍｌを超える菌株が半数以上得られたのに対し、糖鎖付加部位の変異箇所が６箇所であり、１０箇所の糖鎖付加部位を有するＧＤＨ変異体では１１株中１株であった。糖鎖付加部位の変異箇所が８箇所であり８箇所の糖鎖付加部位を有するのＧＤＨ変異体では８株すべてが菌体外生産量１００Ｕ／ｍｌ未満であり、糖鎖付加部位の数が減少すると高生産量の菌株が取得しにくく、生産量が低くなる傾向があった。
２．ＭｐＧＤＨ−Ｍ３および糖鎖付加部位の改変型ＧＤＨの分子サイズ比較
Ｍ３、Ｍ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３６５Ｄ、Ｍ３／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒ、Ｍ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ、Ｍ３／Ｓ２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ、Ｍ３／Ｓ２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４０１Ｒ、Ｍ３／Ｓ２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４０１Ｒ／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒのうち、生産量の良好な発現株それぞれ１株を用いて、発現したＧＤＨの分子サイズを下記の手順で比較した。菌体外画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−３０Ｋ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で５ｍＬまで濃縮し、透析により培地成分を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に置き換えたＧＤＨ溶液を調製した。１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に調製したＧＤＨ溶液をアプライし、同緩衝液で溶出させた。
Ｍ３、Ｍ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３６５Ｄ、Ｍ３／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒ、Ｍ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ、Ｍ３／Ｓ２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ、Ｍ３／Ｓ２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４０１Ｒ、Ｍ３／Ｓ２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４０１Ｒ／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒのうち、生産量の良好な発現株それぞれ１株を用いて、発現したＧＤＨの分子サイズを下記の手順で比較した。菌体外画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−３０Ｋ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で５ｍＬまで濃縮し、透析により培地成分を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に置き換えたＧＤＨ溶液を調製した。１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に調製したＧＤＨ溶液をアプライし、同緩衝液で溶出させた。
上記のＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇはゲルろ過カラムであり、分子を大きさの違いによって分離できる。カラムにつめられた担体には小さな孔が開いており、小さな分子ほどその孔に入り込み溶出が遅くなる。したがって、溶出体積が小さいほど分子サイズは大きく、溶出体積が大きいほど分子サイズが小さいことがわかるため、ＧＤＨ画分の溶出体積を比較することにより、分子サイズを比較した。ゲル濾過クロマトグラフィーの結果、Ｍ３、Ｍ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３６５Ｄ、Ｍ３／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒが最も分子サイズが大きく、次いでＭ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ、Ｍ３／Ｓ２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ 、次いでＭ３／Ｓ２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４０１Ｒ、Ｍ３／Ｓ２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４０１Ｒ／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒであった。アミノ酸置換による分子量の変化はほとんどないため、分子サイズの差は糖鎖付加量に由来するものと考えられる。糖鎖付加部位の変異箇所が多いほど分子サイズは小さくなっており、糖鎖付加部位のアミノ酸を置換することにより糖鎖量が低減していることが確認できた。
３．添加物による糖鎖量低減型ＧＤＨの効率的生産
糖鎖量低減型ＧＤＨの生産量が低いという課題を解決するため、最も分子サイズが減少していたＤＧ８発現株を用いて、培養条件の観点から検討を行った。
糖鎖量低減型ＧＤＨの生産量が低いという課題を解決するため、最も分子サイズが減少していたＤＧ８発現株を用いて、培養条件の観点から検討を行った。
通常の液体培地（２％（ｗ／ｖ）ハイポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）パインデックス♯２、１．０％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．２５％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、０．２５％（ｗ／ｖ）リン酸水素二カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム七水和物；ｐＨ未調整）を対照とした。リン酸一カリウムとリン酸二カリウムの質量比が１：１かつ合計の濃度が２００〜１，２００ｍＭになるよう対照の培地に添加して、ＤＧ８発現株を３０℃、１６０ｒｐｍで４日間培養し、菌体外画分及び菌体内画分のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を指標にして生産量を評価した。その結果、菌体外画分と菌体内画分ともに、すべての濃度で対照の培地と比較して生産量が増大し、特に菌体外画分において、２００ｍＭ〜４００ｍＭでは約６倍、６００ｍＭ〜１０００ｍＭでは約８倍に増大した。なお、リン酸一カリウムとリン酸二カリウムの合計の濃度が６００ｍＭかつ質量比が１０：１３または１０：２５または１６：１０または３９：１０または８７：１０の各比率になるよう対照の培地に添加した場合にも、リン酸一カリウムとリン酸二カリウムの質量比が１：１と場合と同程度の生産量となり、混合比は生産量に影響しないことが分かった。
続いて、リン酸一カリウムおよびリン酸二カリウム以外の添加物による効果を検証するため、上記の対照培地に対して、塩化ナトリウム５〜１０００ｍＭ、アルギニン塩酸塩１００ｍＭ〜４００ｍＭ、グリセリン２．５ｗｔ％〜１０ｗｔ％、リン酸ナトリウム４０ｍＭ〜１０００ｍＭ、リン酸アンモニウム４０ｍＭ〜２００ｍＭ、硫酸アンモニウム４０ｍＭ〜１０００ｍＭ、硫酸マグネシウム２００ｍＭ〜１０００ｍＭをそれぞれ添加した後、対照の培地と同じｐＨに調整した培地を用いて、上記と同様の手順でＤＧ８発現株を培養し、生産量を評価した。なお、リン酸ナトリウムに関しては、リン酸一ナトリウムとリン酸二ナトリウムの質量比１：１で使用し、上記の濃度はリン酸一ナトリウムとリン酸二ナトリウムの合計のモル濃度を表す。生産量を評価した結果、いずれの添加物を用いた場合においても、対照の培地を用いた場合と比較して菌体外画分と菌体内画分ともに生産量が増加した。特に、塩化ナトリウムは５〜１０００ｍＭの添加により生産量が増加する効果があり、１０００ｍＭの添加で生産量が８倍に増加し、アルギニン塩酸塩は４００ｍＭの添加で生産量３倍、グリセリンは１０ｗｔ％の添加で生産量４倍、リン酸一ナトリウムとリン酸二ナトリウムを合計１０００ｍＭ添加すると３倍、リン酸アンモニウム２００ｍＭ添加すると２倍、硫酸アンモニウムを１０００ｍＭ添加すると１．８倍、硫酸マグネシウムを１０００ｍＭ添加すると２．８倍に生産量が向上した。
本発明の製造方法によりグルコースデヒドロゲナーゼ、例えば糖鎖付加量が少ないグルコースデヒドロゲナーゼを効率的に組換え産生することができる。
本発明を例示により説明したが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の変法を行うことができる。本明細書において言及された文献はいずれも、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
配列表フリーテキスト
配列番号１ Ｍｕｃｏｒ ｐｒａｉｎｉｉ ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ） ａａ
配列番号２ ＭｐＧＤＨ遺伝子 ＤＮＡ
配列番号３ ＭｐＧＤＨ−Ｍ３ ａａ
配列番号４ ＭｐＧＤＨ−Ｍ３遺伝子ＤＮＡ
配列番号５ ＭｐＧＤＨ−ＤＧ８ ａａ
配列番号６ ＭｐＧＤＨ−ＤＧ８遺伝子ＤＮＡ
配列番号７ Ｍ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３６５Ｄ ａａ
配列番号８ Ｍ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３６５Ｄ ＤＮＡ
配列番号９ Ｍ３／Ｎ４１７Ｉ／Ｎ４９６Ｌ ａａ
配列番号１０ Ｍ３／Ｎ４１７Ｉ／Ｎ４９６Ｌ ＤＮＡ
配列番号１１ Ｍ３／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒ ａａ
配列番号１２ Ｍ３／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒ ＤＮＡ
配列番号１３ Ｍ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ ａａ
配列番号１４ Ｍ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ ＤＮＡ
配列番号１５ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ ａａ
配列番号１６ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ ＤＮＡ
配列番号１７ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４０１Ｒ ａａ
配列番号１８ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４０１Ｒ ＤＮＡ
配列番号１９ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２５６Ｄ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ ａａ
配列番号２０ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２５６Ｄ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ ＤＮＡ
配列番号２１ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２５６Ｄ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒ ａａ
配列番号２２ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２５６Ｄ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒ ＤＮＡ
配列番号１ Ｍｕｃｏｒ ｐｒａｉｎｉｉ ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ） ａａ
配列番号２ ＭｐＧＤＨ遺伝子 ＤＮＡ
配列番号３ ＭｐＧＤＨ−Ｍ３ ａａ
配列番号４ ＭｐＧＤＨ−Ｍ３遺伝子ＤＮＡ
配列番号５ ＭｐＧＤＨ−ＤＧ８ ａａ
配列番号６ ＭｐＧＤＨ−ＤＧ８遺伝子ＤＮＡ
配列番号７ Ｍ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３６５Ｄ ａａ
配列番号８ Ｍ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３６５Ｄ ＤＮＡ
配列番号９ Ｍ３／Ｎ４１７Ｉ／Ｎ４９６Ｌ ａａ
配列番号１０ Ｍ３／Ｎ４１７Ｉ／Ｎ４９６Ｌ ＤＮＡ
配列番号１１ Ｍ３／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒ ａａ
配列番号１２ Ｍ３／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒ ＤＮＡ
配列番号１３ Ｍ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ ａａ
配列番号１４ Ｍ３／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ ＤＮＡ
配列番号１５ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ ａａ
配列番号１６ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ ＤＮＡ
配列番号１７ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４０１Ｒ ａａ
配列番号１８ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４０１Ｒ ＤＮＡ
配列番号１９ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２５６Ｄ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ ａａ
配列番号２０ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２５６Ｄ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ ＤＮＡ
配列番号２１ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２５６Ｄ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒ ａａ
配列番号２２ Ｍ３／２７Ａ／Ｓ１０３Ｑ／Ｎ２５６Ｄ／Ｎ２６８Ｓ／Ｎ３５３Ｄ／Ｎ３６５Ｄ／Ｎ４１７Ｒ／Ｎ４９６Ｒ ＤＮＡ
Claims (16)
- リン酸塩、ＮａＣｌ、グリセリン、硫酸塩、アルギニン塩からなる群より選択される、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用する工程を含む、糸状菌を宿主として用いたグルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造方法。
- リン酸塩が、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸アンモニウム又はこれらの組み合わせであるか、或いは、硫酸塩が、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム又はこれらの組み合わせである、或いはアルギニン塩が、アルギニン塩酸塩である、請求項１に記載の製造方法。
- （ｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、リン酸塩であり、リン酸塩についてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として２００ｍＭ〜１Ｍである、
（ｉｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、ＮａＣｌであり、ＮａＣｌについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として５ｍＭ〜１Ｍである、
（ｉｉｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、硫酸マグネシウムであり、硫酸マグネシウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として３００ｍＭ〜１Ｍである、
（ｉｖ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、リン酸アンモニウムであり、リン酸アンモニウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として２００ｍＭ〜１Ｍである、
（ｖ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、グリセリンであり、グリセリンについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として２．５〜１０重量％である、
（ｖｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、硫酸アンモニウムであり、硫酸アンモニウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として３００ｍＭ〜１Ｍである、又は
（ｖｉｉ）グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、アルギニン塩酸塩であり、アルギニン塩酸塩についてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として１００ｍＭ〜１Ｍである、
請求項１または２に記載の製造方法。 - 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が１２箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が１０箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項５に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が８箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、請求項６に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、ムコール属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項４〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、野生型遺伝子から改変された遺伝子によりコードされるムコール属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、請求項８に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体に関し、そのアミノ酸配列中の糖鎖付加部位であるアミノ酸残基が、糖鎖付加されないアミノ酸残基に置換されているグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、請求項９に記載の製造方法。
- グルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造を行う宿主がアスペルギルス属の宿主である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
- 宿主がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）又はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）である、請求項１１に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体が、配列番号５のアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、請求項１０に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体が、配列番号５のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、請求項１０に記載の製造方法。
- グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含まない培地、又は、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物をグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度未満の濃度であって通常の濃度で含む培地を用いてグルコースデヒドロゲナーゼを産生した場合と比較して、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量が、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用した場合に、菌体外のグルコースデヒドロゲナーゼ活性が２倍以上増大する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
- グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含まない培地、又は、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物をグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度未満の濃度であって通常の濃度で含む培地を用いてグルコースデヒドロゲナーゼを産生した場合と比較して、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量が、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用した場合に、菌体外のグルコースデヒドロゲナーゼ活性が６倍以上増大する、請求項１５に記載の製造方法。
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