JPH0646873A - ヒト血清アルブミンの高度精製方法 - Google Patents
ヒト血清アルブミンの高度精製方法Info
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- JPH0646873A JPH0646873A JP4205637A JP20563792A JPH0646873A JP H0646873 A JPH0646873 A JP H0646873A JP 4205637 A JP4205637 A JP 4205637A JP 20563792 A JP20563792 A JP 20563792A JP H0646873 A JPH0646873 A JP H0646873A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 遺伝子操作により発現されるヒト血清アルブ
ミンを得るに際し、その精製工程の最後にＣｕ−キレー
トクロマトグラフィーによる処理を行い、拮抗剤として
塩化アンモニウムを含有し、かつｐＨ５〜７の緩衝液に
てその吸着成分の分離・溶出を行うことを特徴とするヒ
ト血清アルブミンの高度精製方法。 【効果】 本発明によれば、遺伝子操作により得られる
ＨＳＡについて、従来の遺伝子操作由来ＨＳＡの精製方
法では充分に除去することができなかった酵母由来成分
を除去し、高度に精製されたＨＳＡを提供することがで
きる。
ミンを得るに際し、その精製工程の最後にＣｕ−キレー
トクロマトグラフィーによる処理を行い、拮抗剤として
塩化アンモニウムを含有し、かつｐＨ５〜７の緩衝液に
てその吸着成分の分離・溶出を行うことを特徴とするヒ
ト血清アルブミンの高度精製方法。 【効果】 本発明によれば、遺伝子操作により得られる
ＨＳＡについて、従来の遺伝子操作由来ＨＳＡの精製方
法では充分に除去することができなかった酵母由来成分
を除去し、高度に精製されたＨＳＡを提供することがで
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子操作により発現さ
れるヒト血清アルブミンをＣｕ−キレートクロマトグラ
フィーで処理することを特徴とするヒト血清アルブミン
の高度精製方法に関する。
れるヒト血清アルブミンをＣｕ−キレートクロマトグラ
フィーで処理することを特徴とするヒト血清アルブミン
の高度精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アルブミン、特にヒト血清アルブミン
（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構
成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中
で正常な浸透圧を維持する責を負う。また種々の血清分
子のキャリアーとしての機能を持っている。ＨＳＡは種
々の臨床上の状況において投与される。例えば、ショッ
クや熱傷患者では血液量を元に戻し、それにより外傷に
関連するいくつかの症状を改善させるために、通常はＨ
ＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や胎児性赤芽
球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療を必要とす
ることがある。従って、ＨＳＡを投与する基本的な治療
上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす
低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失が
ある様な状態を治療する点に存する。
（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構
成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中
で正常な浸透圧を維持する責を負う。また種々の血清分
子のキャリアーとしての機能を持っている。ＨＳＡは種
々の臨床上の状況において投与される。例えば、ショッ
クや熱傷患者では血液量を元に戻し、それにより外傷に
関連するいくつかの症状を改善させるために、通常はＨ
ＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や胎児性赤芽
球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療を必要とす
ることがある。従って、ＨＳＡを投与する基本的な治療
上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす
低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失が
ある様な状態を治療する点に存する。
【０００３】現在、ＨＳＡは、主として採取した血液の
分画からの産物として製造されている。この製造法の欠
点は不経済であることと、血液の供給が困難であるとい
うことである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ま
しくない物質を含んでいることがある。従って、ＨＳＡ
の代替の原料を開発することが有益となろう。
分画からの産物として製造されている。この製造法の欠
点は不経済であることと、血液の供給が困難であるとい
うことである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ま
しくない物質を含んでいることがある。従って、ＨＳＡ
の代替の原料を開発することが有益となろう。
【０００４】ところで、組換ＤＮＡ技術の出現によっ
て、多種多様の有用なポリペプチドの微生物による生産
が可能となり、多くの哺乳動物ポリペプチド類が既に種
々の微生物により生産されている。ＨＳＡについても、
遺伝子操作の技術により大量生産し、それを精製する技
術が確立されつつある。
て、多種多様の有用なポリペプチドの微生物による生産
が可能となり、多くの哺乳動物ポリペプチド類が既に種
々の微生物により生産されている。ＨＳＡについても、
遺伝子操作の技術により大量生産し、それを精製する技
術が確立されつつある。
【０００５】ＨＳＡを血漿から単離、精製する方法とし
ては各種研究がなされ、実用化されている。例えば、コ
ーンのエタノール分画法、ＰＥＧ分画法、硫安分画法等
が知られている。また最近では、陰イオン交換体処理と
６０℃，１０時間の加熱処理を組み合わせる方法（特開
平２−１９１２２６号公報）、陰イオン交換体処理、陽
イオン交換体処理および６０℃，１０時間の加熱処理を
組み合わせる方法（特開平３−１７１２３号公報）等も
開発されている。
ては各種研究がなされ、実用化されている。例えば、コ
ーンのエタノール分画法、ＰＥＧ分画法、硫安分画法等
が知られている。また最近では、陰イオン交換体処理と
６０℃，１０時間の加熱処理を組み合わせる方法（特開
平２−１９１２２６号公報）、陰イオン交換体処理、陽
イオン交換体処理および６０℃，１０時間の加熱処理を
組み合わせる方法（特開平３−１７１２３号公報）等も
開発されている。
【０００６】一方、遺伝子操作により得られる、組換え
ＨＳＡ（ｒ−ＨＳＡ）の精製方法も各種研究がなされて
いるが、夾雑する酵母由来成分を除去するには未だ到っ
ていない。かかる酵母由来成分が存在すると、生体にと
って異物であるから抗原性の問題が生じる可能性があ
る。したがって、組換え型蛋白質の純度としては不十分
であり、夾雑する酵母由来成分をさらに除去する必要が
ある。
ＨＳＡ（ｒ−ＨＳＡ）の精製方法も各種研究がなされて
いるが、夾雑する酵母由来成分を除去するには未だ到っ
ていない。かかる酵母由来成分が存在すると、生体にと
って異物であるから抗原性の問題が生じる可能性があ
る。したがって、組換え型蛋白質の純度としては不十分
であり、夾雑する酵母由来成分をさらに除去する必要が
ある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は、遺伝子操作によりＨＳＡを得るに際し、従来の
遺伝子操作由来ＨＳＡの精製方法では充分に除去するこ
とができなかった上記酵母由来成分を除去し、高度に精
製されたＨＳＡを提供することにある。
課題は、遺伝子操作によりＨＳＡを得るに際し、従来の
遺伝子操作由来ＨＳＡの精製方法では充分に除去するこ
とができなかった上記酵母由来成分を除去し、高度に精
製されたＨＳＡを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑みて鋭意研究を進めた結果、遺伝子操作によりＨＳ
Ａを得るに際して、当該ＨＳＡの精製に際して、当該Ｈ
ＳＡをＣｕ−キレートクロマトグラフィーにて処理する
ことにより、夾雑する酵母由来成分がさらに除去される
ことを見出し、本発明を完成した。
に鑑みて鋭意研究を進めた結果、遺伝子操作によりＨＳ
Ａを得るに際して、当該ＨＳＡの精製に際して、当該Ｈ
ＳＡをＣｕ−キレートクロマトグラフィーにて処理する
ことにより、夾雑する酵母由来成分がさらに除去される
ことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】即ち、本発明は、遺伝子操作により発現さ
れるヒト血清アルブミンをＣｕ−キレートクロマトグラ
フィーで処理することを特徴とするヒト血清アルブミン
の高度精製方法であり、より具体的には、Ｃｕイオンを
結合させたキレート樹脂カラムにｒ−ＨＳＡサンプルを
アプライし、拮抗剤として塩化アンモニウムを含有し、
かつｐＨ５〜７の緩衝液にて吸着成分の分離・溶出を行
うことを特徴とする、遺伝子操作により得られるＨＳＡ
の高度精製方法に関する。
れるヒト血清アルブミンをＣｕ−キレートクロマトグラ
フィーで処理することを特徴とするヒト血清アルブミン
の高度精製方法であり、より具体的には、Ｃｕイオンを
結合させたキレート樹脂カラムにｒ−ＨＳＡサンプルを
アプライし、拮抗剤として塩化アンモニウムを含有し、
かつｐＨ５〜７の緩衝液にて吸着成分の分離・溶出を行
うことを特徴とする、遺伝子操作により得られるＨＳＡ
の高度精製方法に関する。
【００１０】本発明は、遺伝子操作によってＨＳＡを調
製する場合のＨＳＡの高度精製方法に係わるものであ
り、当該ＨＳＡは遺伝子操作を経てＨＳＡを発現する菌
体（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌、麹、動物細胞等）
を培養し、菌体外発現（分泌発現）により産生される。
製する場合のＨＳＡの高度精製方法に係わるものであ
り、当該ＨＳＡは遺伝子操作を経てＨＳＡを発現する菌
体（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌、麹、動物細胞等）
を培養し、菌体外発現（分泌発現）により産生される。
【００１１】（１）遺伝子操作による得られるＨＳＡ 本発明において用いられる遺伝子操作により調製された
ＨＳＡ産生性宿主は、遺伝子操作を経て調製されたもの
であれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの
他、今後開発されるものであっても適宜利用することが
できる。具体的には、遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性と
された菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細
胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿主と
して、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)
〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス
（Pichia pastoris)〕が使用されることが好ましい。ま
た、栄養要求性株や抗生物質感受性株が使用できる。さ
らにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株
（a, his 4, leu 2, can 1) 、ピキア・パストリスＧＴ
Ｓ１１５株 (his 4)等が好適に用いられる。
ＨＳＡ産生性宿主は、遺伝子操作を経て調製されたもの
であれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの
他、今後開発されるものであっても適宜利用することが
できる。具体的には、遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性と
された菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細
胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿主と
して、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)
〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス
（Pichia pastoris)〕が使用されることが好ましい。ま
た、栄養要求性株や抗生物質感受性株が使用できる。さ
らにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株
（a, his 4, leu 2, can 1) 、ピキア・パストリスＧＴ
Ｓ１１５株 (his 4)等が好適に用いられる。
【００１２】これらのＨＳＡ産生性宿主の調製方法およ
びその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳ
Ａの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手
法を採用することによって実施される。例えば、ＨＳＡ
産生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法として
は、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方
法（特開昭５８−５６６８４、同５８−９０５１５、同
５８−１５０５１７号公報）、新規なヒト血清アルブミ
ン遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５、特開
平１−９８４８６号公報）、合成シグナル配列を用いる
方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミ
ンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５
号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法
（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させ
る方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含
有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2 プロ
モーターを用いる方法（特願平３−６３５９８、同３−
６３５９９号）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６
２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特
開昭６０−４１４８７、同６３−３９５７６、同６３−
７４４９３号公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現
（特開平２−１０４２９０号公報）等が例示される。
びその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳ
Ａの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手
法を採用することによって実施される。例えば、ＨＳＡ
産生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法として
は、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方
法（特開昭５８−５６６８４、同５８−９０５１５、同
５８−１５０５１７号公報）、新規なヒト血清アルブミ
ン遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５、特開
平１−９８４８６号公報）、合成シグナル配列を用いる
方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミ
ンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５
号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法
（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させ
る方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含
有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2 プロ
モーターを用いる方法（特願平３−６３５９８、同３−
６３５９９号）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６
２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特
開昭６０−４１４８７、同６３−３９５７６、同６３−
７４４９３号公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現
（特開平２−１０４２９０号公報）等が例示される。
【００１３】このうち、メタノール含有培地中で変異を
起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわ
ち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的に
はＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）
のＡＯＸ1 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ1 プロモータ
ー支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラ
スミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４
２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培
地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタ
ノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能
な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度として
は、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工
培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１
５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。
起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわ
ち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的に
はＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）
のＡＯＸ1 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ1 プロモータ
ー支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラ
スミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４
２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培
地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタ
ノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能
な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度として
は、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工
培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１
５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。
【００１４】また、ＨＳＡ産生性宿主の培養方法（すな
わちＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度
のグルコースを適度に少量づつ供給し、産生菌体に対す
る高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る
方法（特願平１−２１９５６１号）、培地中に脂肪酸を
添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特願平３−８１
７１９号）等が例示される。さらにＨＳＡの分離採取方
法としては、上記の各公報に記載された方法の他に加熱
処理によるプロテアーゼの不活化（特開平３−１０３１
８８号公報）、陰イオン交換体、疎水性担体および活性
炭からなる群より選ばれた少なくとも一を用いてＨＳＡ
と着色成分を分離することによる着色抑制方法（特開平
４−５４１９８号公報）等が例示される。
わちＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度
のグルコースを適度に少量づつ供給し、産生菌体に対す
る高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る
方法（特願平１−２１９５６１号）、培地中に脂肪酸を
添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特願平３−８１
７１９号）等が例示される。さらにＨＳＡの分離採取方
法としては、上記の各公報に記載された方法の他に加熱
処理によるプロテアーゼの不活化（特開平３−１０３１
８８号公報）、陰イオン交換体、疎水性担体および活性
炭からなる群より選ばれた少なくとも一を用いてＨＳＡ
と着色成分を分離することによる着色抑制方法（特開平
４−５４１９８号公報）等が例示される。
【００１５】形質転換宿主の培養に用いられる培地は、
通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸
またはその塩を添加したものが使用され、培養条件は一
般的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然
培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、
合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素
源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養
素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩
としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ
などが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イースト
ナイトロジエンのベース（Difco 社製）、２％グルコー
ス〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ
液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco 社
製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、２％グルコ
ース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基
性、弱酸性でよい。またメタノール資化性宿主の場合
は、メタノール含有培地を用いることができる。この場
合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。
通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸
またはその塩を添加したものが使用され、培養条件は一
般的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然
培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、
合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素
源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養
素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩
としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ
などが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イースト
ナイトロジエンのベース（Difco 社製）、２％グルコー
ス〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ
液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco 社
製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、２％グルコ
ース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基
性、弱酸性でよい。またメタノール資化性宿主の場合
は、メタノール含有培地を用いることができる。この場
合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。
【００１６】培養温度は、１５〜４３℃（酵母は２０〜
３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は
１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、
攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続
培養法により実施される。なお、当該培養に先立って前
培養を行うことが好ましい。この際の培地としては、例
えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前
培養の培養条件は次の通りである。すなわち、培養時間
は１０〜１００時間、温度は酵母では３０℃、細菌では
３７℃程度が好ましい。
３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は
１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、
攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続
培養法により実施される。なお、当該培養に先立って前
培養を行うことが好ましい。この際の培地としては、例
えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前
培養の培養条件は次の通りである。すなわち、培養時間
は１０〜１００時間、温度は酵母では３０℃、細菌では
３７℃程度が好ましい。
【００１７】かくして培養終了後、ＨＳＡは培養濾液ま
たは菌体、細胞からそれぞれ公知の分離手段により採取
される。
たは菌体、細胞からそれぞれ公知の分離手段により採取
される。
【００１８】採取後、精製工程に付され、本発明の処理
が、単独または他の精製法と組み合わせて用いられる。
が、単独または他の精製法と組み合わせて用いられる。
【００１９】（２）ＨＳＡの精製 本発明のＨＳＡの精製処理は、好適には従来より行われ
ている遺伝子操作由来ＨＳＡの精製工程のいずれか所望
の段階で、特に最後段階で、より好適には、以下の〜
を含む工程の最後、すなわち陰イオン交換クロマトグ
ラフィーの後に行う。 ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清を分画分
子量１０万〜５０万、及び１０００〜５万の限外濾過膜
を用いて処理する。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
陽イオン交換体に接触させた後にｐＨ８〜１０、塩濃度
０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
する、そして ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。 また、前記工程の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度１〜
３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後
に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
溶出する工程、または前記工程の代わりに、ｐＨ６〜
８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件下で陰イオン
交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５
〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには前記工程と
の間、との間、またはの後で、ｐＨ３〜５、塩
濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、沈澱画分を回
収する工程をさらに含むものであってもよい。
ている遺伝子操作由来ＨＳＡの精製工程のいずれか所望
の段階で、特に最後段階で、より好適には、以下の〜
を含む工程の最後、すなわち陰イオン交換クロマトグ
ラフィーの後に行う。 ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清を分画分
子量１０万〜５０万、及び１０００〜５万の限外濾過膜
を用いて処理する。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
陽イオン交換体に接触させた後にｐＨ８〜１０、塩濃度
０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
する、そして ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。 また、前記工程の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度１〜
３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後
に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
溶出する工程、または前記工程の代わりに、ｐＨ６〜
８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件下で陰イオン
交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５
〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには前記工程と
の間、との間、またはの後で、ｐＨ３〜５、塩
濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、沈澱画分を回
収する工程をさらに含むものであってもよい。
【００２０】（３）ＨＳＡのＣｕ−キレートクロマトグ
ラフィーによる処理 本発明のＨＳＡのＣｕ−キレートクロマトグラフィーに
よる処理工程は、好適には上記精製工程の最後に組み込
まれ、Ｃｕ2+塩含有溶液、例えばＣｕＳＯ4 溶液を流す
ことによりＣｕ2+を結合させたキレート樹脂とＨＳＡを
接触することにより行われる。当該キレート樹脂の担体
は、通常の不溶性担体であれば特に限定されず、親水性
ビニルポリマー、架橋デキストラン（商品名セファデッ
クス）、アガロース（商品名セファロース）、セルロー
ス（商品名セルロファイン）等が挙げられる。一方、リ
ガンド部は、イミノジ酢酸基が挙げられる。当該キレー
ト樹脂は、金属キレートアフィニティークロマトグラフ
ィー用に市販されているものであればいずれでも使用で
きるが、例えば、ＡＦ−キレートトヨパール６５０（東
ソー社製）、Chelating Sepharose 6 B （ファルマシア
製）、Chelating Sepharose FF (ファルマシア製）、キ
レートセルロファイン（生化学工業製）等が好適に使用
される。
ラフィーによる処理 本発明のＨＳＡのＣｕ−キレートクロマトグラフィーに
よる処理工程は、好適には上記精製工程の最後に組み込
まれ、Ｃｕ2+塩含有溶液、例えばＣｕＳＯ4 溶液を流す
ことによりＣｕ2+を結合させたキレート樹脂とＨＳＡを
接触することにより行われる。当該キレート樹脂の担体
は、通常の不溶性担体であれば特に限定されず、親水性
ビニルポリマー、架橋デキストラン（商品名セファデッ
クス）、アガロース（商品名セファロース）、セルロー
ス（商品名セルロファイン）等が挙げられる。一方、リ
ガンド部は、イミノジ酢酸基が挙げられる。当該キレー
ト樹脂は、金属キレートアフィニティークロマトグラフ
ィー用に市販されているものであればいずれでも使用で
きるが、例えば、ＡＦ−キレートトヨパール６５０（東
ソー社製）、Chelating Sepharose 6 B （ファルマシア
製）、Chelating Sepharose FF (ファルマシア製）、キ
レートセルロファイン（生化学工業製）等が好適に使用
される。
【００２１】当該キレート樹脂による処理条件は、好適
には次の通りである。 〔リニアグラジェント法による場合〕まず、Ｃｕ2+結合
キレート樹脂を平衡化・洗浄する。平衡化・洗浄には塩
濃度０．１〜１Ｍ，ｐＨ５〜７程度の緩衝液を用いる。
具体的には０．１〜１Ｍ塩化ナトリウム添加１０〜１０
０ｍＭ酢酸、リン酸またはトリス−塩酸等の緩衝液（ｐ
Ｈ５〜７）が例示される。次いで、ＨＳＡ含有画分をＣ
ｕ2+結合キレート樹脂にアプライし、拮抗剤を含む上記
緩衝液を用いてリニアグラジェント法によりＨＳＡを分
離・溶出させる。拮抗剤としては塩化アンモニウム、イ
ミダゾール、ヒスチジン、システイン、グリシン、ヒス
タミン等が例示されるが、リニアグラジェントの最大濃
度としては塩化アンモニウムで１〜３Ｍ程度、他の拮抗
剤で０．０１〜０．１Ｍ程度が示される。
には次の通りである。 〔リニアグラジェント法による場合〕まず、Ｃｕ2+結合
キレート樹脂を平衡化・洗浄する。平衡化・洗浄には塩
濃度０．１〜１Ｍ，ｐＨ５〜７程度の緩衝液を用いる。
具体的には０．１〜１Ｍ塩化ナトリウム添加１０〜１０
０ｍＭ酢酸、リン酸またはトリス−塩酸等の緩衝液（ｐ
Ｈ５〜７）が例示される。次いで、ＨＳＡ含有画分をＣ
ｕ2+結合キレート樹脂にアプライし、拮抗剤を含む上記
緩衝液を用いてリニアグラジェント法によりＨＳＡを分
離・溶出させる。拮抗剤としては塩化アンモニウム、イ
ミダゾール、ヒスチジン、システイン、グリシン、ヒス
タミン等が例示されるが、リニアグラジェントの最大濃
度としては塩化アンモニウムで１〜３Ｍ程度、他の拮抗
剤で０．０１〜０．１Ｍ程度が示される。
【００２２】〔パス法による場合〕まず、Ｃｕ2+結合キ
レート樹脂を平衡化・洗浄する。平衡化・洗浄には拮抗
剤を含む塩濃度０．１〜１Ｍ，ｐＨ５〜７程度の緩衝液
を用いる。拮抗剤は上記拮抗剤が例示される。緩衝液と
しては、具体的には０．１〜１Ｍ塩化ナトリウム添加１
０〜１００ｍＭ酢酸、リン酸またはトリス−塩酸等の緩
衝液（ｐＨ５〜７）が例示される。次いで、ＨＳＡ含有
画分をＣｕ2+結合キレート樹脂にアプライし、非吸着画
分を回収する。好ましくは上記の拮抗剤を含む塩濃度
０．１〜１Ｍ，ｐＨ５〜７程度の緩衝液を用いて平衡化
したＣｕ2+未結合キレート樹脂からなるカラムをＣｕ2+
結合キレート樹脂カラムの下位に接続した系を用いてＨ
ＳＡの精製を行う。
レート樹脂を平衡化・洗浄する。平衡化・洗浄には拮抗
剤を含む塩濃度０．１〜１Ｍ，ｐＨ５〜７程度の緩衝液
を用いる。拮抗剤は上記拮抗剤が例示される。緩衝液と
しては、具体的には０．１〜１Ｍ塩化ナトリウム添加１
０〜１００ｍＭ酢酸、リン酸またはトリス−塩酸等の緩
衝液（ｐＨ５〜７）が例示される。次いで、ＨＳＡ含有
画分をＣｕ2+結合キレート樹脂にアプライし、非吸着画
分を回収する。好ましくは上記の拮抗剤を含む塩濃度
０．１〜１Ｍ，ｐＨ５〜７程度の緩衝液を用いて平衡化
したＣｕ2+未結合キレート樹脂からなるカラムをＣｕ2+
結合キレート樹脂カラムの下位に接続した系を用いてＨ
ＳＡの精製を行う。
【００２３】ＨＳＡとＣｕ2+結合キレート樹脂の混合比
としては、ＨＳＡ１ｍｇに対して樹脂０．００１〜０．
１ｍｌ、好ましくは０．００２〜０．０１ｍｌが例示さ
れる。
としては、ＨＳＡ１ｍｇに対して樹脂０．００１〜０．
１ｍｌ、好ましくは０．００２〜０．０１ｍｌが例示さ
れる。
【００２４】上記の工程（〜および塩析処理、さら
にＣｕ−キレートクロマトグラフィーを含む）を経て得
られたＨＳＡのＥＬＩＳＡ法による純度は１×１０-9〜
５×１０-8（最良値：２．７８×１０-9)(酵母由来成分
／ｒ−ＨＳＡ）程度である。この純度はキレート樹脂処
理前の純度より約１００倍高い。
にＣｕ−キレートクロマトグラフィーを含む）を経て得
られたＨＳＡのＥＬＩＳＡ法による純度は１×１０-9〜
５×１０-8（最良値：２．７８×１０-9)(酵母由来成分
／ｒ−ＨＳＡ）程度である。この純度はキレート樹脂処
理前の純度より約１００倍高い。
【００２５】（４）製剤化 得られたＨＳＡは公知の手法（限外濾過、安定化剤の添
加、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤化するこ
とができる。こうして調製されたＨＳＡ製剤は注射剤と
して血漿由来ＨＳＡ製剤と同様に臨床上用いることがで
きる。また、医薬品の安定化剤あるいは担体、運搬体と
しても利用可能である。
加、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤化するこ
とができる。こうして調製されたＨＳＡ製剤は注射剤と
して血漿由来ＨＳＡ製剤と同様に臨床上用いることがで
きる。また、医薬品の安定化剤あるいは担体、運搬体と
しても利用可能である。
【００２６】
【発明の効果】本発明によれば、遺伝子操作により得ら
れるＨＳＡについて、従来の遺伝子操作由来ＨＳＡの精
製方法では充分に除去することができなかった酵母由来
成分を除去し、世界保健機構（ＷＨＯ）が推奨する組換
え型医薬品の純度を達成し得た高度に精製されたＨＳＡ
を提供することができる。また、酵母由来成分が除去さ
れることにより、抗原性が除去され、アレルギー反応等
の副作用を抑えることが期待できる。
れるＨＳＡについて、従来の遺伝子操作由来ＨＳＡの精
製方法では充分に除去することができなかった酵母由来
成分を除去し、世界保健機構（ＷＨＯ）が推奨する組換
え型医薬品の純度を達成し得た高度に精製されたＨＳＡ
を提供することができる。また、酵母由来成分が除去さ
れることにより、抗原性が除去され、アレルギー反応等
の副作用を抑えることが期待できる。
【００２７】
【実施例】本発明をより詳細に説明するために、実施例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。
【００２８】参考例１ ＨＳＡ産生宿主の培養 (1) 使用菌株：Pichia pastoris GCP101株 特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法に
より、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１
５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ1 遺伝子領域に、ＡＯＸ1 プロ
モーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つ
プラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換
して、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ1
遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培
地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。
より、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１
５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ1 遺伝子領域に、ＡＯＸ1 プロ
モーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つ
プラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換
して、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ1
遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培
地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。
【００２９】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％寒天末に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有
無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２
％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個
のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほ
とんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわ
ち、このプレートではコロニーが生じるということはメ
タノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得
られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを
適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％寒天末に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有
無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２
％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個
のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほ
とんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわ
ち、このプレートではコロニーが生じるということはメ
タノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得
られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを
適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
【００３０】(2) 菌株の培養 （前々培養） グリセロール凍結ストック菌株１mlを２００mlのＹＰＤ
培地（表１）を含むバッフル付１，０００ml容三角フラ
スコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養した。
培地（表１）を含むバッフル付１，０００ml容三角フラ
スコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養した。
【００３１】
【表１】
【００３２】（前培養）ＹＰＤ培地５Ｌを含む１０Ｌ容
ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間
通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５Ｌ／
分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施し
なかった。
ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間
通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５Ｌ／
分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施し
なかった。
【００３３】（本培養）バッチ培養用培地（表２）２５
０Ｌに前培養液を植菌し、１，２００Ｌ容ファーメンタ
ーを用いて通気攪拌培養した。槽内圧は０．５kg／c
m2 、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃
度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持する
ように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。
回分培養において培地中のグリセロールが消費された時
点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフ
ィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中に
メタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養
を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加すること
により、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤
（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３
０ml／Ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加
することで実施した。
０Ｌに前培養液を植菌し、１，２００Ｌ容ファーメンタ
ーを用いて通気攪拌培養した。槽内圧は０．５kg／c
m2 、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃
度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持する
ように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。
回分培養において培地中のグリセロールが消費された時
点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフ
ィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中に
メタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養
を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加すること
により、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤
（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３
０ml／Ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加
することで実施した。
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】参考例２ 参考例１のＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモ
ーター [変異型。天然型ＡＯＸ２プロモーター（YEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol.,9, 1316-1
323 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基が
ＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラス
ミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia
pastoris) ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ
４２−３株を得た（特願平３−６３５９９号）。参考例
１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡを産
生させた。
ーター [変異型。天然型ＡＯＸ２プロモーター（YEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol.,9, 1316-1
323 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基が
ＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラス
ミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia
pastoris) ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ
４２−３株を得た（特願平３−６３５９９号）。参考例
１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡを産
生させた。
【００３７】参考例３ ＨＳＡの精製 [i] 培養上清の分離〜膜分画（ＩＩ） 参考例１、または参考例２で得られた培養液約８００Ｌ
を圧搾することにより培養上清を分離した。培養上清を
分画分子量が３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、
分画分子量が３万の限外濾過膜を用いて液量を約８０Ｌ
に濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。この濃縮液を６０℃、３
時間の加熱処理後、急速に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．
５に調整し、再度分画分子量が３０万の限外濾過膜を用
いて除去した〔膜分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量
が３万の限外濾過膜を用いてアルブミン溶液中の緩衝液
を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，
ｐＨ４．５に交換した。
を圧搾することにより培養上清を分離した。培養上清を
分画分子量が３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、
分画分子量が３万の限外濾過膜を用いて液量を約８０Ｌ
に濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。この濃縮液を６０℃、３
時間の加熱処理後、急速に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．
５に調整し、再度分画分子量が３０万の限外濾過膜を用
いて除去した〔膜分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量
が３万の限外濾過膜を用いてアルブミン溶液中の緩衝液
を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，
ｐＨ４．５に交換した。
【００３８】[ii] 陽イオン交換体処理 ５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐ
Ｈ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにア
ルブミンを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ９でアルブミンの溶出を行った。
Ｈ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにア
ルブミンを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ９でアルブミンの溶出を行った。
【００３９】[iii] 疎水性クロマト処理 Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたアルブミン
溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファイ
ンを充填したカラムに添加した。この条件ではアルブミ
ンはフェニルセルロファインを吸着することなく、カラ
ムを通過した。カラムを通過したアルブミンは、分画分
子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０Ｌに濃縮す
るとともに、アルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン
酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。
溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファイ
ンを充填したカラムに添加した。この条件ではアルブミ
ンはフェニルセルロファインを吸着することなく、カラ
ムを通過した。カラムを通過したアルブミンは、分画分
子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０Ｌに濃縮す
るとともに、アルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン
酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。
【００４０】[iv] 陰イオン交換体処理 疎水クロマト処理後、濃縮及び緩衝液交換を行ったアル
ブミン溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡
化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添加
した。この条件ではアルブミンはＤＥＡＥ−セファロー
スに吸着することなく、カラムを通過した。
ブミン溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡
化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添加
した。この条件ではアルブミンはＤＥＡＥ−セファロー
スに吸着することなく、カラムを通過した。
【００４１】実施例１ 予め精製水で洗浄しておいたChelating Sepharose FF C
olumn （Φ16×15cm,30ml) に５mg／ml ＣｕＳＯ4 溶
液を流し、ゲルにＣｕ2+を結合させた。カラム内に遊離
するＣｕ2+を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む50mM Tris-
HCl 緩衝液(pH7.0) 、または50mMリン酸ナトリウム緩衝
液(pH6.0) で洗浄した後、本カラムの下位にＣｕ2+を結
合させていないChelating Sepharose FF Column （Φ５
×20cm,４ml，ファルマシア製）を接続し、同緩衝液に
より平衡化を行った。ＰＤ−１０〔ゲル濾過担体である
架橋デキストラン（商品名セファデックスＧ２５，ファ
ルマシア社製）を充填したプレバックミニカラム〕によ
り同緩衝液組成に変更しておいた、上記参考例１、３を
経て得られた精製ｒ−ＨＳＡサンプル１ｍｌ（１１８mg
／ml，Ａ350 ／Ａ280 ＝0.0258) を本カラムにアプライ
し、同緩衝液100ml により洗浄を行った後、2.00M 塩化
アンモニウムを含む同緩衝液にかけてのリニアグラジェ
ント法(200ml) により吸着成分の分離・溶出を行った
(流速1.0ml/min., 14ml/cm2 /hr.)。溶出した各画分に
ついて、下記（イ）に記載する方法によりＨＳＡ濃度と
Ａ35 0 ／Ａ280 値を求め、（ロ）に記載する方法による
酵母由来成分濃度を求めた。
olumn （Φ16×15cm,30ml) に５mg／ml ＣｕＳＯ4 溶
液を流し、ゲルにＣｕ2+を結合させた。カラム内に遊離
するＣｕ2+を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む50mM Tris-
HCl 緩衝液(pH7.0) 、または50mMリン酸ナトリウム緩衝
液(pH6.0) で洗浄した後、本カラムの下位にＣｕ2+を結
合させていないChelating Sepharose FF Column （Φ５
×20cm,４ml，ファルマシア製）を接続し、同緩衝液に
より平衡化を行った。ＰＤ−１０〔ゲル濾過担体である
架橋デキストラン（商品名セファデックスＧ２５，ファ
ルマシア社製）を充填したプレバックミニカラム〕によ
り同緩衝液組成に変更しておいた、上記参考例１、３を
経て得られた精製ｒ−ＨＳＡサンプル１ｍｌ（１１８mg
／ml，Ａ350 ／Ａ280 ＝0.0258) を本カラムにアプライ
し、同緩衝液100ml により洗浄を行った後、2.00M 塩化
アンモニウムを含む同緩衝液にかけてのリニアグラジェ
ント法(200ml) により吸着成分の分離・溶出を行った
(流速1.0ml/min., 14ml/cm2 /hr.)。溶出した各画分に
ついて、下記（イ）に記載する方法によりＨＳＡ濃度と
Ａ35 0 ／Ａ280 値を求め、（ロ）に記載する方法による
酵母由来成分濃度を求めた。
【００４２】＜測定方法＞ （イ）ＨＰＬＣによるゲル濾過解析法 予め、０．１％のアジ化ナトリウムと０．３％の塩化ナ
トリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．５）で平衡化しておいたTSKgel G3000SWXLカラム
に、サンプルを５０μｌインジェクションした。同緩衝
液を溶離液として用い、１ml/minの流速で、サンプル成
分の分離を行った。検出はＡ280 とＡ350により行い、
２．５mg／ml血漿由来のアルブミンのピーク高を用い、
相対的に検体中に含まれるアルブミン濃度を算出した。
トリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．５）で平衡化しておいたTSKgel G3000SWXLカラム
に、サンプルを５０μｌインジェクションした。同緩衝
液を溶離液として用い、１ml/minの流速で、サンプル成
分の分離を行った。検出はＡ280 とＡ350により行い、
２．５mg／ml血漿由来のアルブミンのピーク高を用い、
相対的に検体中に含まれるアルブミン濃度を算出した。
【００４３】（ロ）ＥＬＩＳＡによる酵母由来成分の測
定法 ５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で９６０倍に希釈し
た抗体溶液をプレートに１００μｌ／ウェル添加し、室
温で一昼夜静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
０．９％ＮａＣｌ溶液で１回洗浄後、１％スキムミルク
を含むＰＢＳを２００μｌ／ウェル添加し、室温で２時
間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．９
％ＮａＣｌ溶液で１回洗浄後、検体を５０μｌ／ウェル
添加し、３７℃で３時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ ２０を含む０．９％ＮａＣｌ溶液で６回洗浄後、１
％スキムミルクを含むＰＢＳで１万倍に希釈したＢｉｏ
ｔｉｎ−Ａｂ溶液を５０μｌ／ウェル添加し、３７℃で
２時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む
０．９％ＮａＣｌ溶液で６回洗浄後、１％スキムミルク
を含むＰＢＳで千倍に希釈したＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶
液を５０μｌ／ウェル添加し、３７℃で１時間静置し
た。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．９％ＮａＣ
ｌ溶液で６回洗浄後、基質５０μｌ／ウェル添加して室
温で３０〜６０分間静置後、２Ｎ硫酸５０μｌ／ウェル
を加え反応を停止し、各ウェルのＡ490 を測定した。検
体の代わりに既知量の酵母由来成分を添加したものより
標準曲線を作成し、検体中に含有される酵母由来成分量
を求めた。
定法 ５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で９６０倍に希釈し
た抗体溶液をプレートに１００μｌ／ウェル添加し、室
温で一昼夜静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
０．９％ＮａＣｌ溶液で１回洗浄後、１％スキムミルク
を含むＰＢＳを２００μｌ／ウェル添加し、室温で２時
間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．９
％ＮａＣｌ溶液で１回洗浄後、検体を５０μｌ／ウェル
添加し、３７℃で３時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ ２０を含む０．９％ＮａＣｌ溶液で６回洗浄後、１
％スキムミルクを含むＰＢＳで１万倍に希釈したＢｉｏ
ｔｉｎ−Ａｂ溶液を５０μｌ／ウェル添加し、３７℃で
２時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む
０．９％ＮａＣｌ溶液で６回洗浄後、１％スキムミルク
を含むＰＢＳで千倍に希釈したＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶
液を５０μｌ／ウェル添加し、３７℃で１時間静置し
た。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．９％ＮａＣ
ｌ溶液で６回洗浄後、基質５０μｌ／ウェル添加して室
温で３０〜６０分間静置後、２Ｎ硫酸５０μｌ／ウェル
を加え反応を停止し、各ウェルのＡ490 を測定した。検
体の代わりに既知量の酵母由来成分を添加したものより
標準曲線を作成し、検体中に含有される酵母由来成分量
を求めた。
【００４４】各溶出成分のｒ−ＨＳＡモノマー濃度と酵
母由来成分濃度を図１に示した。また、各溶出画分のｒ
−ＨＳＡモノマー濃度とＡ350 ／Ａ280 値を図２に示し
た。ｒ−ＨＳＡ及び酵母由来成分は拮抗剤フリーの条件
で全てカラムに吸着された。吸着された双方は拮抗剤
（塩化アンモニウム）濃度の上昇に従い溶出され、ｒ−
ＨＳＡのピークの方が酵母由来成分のピークより低濃度
領域で溶出され、しかも双方のピークはかなり離れてお
り、良好な分離能を示した。
母由来成分濃度を図１に示した。また、各溶出画分のｒ
−ＨＳＡモノマー濃度とＡ350 ／Ａ280 値を図２に示し
た。ｒ−ＨＳＡ及び酵母由来成分は拮抗剤フリーの条件
で全てカラムに吸着された。吸着された双方は拮抗剤
（塩化アンモニウム）濃度の上昇に従い溶出され、ｒ−
ＨＳＡのピークの方が酵母由来成分のピークより低濃度
領域で溶出され、しかも双方のピークはかなり離れてお
り、良好な分離能を示した。
【００４５】実施例２ 予め精製水で洗浄しておいたChelating Sepharose FF C
olumn （Φ16×5cm, 10ml)に５mg／ml ＣｕＳＯ4 溶液
を流し、ゲルにＣｕ2+を結合させた。カラム内に遊離す
るＣｕ2+を０．５Ｍ塩化ナトリウム及び各濃度（１．８
Ｍ，２．１Ｍ，２．４Ｍ）の塩化アンモニウムを含む50
mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0) で洗浄した後、本カ
ラムの下位にＣｕ2+を結合させていないChelating Seph
arose FFColumn （Φ５×５cm, １ml) を接続し、同緩
衝液により平衡化を行った。ＰＤ−１０（前出）により
同緩衝液組成に変更しておいた、上記参考例１、３を経
て得られた精製ｒ−ＨＳＡサンプル２ｍｌ（144 mg／m
l，Ａ350 /Ａ280 ＝0.0253) を本カラムにアプライし、
同緩衝液９８mlにより洗浄を行った後、キレートクロマ
トカラム非吸着成分の洗浄を行った（流速0.5 ml/min,
7 ml/cm2 /hr)。実施例１と同様にしてＨＳＡ濃度（Ｈ
ＰＬＣにより定量）、ならびに酵母由来成分濃度（ＥＬ
ＩＳＡにより定量）を求めた。結果を表４にまとめる。
olumn （Φ16×5cm, 10ml)に５mg／ml ＣｕＳＯ4 溶液
を流し、ゲルにＣｕ2+を結合させた。カラム内に遊離す
るＣｕ2+を０．５Ｍ塩化ナトリウム及び各濃度（１．８
Ｍ，２．１Ｍ，２．４Ｍ）の塩化アンモニウムを含む50
mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0) で洗浄した後、本カ
ラムの下位にＣｕ2+を結合させていないChelating Seph
arose FFColumn （Φ５×５cm, １ml) を接続し、同緩
衝液により平衡化を行った。ＰＤ−１０（前出）により
同緩衝液組成に変更しておいた、上記参考例１、３を経
て得られた精製ｒ−ＨＳＡサンプル２ｍｌ（144 mg／m
l，Ａ350 /Ａ280 ＝0.0253) を本カラムにアプライし、
同緩衝液９８mlにより洗浄を行った後、キレートクロマ
トカラム非吸着成分の洗浄を行った（流速0.5 ml/min,
7 ml/cm2 /hr)。実施例１と同様にしてＨＳＡ濃度（Ｈ
ＰＬＣにより定量）、ならびに酵母由来成分濃度（ＥＬ
ＩＳＡにより定量）を求めた。結果を表４にまとめる。
【００４６】
【表４】
【００４７】塩化アンモニウム濃度の上昇に従い、ｒ−
ＨＳＡの回収率が高くなり、２．４Ｍの塩化アンモニウ
ムの系では回収率が９３％であった。純度はｒ−ＨＳＡ
モノマー濃度に対する酵母由来成分濃度の比率で提示し
たが、キレートクロマト前の純度と比較して、３つの系
全てにおいて、２オーダーに近い純度の向上が認められ
た。
ＨＳＡの回収率が高くなり、２．４Ｍの塩化アンモニウ
ムの系では回収率が９３％であった。純度はｒ−ＨＳＡ
モノマー濃度に対する酵母由来成分濃度の比率で提示し
たが、キレートクロマト前の純度と比較して、３つの系
全てにおいて、２オーダーに近い純度の向上が認められ
た。
【図１】 各溶出成分のｒ−ＨＳＡモノマー濃度と酵母
由来成分濃度を示す。
由来成分濃度を示す。
【図２】 各溶出画分のｒ−ＨＳＡモノマー濃度とＡ
350 ／Ａ280 値を示す。
350 ／Ａ280 値を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84）
Claims (2)
- 【請求項１】 遺伝子操作により発現されるヒト血清ア
ルブミンをＣｕ−キレートクロマトグラフィーで処理す
ることを特徴とするヒト血清アルブミンの高度精製方
法。 - 【請求項２】 遺伝子操作により発現されるヒト血清ア
ルブミンのＣｕ−キレートクロマトグラフィーによる吸
着成分を、塩化アンモニウムを含有し、かつｐＨ５〜７
付近の緩衝液にて分離・溶出を行うことを特徴とする、
請求項１記載のヒト血清アルブミンの高度精製方法。
Priority Applications (8)
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|---|---|---|---|
| JP20563792A JP3360315B2 (ja) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | ヒト血清アルブミンの高度精製方法 |
| PCT/JP1993/001048 WO1994003626A1 (en) | 1992-07-31 | 1993-07-26 | Method of highly purifying human serum albumin |
| DE69331992T DE69331992T2 (de) | 1992-07-31 | 1993-07-26 | Verfahren zur hochaufreinigung von menschlichem serumalbumin |
| DK93916225T DK0656419T3 (da) | 1992-07-31 | 1993-07-26 | Fremgangsmåde til højrensning af humant serumalbumin |
| EP93916225A EP0656419B1 (en) | 1992-07-31 | 1993-07-26 | Method for highly purifying human serum albumin |
| US08/374,719 US5656729A (en) | 1992-07-31 | 1993-07-26 | Method for highly purifying human serum albumin |
| ES93916225T ES2177545T3 (es) | 1992-07-31 | 1993-07-26 | Metodo para purificar en gran medida seroalbumina humana. |
| CA002141439A CA2141439C (en) | 1992-07-31 | 1993-07-26 | Method for highly purifying human serum albumin |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646873A true JPH0646873A (ja) | 1994-02-22 |
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ID=16510194
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| ES (1) | ES2177545T3 (ja) |
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| US7070937B1 (en) | 1998-10-02 | 2006-07-04 | Ischemia Technologies, Inc. | Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method |
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| US7282369B2 (en) * | 1998-10-02 | 2007-10-16 | Ischemia Technologies, Inc. | Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits |
| US7449338B2 (en) * | 1998-10-02 | 2008-11-11 | Ischemia Technologies, Inc. | Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits |
| GB9902000D0 (en) | 1999-01-30 | 1999-03-17 | Delta Biotechnology Ltd | Process |
| AU2010215959A1 (en) | 2009-02-20 | 2011-08-04 | Ventria Bioscience | Cell culture media containing combinations of proteins |
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|---|---|---|---|---|
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| JPS59225121A (ja) * | 1983-06-03 | 1984-12-18 | Ajinomoto Co Inc | インタ−ロイキン２の精製濃縮法 |
| JPS6317898A (ja) * | 1986-07-11 | 1988-01-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | リンホトキシン類の精製法 |
| IL88326A (en) * | 1987-11-18 | 1993-03-15 | Gist Brocades Nv | Purification of serum albumin |
| US5169936A (en) * | 1989-04-14 | 1992-12-08 | Biogen, Inc. | Protein purification on immobilized metal affinity resins effected by elution using a weak ligand |
| FR2648048B1 (fr) * | 1989-06-08 | 1994-06-03 | Lille Transfusion Sanguine | Procede de preparation de solutions d'albumine purifiee |
| JPH03284692A (ja) * | 1990-03-30 | 1991-12-16 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | ペプチド類の回収方法 |
| US5330901A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris |
| US5440018A (en) * | 1992-05-20 | 1995-08-08 | The Green Cross Corporation | Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same |
-
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- 1992-07-31 JP JP20563792A patent/JP3360315B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-07-26 DE DE69331992T patent/DE69331992T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-26 US US08/374,719 patent/US5656729A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-26 WO PCT/JP1993/001048 patent/WO1994003626A1/ja active IP Right Grant
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- 1993-07-26 CA CA002141439A patent/CA2141439C/en not_active Expired - Fee Related
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- 1993-07-26 EP EP93916225A patent/EP0656419B1/en not_active Expired - Lifetime
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