WO1994003626A1 - Method of highly purifying human serum albumin - Google Patents

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WO1994003626A1
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hsa
serum albumin
human serum
antagonist
ammonium chloride
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PCT/JP1993/001048
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Naoto Fuluhata
Kinori Sumi
Takao Ohmura
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The Green Cross Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces

Definitions

  • the present invention relates to a method for highly purifying human serum albumin, which comprises treating human serum albumin produced by genetic engineering by Cu-chelate chromatography.
  • HSA human serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • This protein is made in the liver and is primarily responsible for maintaining normal osmolality in the bloodstream. It also functions as a carrier for various serum molecules.
  • HSA is administered in various clinical settings. For example, shock and burn patients usually require frequent administration of HSA to restore blood volume and thereby improve some trauma-related symptoms. Patients with hypoproteinemia or fetal erythroblastosis may also require treatment with HSA. Therefore, the basic therapeutic value of administering HSA is to treat conditions where there is fluid loss from the blood vessels, such as in surgery, shock, burns, and hypoproteinemia causing edema. Exist.
  • HSA is produced primarily as a product from a fraction of the collected blood.
  • the disadvantages of this method are that it is uneconomical and that the supply of blood is difficult. Blood may also contain undesirable substances, such as the hepatitis virus. Therefore, it would be beneficial to develop an alternative feedstock for HSA.
  • HSA is also being mass-produced by genetic engineering techniques, and techniques for purifying it are being established.
  • An object of the present invention is to obtain a highly purified HSA by removing the yeast-derived component which could not be sufficiently removed by the conventional method for purifying HSA from the conventional genetic manipulation when obtaining HSA by genetic engineering. Is to provide.
  • the present inventors have made intensive studies in view of the above circumstances, and as a result, when obtaining HSA by genetic manipulation, in the purification of the HSA, the HSA is contaminated by treating it with Cu-chelate chromatography.
  • the present inventors have found that yeast-derived components are further removed, and completed the present invention.
  • the present invention is a method for highly purifying human serum albumin, which comprises treating a fraction containing human serum albumin produced by genetic engineering with Cu-chelate chromatography, and more specifically, The r-HSA-containing fraction was applied to a chelating resin column to which Cu ions had been bound, containing ammonium chloride as an antagonist, and the adsorbed components in a buffer solution with a pH of 5 to 7.
  • the present invention relates to a method for highly purifying HSA produced by genetic manipulation, characterized by performing elution.
  • FIG. 1 shows the r-HSA monomer concentration and the yeast-derived component concentration of each eluted fraction in Example 1.
  • Figure 2 shows the results of each elution fraction in Example 1! ⁇ — Shows HS A monomer concentration and A350 / A280 value.
  • the present invention relates to a method for highly purifying HSA when HSA is prepared by genetic manipulation, wherein the HSA is a cell that expresses HSA through genetic manipulation (for example, Escherichia coli, yeast, Bacillus subtilis, ⁇ , animal cells, etc.), and are produced by extracellular expression (secretory expression).
  • HSA is a cell that expresses HSA through genetic manipulation (for example, Escherichia coli, yeast, Bacillus subtilis, ⁇ , animal cells, etc.), and are produced by extracellular expression (secretory expression).
  • HS A produced by genetic manipulation refers to HS A produced by an HS A producing host prepared through genetic manipulation.
  • the HS A-producing host is not particularly limited as long as it is prepared through genetic manipulation, and any of those described in known literature and those to be developed in the future can be used as appropriate. Specific examples include bacteria (eg, Escherichia coli, yeast, Bacillus subtilis, etc.) that have been made HSA-produced through genetic manipulation, animal cells, and the like.
  • yeast especially Saccharomyces genus (eg, Saccharomyces cerevisiae), or Pichia genus (eg, Pichia pastoris) as a host. .
  • auxotrophic strains and antibiotic-sensitive strains can be used.
  • Saccharomyces cerevisiae AH22 strain (a, his 4, leu 2, can 1), Pichia pastoris GTS 115 strain (his 4) and the like are preferably used.
  • the method for preparing these HSA-producing hosts, the method for producing HSA by culturing them, and the method for separating and collecting HSA from cultures are all carried out by employing known and equivalent techniques.
  • a method for preparing an HS A-producing host for example, a method using a normal human serum albumin gene (JP-A-58-56684 and JP-A-58-9051) 5, pp. 58-155017), a method using a novel human serum albumin gene (JP-A-62-29985, JP-A-11-96486) , A method using a synthetic signal sequence (Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • a method for causing a mutation in a methanol-containing medium is specifically performed as follows. That is, first, an appropriate host, preferably Pichia yeast, specifically, the AOX of the GTS115 strain (NRRL accession number Y-15851), and the AOX and promoter dominated by the conventional method in the gene transfer region.
  • a transformant having a transcription unit in which HSA is expressed is introduced below to obtain a transformant (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-104290).
  • This transformant has a low ability to grow in a methanol medium. Therefore, the transformant is cultured in a medium containing methanol to cause mutation, and only a viable strain is recovered. At this time, the methanol concentration is, for example, about 0.001 to 5%.
  • the medium may be an artificial medium or a natural medium.
  • the culture conditions are, for example, about 15 to 40 ° C. and about 1 to 1000 hours.
  • a high-batch high-concentration glucose is supplied in an appropriate small amount by a method of culturing an HS A-producing host (that is, a method of producing HS A).
  • a method of obtaining a high concentration of cells and a product by avoiding high-concentration substrate inhibition of the producing cells is to add a fatty acid to the medium to increase the production of HS A.
  • An example of the method of enhancing Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 9-193495 is given.
  • the medium used for culturing the transformed host is usually a medium known in the art to which a fatty acid having 10 to 26 carbon atoms or a salt thereof has been added. It is carried out according to a common law.
  • the medium may be either a synthetic medium or a natural medium, and a liquid medium is preferred.
  • synthetic media generally include various sugars as carbon sources, urea, ammonium salts, nitrates, etc. as nitrogen sources, various vitamins and nucleotides as micronutrients, and inorganic salts such as Mg, Ca, Fe, Na, Examples thereof include K, Mn, Co, and Cu.
  • YNB liquid medium [0.7% yeast nitrogen base (manufactured by Difco), 2% glucose] and the like.
  • Examples of the natural medium include a YPD liquid medium [1% yeast extract (manufactured by Difco), 2% pact peptone (manufactured by Difco), 2% glucose].
  • the pH of the medium may be neutral, weakly basic, or weakly acidic.
  • a medium containing methanol can be used. In this case, the methanol concentration is about 0.01 to 5%.
  • the culture temperature is preferably 15 to 43 ° C (20 to 30 ° C for yeast and 20 to 37 ° C for bacteria).
  • the cultivation time is about 1 to 1000 hours, and the cultivation is carried out by a continuous cultivation method, which is a batch cultivation method or a semi-batch cultivation method under standing or shaking, stirring, or aeration.
  • pre-culture is performed prior to the culture.
  • a YNB liquid medium or a YPD liquid medium is used as the medium in this case.
  • the culture conditions for the preculture are as follows. That is, the culture time is preferably 10 to 100 hours, the temperature is preferably 30 for yeast, and about 37 ° C for bacteria.
  • HS A is collected from the culture filtrate, the cells, and the cells by a known separation means.
  • HSA HSA is collected, it is subjected to a purification step, and the treatment of the present invention is used alone or in combination with other purification methods.
  • the purification treatment of the HS A of the present invention is preferably performed at any desired stage, particularly at the last stage, of the conventionally performed purification step of the genetically engineered HS A, more preferably This step is performed at the end of the step containing 7, that is, after the anion exchange chromatography.
  • the culture supernatant of the human serum albumin-producing host was fractionated from 100,000 to 500,000, And 100 to 50,000 ultrafiltration membranes.
  • Non-adsorbed fractions are collected by contacting with a hydrophobic chromatography support under conditions of pH 6 to 8 and salt concentration of 0.01 to 0.5 M, and
  • step (1) after contacting with a hydrophobic chromatography carrier under the conditions of pH 6 to 8 and salt concentration of 1 to 3 M, conditions of pH 6 to 8 and salt concentration of 0.01 to 5 M
  • steps of elution under the above conditions or in place of the above step (1) after contacting with an anion exchanger under the conditions of pH 6 to 8 and salt concentration of 0.001 to 0.05 M, pH 6 to 8 and salt concentration of 0. 0 Step of elution under the condition of 5 to 1 M, and further, between the steps 5 and ⁇ , between 6 and 7, or after 7, under the conditions of pH 3 to 5 and salt concentration of 0.5 to 3 M
  • the method may further include a step of subjecting to salting out with and collecting a precipitated fraction.
  • one HSA of the present invention is preferably incorporated into the last of the purification process, Cu 2+ salt-containing solution, a C u 2+ by passing e.g. Cu S_ ⁇ 4 dissolved solution It is performed by contacting the bound chelate resin with the fraction containing HSA.
  • the carrier of the chelate resin is not particularly limited as long as it is a usual insoluble carrier, and examples thereof include a hydrophilic vinyl polymer, cross-linked dextran (trade name: Sephadex), agarose (trade name: Sepharose), and cellulose (trade name: Cellguchi Fine). No.
  • the ligand part includes an iminodiacetic acid group.
  • the chelate resin may be any of those commercially available for metal chelate affinity chromatography.
  • AF-Chelate Toyopearl 650 manufactured by Tosoichi
  • Chelating Sepharose 6B manufactured by Pharmacia
  • Chelating Sepharose FF manufactured by Pharmacia
  • Chelate cell mouth fine manufactured by Seikagaku Corporation
  • the conditions for the treatment with the chelate resin are preferably as follows.
  • the Cu 2+ binding chelate resin is equilibrated and washed.
  • a buffer solution (pH 5 to 7) such as 0.1 to 1 OmM acetic acid, phosphoric acid, or tris monohydrochloride added with 0.1 to 1 M sodium chloride is exemplified.
  • HSA-containing fraction is applied to a Cu 2+ binding chelate resin, and HSA is separated and eluted by the linear gradient method using the above buffer containing an antagonist.
  • Examples of the antagonist include ammonium chloride, imidazole, histidine, cystine, glycine, and histamine.
  • the maximum linear gradient concentration is about 1 to 3 M for ammonium chloride, and 0.01 to 0.1 M for other antagonists. The degree is indicated.
  • Equilibration ⁇ For washing, use a buffer solution containing an antagonist and having a salt concentration of about 0.1 to 1 M and a pH of about 5 to 7.
  • the antagonist include the above-mentioned antagonists.
  • Specific examples of the buffer include a buffer (pH 5 to 7) such as 0.1 to 1 OmM acetic acid, phosphoric acid or tris-monohydrochloride added with 0.1 to 1 M sodium chloride.
  • the HSA-containing fraction is applied to a Cu 2+ binding chelate resin, and the non-adsorbed fraction is collected.
  • a column consisting of a C ⁇ 2 + unbound chelate resin equilibrated with a buffer containing the above antagonist and having a salt concentration of about 0.1 to 1 M and a pH of about 5 to 7 is used as a Cu 2+ -bound chelate resin column.
  • Purify HS A using the system connected to the lower part of the kit.
  • the mixing ratio of HS A to Cu 2+ binding chelate resin is, for example, 0.01 to 0.1 ml of resin, preferably 0.02 to 0.01 m 1 of resin per 1 mg of HSA. that t the above step (1) to (7 and salting-out process, further Cu- chelate chromatography - the containing) 1 purity by ELISA of HS a obtained through the X 1 0- 9 ⁇ 5 x 1 0- 8 (the best value: 2. 78 X 1 0- 9) ( an HSA) about yeast-derived component / r. This purity is about 100 times higher than the purity before Cu-chelate chromatography. (4) Formulation
  • the resulting HS A can be formulated by known methods (ultrafiltration, addition of a stabilizer, sterilization filtration, dispensing, freeze-drying, etc.).
  • the HSA preparation thus prepared can be used clinically as an injection, similarly to the plasma-derived HSA preparation. It can also be used as a stabilizing agent, carrier or carrier for pharmaceuticals.
  • HSA produced by genetic engineering components derived from yeast which could not be sufficiently removed by conventional methods for purifying HSA derived from genetic engineering are removed, and World Health Organization (WHO) Highly purified HS A that can achieve the recommended recombinant drug purity can be provided.
  • WHO World Health Organization
  • yeast-derived components it is expected that antigenicity will be removed and side effects such as allergic reactions will be suppressed.
  • the bacterial cell in each passage was diluted with sterilized water to make 1 0 7 cells / plate 2% Me OH- YNBw / o aa plate (0.7% yeast Nai Torojenbe over the scan Uiz out ⁇ Minoan Sit de , 2% methanol, 1.5% agar powder) and cultured at 30 ° C for 5 days to determine the presence or absence of colonies.
  • 20 colonies were generated from the 2% MeOH-YNBwZo aa plate applied after subculture for 12 days. Mut- strains can hardly grow on this plate, and Mut- strains can. In other words, the occurrence of colonies on this plate indicates that the assimilation of methanol was increased and a strain converted to Mut + was obtained.
  • One of the resulting colonies was appropriately diluted with sterile water, spread on a 2% MeOH-YNBwZo aa plate, and isolated as a single colony. One of them was named GCP 101.
  • the pre-preculture medium was inoculated into a 10 L jar armmenter containing 5 L of YPD medium, and cultured with aeration and stirring for 24 hours.
  • the culture temperature was 30 ° C and the aeration was 5 LZ. PH was not controlled in pre-culture.
  • Batch culture medium (Table 2) Inoculate 250 L of the preculture solution and The cells were cultured with aeration and stirring using a mentor.
  • the tank pressure is 0.SkgZcm 2
  • the maximum ventilation rate is 80 ON-L / min
  • the batch rate is controlled while controlling the stirring speed so that the dissolved oxygen concentration is maintained at about 50% to 30% of the saturated dissolved oxygen concentration.
  • Culture was started.
  • Feed medium (Table 3) was added when glycerol in the medium was consumed in batch culture. A computer was used to add this feed medium, and high-density culture was performed while controlling so that methanol did not accumulate in the medium.
  • the pH was controlled at a constant value of pH 5.85 by adding 28% ammonia water.
  • Defoaming was carried out by adding 0.30 ml ZL of an antifoaming agent (AdecanoU manufactured by Asahi Denka Kogyo) at the start of batch culture, and then adding a small amount as needed.
  • Table 2 Composition of culture medium for batch culture Component Concentration (/ shi)
  • AOX2 promoter isolated from the GCP101 strain of Reference Example 1 [mutant. In the natural AOX2 promoter (YEAST, 5, 167-177 (1988) or Mol.Cell, Biol., 9, 1316-1323 (1989)), the nucleotide at position 255 upstream of the start codon is mutated from T to C Was used to construct a plasmid pMMO42 for HSA expression, which was introduced into Pichia pastoris GTS115 strain to obtain a transformant UHG42-3 strain (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 4-99984). The UHG42-13 strain was cultured according to Reference Example 1 to produce HSA.
  • the culture supernatant was separated by squeezing about 800 L of the culture solution obtained in Reference Example 1 or Reference Example 2.
  • the culture supernatant was treated with an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 300,000.
  • the liquid volume was concentrated to about 80 L using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 30,000 [membrane fractionation (I)].
  • the concentrated solution was rapidly cooled to about 15 ° C, adjusted to pH 4.5, and treated again using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 300,000.
  • the buffer in the albumin solution was replaced with a 50 mM sodium acetate buffer containing 50 mM sodium chloride, pH 4.5, using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 30,000.
  • albumin solution eluted from the S-Sepharose packed column was added to a column packed with phenylcell mouth fine equilibrated with 5 OmM phosphate buffer containing 0.15 M sodium chloride, pH 6.8. Under these conditions, albumin passed through the column without adsorbing phenylcellulofine.
  • the volume of albumin that has passed through the column is reduced to approximately 50 L using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 30,000, and the buffer in the albumin solution is replaced with 5 OmM phosphate buffer, pH 6.8. did.
  • the concentrated and buffer-exchanged albumin solution was added to a column filled with DEAE-Sepharose equilibrated with 5 OmM phosphate buffer, pH 6.8. Under these conditions, albumin passed through the column without adsorption to DEAE-Sepharose.
  • the SmgZml CuSC solution was passed through a Chelating Sepharose FF Column (016xi5 cm, 30 ml) that had been washed with purified water in advance, and Cu 2+ was bound to the gel. After washing the Cu 2+ released into the column with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 0.5 M sodium chloride or 50 mM sodium phosphate buffer ( ⁇ 6.0), place C on the bottom of the column.
  • a Chelating Sepharose FF Column ( ⁇ 5 ⁇ 20 cm, 4 ml, manufactured by Pharmacia) to which u 2+ was not bound was connected, and equilibration was performed with the same buffer.
  • An antibody solution diluted 9600-fold with 5 OmM carbonate buffer (pH 9.6) was added to the plate in an amount of 1001 liter, and the plate was allowed to stand at room temperature for 24 hours. After washing once with a 0.9% NaC1 solution containing 0.05% Tween 20, 200 ml of PBS containing 1% skim milk was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • the Bi0tin-Ab solution diluted 10,000 times with PBS containing 1% skim milk was diluted to 50 1 / ⁇ -well. The mixture was added and allowed to stand at 37 ° C for 2 hours.
  • FIG. 1 shows the concentration of r-HSA monomer and the concentration of yeast-derived components in each eluted fraction. Also, each eluted fraction r- HS A monomer concentration and A 35. ZA 28 . The values are shown in FIG.
  • r-HSA and yeast-derived components were all adsorbed on the column under the condition of antagonist-free. c Both adsorbed were eluted as the concentration of antagonist (ammonium chloride) increased, and the r-HSA peak was derived from yeast. The components were eluted in a lower concentration region than the peaks of the components, and both peaks were far apart, showing good resolution.
  • Chelating Sepharose FF Column ( ⁇ 16 ⁇ 5 ⁇ , 10ml) which had been pre-washed with purified water flowing 5mgZml CuS0 4 solution, was bound to C u 2 + gel.
  • the Cu 2+ released into the column is washed with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.5 M sodium chloride and ammonium chloride at each concentration (1.8 M, 2.1 M, 2.4 M).
  • a Chelating Sepharose FF Colu concealed (D5 x 5 cm, 1 ml) to which no Cu 2+ was bound was connected to the lower part of this column, and equilibration was performed with the same buffer.

Description

明 細 書
ヒト血清アルブミンの高度精製方法
「技術分野」
本発明は遺伝子操作により産生されるヒト血清アルブミンを C u—キレートク 口マトグラフィ一で処理することを特徴とするヒト血清アルブミンの高度精製方 法に関する。
「背景技術」
アルブミン、 特にヒト血清アルブミン （以下、 「H S A」 ともいう。 ） は血漿 の主要な蛋白構成成分である。 この蛋白は肝臓中で作られ、 主に血流中で正常な 浸透圧を維持する責を負う。 また種々の血清分子のキヤリア一としての機能を持 つている。 H S Aは種々の臨床上の状況において投与される。 例えば、 ショック や熱傷患者では血液量を元に戻し、 それにより外傷に関連するいくつかの症状を 改善させるために、 通常は H S Aの頻回投与を必要とする。 低蛋白血症や胎児性 赤芽球症に罹っている患者にも H S Aによる治療を必要とすることがある。 従って、 H S Aを投与する基本的な治療上の意義は、 外科手術、 ショック、 火 傷、 浮腫を起こす低蛋白血症におけるがごとく、 血管からの液体の損失がある様 な状態を治療する点に存する。
現在、 H S Aは、 主として採取した血液の分画からの産物として製造されてい る。 この製造法の欠点は不経済であることと、 血液の供給が困難であるというこ とである。 また、 血液は肝炎ウィルスのように好ましくない物質を含んでいるこ とがある。 従って、 H S Aの代替の原料を開発することが有益となろう。
ところで、 組換 D N A技術の出現によって、 多種多様の有用なポリペプチドの 微生物による生産が可能となり、 多くの哺乳動物ポリべプチド類が既に種々の微 生物により生産されている。 H S Aについても、 遺伝子操作の技術により大量生 産し、 それを精製する技術が確立されつつある。
H S Aを血漿から単離、 精製する方法としては各種研究がなされ、 実用化され ている。 例えば、 コーンのエタノール分画法、 P E G分画法、 硫安分画法等が知 られている。 また最近では、 陰イオン交換体処理と 6 0 °C, 1 0時間の加熱処理 を組み合わせる方法 （特開平 2 - 1 9 1 226号公報） 、 陰イオン交換体処理、 陽イオン交換体処理および 60°C, 1 0時間の加熱処理を組み合わせる方法 （特 開平 3— 1 7 1 23号公報） 等も開発されている。
一方、 遺伝子操作により得られる、 組換え HSA (r -HSA) の精製方法も 各種研究がなされているが、 夾雑する酵母由来成分を除去するには未だ到ってい なレ、。 かかる酵母由来成分が存在すると、 生体にとって異物であるから抗原性の 問題が生じる可能性がある。 したがって、 組換え型蛋白質の純度としては不十分 であり、 夾雑する酵母由来成分をさらに除去する必要がある。
「発明の開示」
本発明の課題は、 遺伝子操作により HSAを得るに際し、 従来の遺伝子操作由 来 HS Aの精製方法では充分に除去することができなかった上記酵母由来成分を 除去し、 高度に精製された HS Aを提供することにある。
本発明者らは、 上記事情に鑑みて鋭意研究を進めた結果、 遺伝子操作により H SAを得るに際して、 当該 HSAの精製において、 当該 HSAを Cu—キレート クロマトグラフィ一にて処理することにより、 夾雑する酵母由来成分がさらに除 去されることを見出し、 本発明を完成した。
即ち、 本発明は、 遺伝子操作により産生されるヒト血清アルブミンを含有する 画分を Cu—キレ一トクロマトグラフィーで処理することを特徵とするヒト血清 アルブミンの高度精製方法であり、 より具体的には、 Cuイオンを結合させたキ レート樹脂カラムに r—HS A含有画分をアプライし、 拮抗剤として塩化アンモ 二ゥムを含有し、 かつ p H 5〜 7の緩衝液にて吸着成分の溶出を行うことを特徴 とする、 遺伝子操作により産生される HSAの高度精製方法に関する。
「図面の簡単な説明」
図 1は、 実施例 1における各溶出画分の r—HS Aモノマー濃度と酵母由来成 分濃度を示す。
図 2は、 実施例 1における各溶出画分の！ ·— HS Aモノマー濃度と A350/A280 値を示す。
「発明の詳細な説明」 本発明は、 遺伝子操作によって H S Aを調製する場合の H S Aの高度精製方法 に係わるものであり、 当該 HS Aは遺伝子操作を経て HS Aを発現する菌体 （例 えば、 大腸菌、 酵母、 枯草菌、 麴、 動物細胞等） を培養し、 菌体外発現 （分泌発 現） により産生される。
( 1 ) 遺伝子操作により産生される HS A
本発明において遺伝子操作により産生される HS Aとは、 遺伝子操作を経て調 製された HS A産生宿主により産生される HS Aをいう。 HS A産生宿主は遺伝 子操作を経て調製されたものであれば特に限定されず、 公知文献記載のものの他、 今後開発されるものであっても適宜利用することができる。 具体的には、 遺伝子 操作を経て HS A産生性とされた菌 （例えば、 大腸菌、 酵母、 枯草菌等） 、 動物 細胞などが挙げられる。 特に、 本発明においては、 宿主として、 酵母、 就中サッ カロマイセス属 〔例えば、 サッカロマイセス ' セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) 〕 、 もしくはピキァ属 〔例えば、 ピキア 'パストリス （Pichia pastoris) 〕 が使用されることが好ましい。 また、 栄養要求性株や抗生物質感受 性株が使用できる。 さらにまた、 サッカロマイセス ·セレピシェ AH22株 （a, his 4, leu 2, can 1)、 ピキア ·パストリス GTS 1 1 5株 （his 4)等が好適に 用レヽりれ 。
これらの H S A産生性宿主の調製方法およびその培養による H S Aの生産方法、 培養物からの HS Aの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手法を採 用することによって実施される。 例えば、 HS A産生性宿主 （または HS A産生 株） の調製方法としては、 例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法 (特開昭 5 8— 5 6 6 84、 同 5 8— 9 0 5 1 5、 同 58— 1 5 0 5 1 7号公報） 、 新規なヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法 （特開昭 6 2— 2 9 9 8 5、 特開 平 1一 9 8 4 8 6号公報） 、 合成シグナル配列を用いる方法 （特開平 1— 24 0 1 9 1号公報） 、 血清アルブミンシグナル配列を用いる方法 （特開平 2— 1 6 7 0 9 5号公報） 、 組換えプラスミ ドを染色体上に組込む方法 （特開平 3 - 7 2 8 8 9号公報） 、 宿主同士を融合させる方法 （特開平 3— 5 3 8 7 7号公報） 、 メ 夕ノール含有培地中で変異を起こさせる方法、 変異型 AOX2 プロモーターを用 いる方法 （EP— A— 5 0 6 0 4 0、 特開平 4 - 2 9 9 9 8 4号公報） 、 枯草菌 による HSAの発現 （特開昭 6 2 - 2 5 1 3 3号公報） 、 酵母による HS Aの発 現 （特開昭 6 0— 4 1 4 8 7、 同 6 3— 3 9 5 7 6、 同 63 - 7 4 4 9 3号公報） 、 ピキア酵母による HS Aの発現 （特開平 2— 1 0 4 2 9 0号公報） 等が例示され る。
このうち、 メタノ一ル含有培地中で変異を起こさせる方法は具体的には以下の ように行う。 すなわち、 まず適当な宿主、 好ましくはピキア酵母、 具体的には G TS 1 1 5株 （NRRL寄託番号 Y - 1 5 8 5 1 ) の AOX, 遣伝子領域に常法 により AOX, プロモータ一支配下に HSAが発現する転写ュニッ トを有するプ ラスミ ドを導入して形質転換体を得る （特開平 2— 1 0 4 2 9 0号公報を参照） 。 この形質転換体はメタノール培地中での増殖能は弱い。 そこで、 この形質転換体 をメタノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、 生育可能な菌株のみを回収 する。 この際、 メタノール濃度としては、 0. 0 0 0 1〜5 %程度が例示される。 培地は人工培地、 天然培地のいずれでもよい。 培養条件としては 1 5〜4 0°C、 1〜1 0 0 0時間程度が例示される。
また、 HS A産生性宿主の培養方法 （すなわち HS Aの産生方法） としては、 上記の各公報に記載された方法の他に、 フエッ ドバッチ培養により、 高濃度のグ ルコースを適度に少量づっ供給し、 産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高 濃度の菌体と産生物を得る方法 （特開平 3 - 8 3 5 9 5号） 、 培地中に脂肪酸を 添加して HS Aの産生を増強する方法 （特開平 4一 2 9 3 4 9 5号） 等が例示さ れる。
さらに HS Aの分離採取方法としては、 上記の各公報に記載された方法の他に 加熱処理によるプロテアーゼの不活化 （特開平 3— 1 0 3 1 8 8号公報） 、 陰ィ オン交換体、 疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一を用 いて HS Aと着色成分を分離することによる着色抑制方法 （特開平 4-5 4 1 9 8 号公報） 等が例示される。
形質転換宿主の培養に用いられる培地は、 通常この分野で既知の培地に炭素数 1 0〜2 6の脂肪酸またはその塩を添加したものが使用され、 培養条件は一般的 な常法に準じて実施される。 培地は合成培地、 天然培地のいずれでもよく、 液体 培地が好ましい。 例えば、 合成培地としては、 一般に炭素源として各種糖類、 窒 素源として尿素、 アンモニゥム塩、 硝酸塩など、 微量栄養素として各種ビタミン、 ヌクレオチドなどの他、 無機塩として Mg、 C a、 F e、 Na、 K、 Mn、 C o、 Cuなどが例示される。 YNB液体培地 〔0. 7%イーストナイトロジェンのべ ース （Difco 社製） 、 2%グルコース〕 などが挙げられる。 また天然培地として は、 YPD液体培地 〔 1 %イーストエキストラクト （Difco 社製） 、 2%パクト ペプトン （Difco 社製） 、 2%グルコース〕 が例示される。 培地の pHは中性ま たは弱塩基性、 弱酸性でよい。 またメタノール資化性宿主の場合は、 メタノール 含有培地を用いることができる。 この場合メタノール濃度は 0. 0 1〜5 %程度 である。
培養温度は、 1 5〜 4 3 °C (酵母は 20〜 3 0で、 細菌は 20〜 3 7 °C) が好 ましい。 培養時間は 1〜1 0 0 0時間程度であり、 培養は静置または振盪、 攪拌、 通気下に回分培養法や半回分培養法あるレ、は連続培養法により実施される。
なお、 当該培養に先立って前培養を行うことが好ましい。 この際の培地として は、 例えば YNB液体培地や YPD液体培地が使用される。 前培養の培養条件は 次の通りである。 すなわち、 培養時間は 1 0〜 1 0 0時間、 温度は酵母では 3 0 て、 細菌では 3 7 °C程度が好ましい。
かく して培養終了後、 HS Aは培養濾液または菌体、 細胞からそれぞれ公知の 分離手段により採取される。
HSAは採取後、 精製工程に付され、 本発明の処理が、 単独または他の精製法 と組み合わせて用いられる。
(2) HSAの精製
本発明の HS Aの精製処理は、 好適には従来より行われている遺伝子操作由来 HS Aの精製工程のいずれか所望の段階で、 特に最後段階で、 より好適には、 以 下の①〜⑦を含む工程の最後、 すなわち陰イオン交換クロマトグラフィーの後に 行う。
① ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清を分画分子量 1 0万〜 5 0万、 及び 1 0 0 0 ~ 5万の限外濾過膜を用いて処理する。
② 5 0〜 70でで 3 0分〜 5時間加熱処理する。
③ pH 3〜5で酸処理する。
④ 分画分子量 1 0万〜 5 0万の限外濾過膜を用いて処理する。
⑤ 13〜5、 塩濃度0. 0 1〜 2 Mの条件下で陽イオン交換体に接触 させた後に pH 8〜l 0、 塩濃度 0. 2〜0. 5Mの条件下で溶出する。
⑥ pH 6〜8、 塩濃度 0. 0 1〜0. 5 Mの条件下で疎水性クロマト用担体 に接触させて、 非吸着画分を回収する、 そして
⑦ pH 6〜8、 塩濃度 0. 0 1〜0. 1 Mの条件下で陰イオン交換体に接触 させて、 非吸着画分を回収する。
また、 前記工程⑥の代わりに、 pH 6〜8、 塩濃度 1〜3Mの条件下で疎水性 クロマト用担体に接触させた後に、 pH 6〜8、 塩濃度 0. 0 1〜 5Mの条 件下で溶出する工程、 または前記工程⑦の代わりに、 pH 6〜8、 塩濃度 0.001 〜0. 0 5Mの条件下で陰イオン交換体に接触させた後に、 pH 6〜8、 塩濃度 0. 0 5〜1 Mの条件下で溶出する工程、 さらには前記工程⑤と⑥の間、 ⑥と⑦ の間、 または⑦の後で、 pH 3〜5、 塩濃度 0. 5〜3Mの条件下で塩析処理し、 沈澱画分を回収する工程をさらに含むものであってもよい。
(3) HSAの Cu—キレートクロマトグラフィーによる処理
本発明の HSAの Cu—キレートクロマトグラフィ一による処理工程は、 好適 には上記精製工程の最後に組み込まれ、 Cu2+塩含有溶液、 例えば Cu S〇4 溶 液を流すことにより C u 2+を結合させたキレート樹脂と HSAを含有する画分を 接触することにより行われる。
当該キレート樹脂の担体は、 通常の不溶性担体であれば特に限定されず、 親水 性ビニルポリマー、 架橋デキストラン （商品名セフアデックス） 、 ァガロース （ 商品名セファロース） 、 セルロース （商品名セル口ファイン） 等が挙げられる。 一方、 リガンド部は、 イミノジ酢酸基が挙げられる。 当該キレート樹脂は、 金属 キレートァフィ二ティークロマトグラフィー用に市販されているものであればい ずれでも使用できるが、 例えば、 AF—キレートトヨパール 650 (東ソ一社製） ， Chelating Sepharose 6 B (フアルマシア製） 、 Chelating Sepharose FF (ファ ルマシア製） 、 キレートセル口ファイン （生化学工業製） 等が好適に使用される。 当該キレート樹脂による処理条件は、 好適には次の通りである。
〔リニアグラジェント法による場合〕
まず、 Cu2+結合キレート樹脂を平衡化，洗浄する。 平衡化，洗浄には塩濃度 0. 1〜1M, pH5〜7程度の緩衝液を用いる。 具体的には 0. 1〜1M塩化 ナトリウム添加 1 0〜 1 0 OmM酢酸、 リン酸またはトリス一塩酸等の緩衝液 （ pH5〜7) が例示される。 次いで、 HSA含有画分を Cu2+結合キレート樹脂 にアプライし、 拮抗剤を含む上記緩衝液を用いてリニァグラジヱント法により H S Aを分離 '溶出させる。 拮抗剤としては塩化アンモニゥム、 イミダゾール、 ヒ スチジン、 システィン、 グリシン、 ヒスタミン等が例示されるが、 リニアグラジ ェントの最大濃度としては塩化ァンモニゥムで 1〜 3 M程度、 他の拮抗剤で 0.01 〜0. 1M程度が示される。
〔パス法による場合〕
まず、 Cu2+結合キレート樹脂を平衡化 ·洗浄する。 平衡化 ·洗浄には拮抗剤 を含む塩濃度 0. 1〜1M, pH5〜7程度の緩衝液を用いる。 拮抗剤は上記拮 抗剤が例示される。 緩衝液としては、 具体的には 0. 1〜1M塩化ナトリウム添 加 1 0〜 1 0 OmM酢酸、 リン酸またはトリス一塩酸等の緩衝液 （pH 5〜7) が例示される。 次いで、 HSA含有画分を Cu2+結合キレート樹脂にアプライし、 非吸着画分を回収する。 好ましくは上記の拮抗剤を含む塩濃度 0.1 〜 1 M, p H 5〜 7程度の緩衝液を用いて平衡化した C υ 2+未結合キレート樹脂からなるカラ ムを Cu2+結合キレート樹脂カラムの下位に接続した系を用いて HS Aの精製を 行う。
HS Aと Cu2+結合キレート樹脂の混合比としては、 HSA lmgに対して樹 脂 0. 0 0 1〜0. 1 m l、 好ましくは 0. 0 0 2〜0. 0 1 m 1が例示される t 上記の工程 （①〜⑦および塩析処理、 さらに Cu—キレートクロマトグラフィ —を含む） を経て得られた HS Aの E L I S A法による純度は 1 X 1 0— 9〜5 x 1 0— 8 (最良値： 2. 78 X 1 0— 9) (酵母由来成分/ r一 HSA) 程度である。 この純度は Cu—キレートクロマトグラフィー処理前の純度より約 1 0 0倍高い。 ( 4 ) 製剤化
得られた HS Aは公知の手法 （限外濾過、 安定化剤の添加、 除菌濾過、 分注、 凍結乾燥等） により製剤化することができる。 こうして調製された HSA製剤は 注射剤として血漿由来 HS A製剤と同様に臨床上用いることができる。 また、 医 薬品の安定化剤あるいは担体、 運搬体としても利用可能である。
「発明の効果」
本発明によれば、 遺伝子操作により産生される HS Aについて、 従来の遺伝子 操作由来 HS Aの精製方法では充分に除去することができなかった酵母由来成分 を除去し、 世界保健機構 （WHO) が推奨する組換え型医薬品の純度を達成し得 た高度に精製された HS Aを提供することができる。 また、 酵母由来成分が除去 されることにより、 抗原性が除去され、 ァレルギー反応等の副作用を抑えること が期待できる。
「実施例」
本発明をより詳細に説明するために、 実施例を挙げるが、 本発明はこれらによ つて何ら限定されるものではない。
参考例 1 HS A産生宿主の培養
(1) 使用菌株： Pichia pastoris GCP101株
特開平 2— 1 0 4 2 9 0号公報に述べられている方法により、 ピキアパストリ ス （Pichia pastoris)GTS 1 1 5 (111 8 4) の八0 1 遺伝子領域に、 A〇 X, プロモーター支配下に HSAが発現する転写ユニッ トを持つプラスミ ド p P GP 1の No t 1で切断した断片を置換して、 PC 4 1 3 0が得られている。 こ の株は AOX, 遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培地での増 殖能が低くなつている （Mu t—株） 。
P C 4 1 3 0を YPD培地 （ 1 %ィーストエキストラクト、 2 %バクトぺプト ン、 2%グルコース） 3mlに植菌し、 24時間後に初期〇D54。 = 0. 1 となる ように YPD培地 5 0 mlに植菌した。 3日間 30°Cで培養後に初期〇D54。 =0.1 となるように YPD培地 5 0 mlに植菌した。 さらに 3日毎に同様の継代を繰り返 した。 継代毎に菌体を 1 07 cells/plate になるように滅菌水で希釈して 2 % Me OH- YNBw/o a. a. プレート （0. 7 %イーストナイ トロジェンべ ースウイズアウトァミノアシッ ド、 2%メタノール、 1. 5%寒天末） に塗布し、 30°C5日間培養してコロニーの有無を判断した。 その結果、 1 2日間継代後に 塗布した 2 %Me OH— YNBwZo a. a. プレートから 20個のコロニーが 生じた。 このプレートでは Mu t—株はほとんど生育できず、 Mu t+株は生育 できる。 すなわち、 このプレートではコロニーが生じるということはメタノール の資化性が上昇し、 Mu t +に変換した株が得られたことを示している。 生じた コロニーの内の 1つを適当に滅菌水で希釈して 2 %Me OH— YNBwZo a. a. プレートに拡げシングルコロニーに単離した。 その 1つを GCP 1 0 1と名 付けた。
(2) 菌株の培養
(前々培養）
グリセロール凍結ストック菌株 lmlを 2001111の¥?0培地 （表 1 ) を含むバ ッフル付 1, 000 ml容三角フラスコに植菌、 30°Cにて 24時間振盪培養した。
表 1 ： YPD培地組成 成分 濃度 (g/L)
ィ一スト抽出物 10
ペプトン 20
グルコース 20
(前培養）
YPD培地 5 Lを含む 1 0 L容ジャーフアーメンターに前々培養液を植菌し、 24時間通気攪拌培養した。 培養温度は 30°C、 通気量は 5 LZ分とした。 また- 前培養においては p Hの制御は実施しなかった。
(本培養）
バッチ培養用培地 （表 2 ) 250 Lに前培養液を植菌し、 1, 200 L容ファ ーメンターを用いて通気攪拌培養した。 槽内圧は 0. SkgZcm2 、 最大通気量を 8 0 ON-L/min として溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度の 5 0 %〜3 0 %程度 を保持するように、 攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。 回分培養にお いて培地中のグリセロールが消費された時点よりフィード培地 （表 3) の添加を 開始した。 このフィード培地の添加にはコンピュータを使用し、 培地中にメタノ —ルが蓄積しないように制御しながら高密度培養を実施した。 PHは 2 8 %アン モニァ水を添加することにより、 pH 5. 8 5に定値制御した。 消泡は消泡剤 （ AdecanoU 旭電化工業製） を回分培養開始時に 0. 3 0 mlZL添加しておき、 そ の後は必要に応じて少量添加することで実施した。 表 2 ：バッチ培養用培地組成 成分 濃度 (/し）
グリセロール 50.0 g
H3P04 (85¾) 14.0 ml
CaS04 · 2H20 0.6 g
K2S04 9.5
MgS04 · 7H20 7.8 g
匪 2.6 g
ピオチン溶液 01) 1.6 ml
YTM溶液 2) 4.4 ml
(*1) ピオチン溶液 0.2g/L
2) YT 溶液 成分 濃度 (g/L)
FeS04 7H20 65.0
CuS04 5H20 6.0
ZnS04 7H20 20.0
Figure imgf000012_0001
表 3 ： フィ一ド培地組成 旦
成分 里
YT 溶液 2 ml
メタノール 1,000 ml
参考例 2
参考例 1の G CP 1 0 1株から単離した AOX 2プロモーター [変異型。 天然 型 AOX2プロモーター (YEAST, 5, 167-177 (1988)または Mol. Cell, Biol., 9, 1316-1323 (1989))中、 開始コドン上流の 255番目の塩基が Tから Cに変異 したもの] を用いて HSA発現用プラスミ ド pMMO 42を構築し、 ピキアパス トリス（Pichia pastoris) GTS 1 1 5株に導入し、 形質転換体 UHG42— 3 株を得た （特開平 4一 299984号公報） 。 参考例 1に準じてこの UHG 42 一 3株を培養し、 HSAを産生させた。
参考例 3 HSAの精製
[i] 培養上清の分離〜膜分画 （I I)
参考例 1、 または参考例 2で得られた培養液約 800 Lを圧搾することにより 培養上清を分離した。 培養上清を分画分子量が 30万の限外濾過膜で処理した。 次いで、 分画分子量が 3万の限外濾過膜を用いて液量を約 80Lに濃縮した 〔膜 分画 （ I ) 〕 。
この濃縮液を 60°C、 3時間の加熱処理後、 急速に約 15°Cに冷却し、 pH4.5 に 調整し、 再度分画分子量が 30万の限外濾過膜を用いて処理した 〔膜分画（II)〕 c 次いで、 分画分子量が 3万の限外濾過膜を用いてアルブミン溶液中の緩衝液を 50 mM塩化ナトリウムを含む 5 OmM酢酸緩衝液， pH4. 5に交換した。
[ii] 陽イオン交換体処理
5 OmM塩化ナトリウムを含む 5 OmM酢酸緩衝液， pH4. 5で平衡化した S—セファロース充塡カラムにアルブミンを吸着させ、 同緩衝液で十分洗浄した のち、 0. 3M塩化ナトリウムを含む 0. 1Mリン酸緩衝液、 pH9でアルブミ ンの溶出を行った。
[iii] 疎水性クロマト処理
S—セファロ一ス充塡カラムから溶出されたアルブミン溶液を 0. 1 5M塩化 ナトリウムを含む 5 OmMリン酸緩衝液， pH6. 8で平衡化したフエニルセル 口ファインを充填したカラムに添加した。 この条件ではアルブミ ンはフエ二ルセ ルロファインを吸着することなく、 カラムを通過した。
カラムを通過したアルブミンは、 分画分子量 3万の限外濾過膜を用いて液量を 約 50 Lに濃縮するとともに、 アルブミン溶液中の緩衝液を 5 OmMリン酸緩衝 液、 pH6. 8に交換した。
[iv] 陰イオン交換体処理
疎水クロマト処理後、 濃縮及び緩衝液交換を行ったアルブミン溶液を 5 OmM リン酸緩衝液， pH6. 8で平衡化した DEAE—セファロースを充塡したカラ ムに添加した。 この条件ではアルブミンは DEAE—セファロ一スに吸着するこ となく、 カラムを通過した。
実施例 1
予め精製水で洗浄しておいた Chelating Sepharose FF Column (016xi5cm, 30ml) に SmgZml CuSC 溶液を流し、 ゲルに C u 2+を結合させた。 カラム 内に遊離する Cu2+を 0.5 M塩化ナトリウムを含む 50mM Tris-HCl 緩衝液 （pH 7.0)、 または 50mMリン酸ナトリウム緩衝液（ρΗ6·0) で洗浄した後、 本カラムの下 位に C u 2+を結合させていない Chelating Sepharose FF Column (Φ 5 x20cm， 4ml, フアルマシア製） を接続し、 同緩衝液により平衡化を行った。
PD- 1 0 〔ゲル濾過担体である架橋デキストラン （商品名セフアデックス G 25， フアルマシア社製） を充塡したプレパックミニカラム〕 により同緩衝液組 成に変更しておいた、 上記参考例 1、 3を経て得られた精製！ ·—HS A含有サン プル 1 m 1 (1 1 8mg/ml, A35。 ZA28。 =0.0258) を本カラムにアプライし、 同緩衝液 100ml により洗浄を行った後、 2.00M塩化アンモニゥムを含む同緩衝液 にかけてのリニアグラジェント法（200ml) により吸着成分の分離 ·溶出を行った (流速 1. Oml/min. , 14ml/cm2/hr. )0 溶出した各画分について、 下記 （ィ） に記載する方法により HSA濃度と A350 /A28。 値を求め、 （口） に記載する方法による酵母由来成分濃度を求めた。 ぐ測定方法 >
(ィ） HP LCによるゲル濾過解析法
予め、 0. 1 %のアジ化ナトリウムと 0. 3 %の塩化ナトリウムを含む 5 0 m Mリン酸ナトリウム緩衝液 （pH 6. 5) で平衡化しておいた TSKgel G3000SWXL カラムに、 サンプルを 5 0〃 1インジェクションした。 同緩衝液を溶離液として 用い、 1 ml/minの流速で、 サンプル成分の分離を行った。 検出は A28。 と A350 により行い、 2. 5 DigZml血漿由来のアルブミンのピーク高を用い、 相対的に検 体中に含まれるアルブミン濃度を算出した。
(口） EL I S Aによる酵母由来成分の測定法
5 OmM炭酸緩衝液 （pH 9. 6) で 9 6 0倍に希釈した抗体溶液をプレート に 1 0 0 1ノウヱル添加し、 室温で一昼夜静置した。 0. 0 5 %Twe e n 20を含む 0. 9 %Na C 1溶液で 1回洗浄後、 1 %スキムミルクを含む P B S を 20 0 1ノウヱル添加し、 室温で 2時間静置した。
0. 0 5%T e e n 20を含む 0. 9 %N a C 1溶液で 1回洗浄後、 検体 を 5 0 1 ウエル添加し、 37 °Cで 3時間静置した。
0. 0 5 %Twe e n 20を含む0. 9 %N a C 1溶液で 6回洗浄後、 1 % スキムミルクを含む PBSで 1万倍に希釈した B i 0 t i n— Ab溶液を 50 1 /ゥエル添加し、 37°Cで 2時間静置した。
0. 0 5 %Twe e n 20を含む0. 9 %N a C 1溶液で 6回洗浄後、 1 % スキムミルクを含む PBSで千倍に希釈した A V i d i n— HRP溶液を 50 1 ゥヱル添加し、 37 °Cで 1時間静置した。
0. 0 5 %Twe e n 20を含む 0. 9 %N a C 1溶液で 6回洗浄後、 基質 5 0 1 /ゥヱル添加して室温で 3 0〜 6 0分間静置後、 2 N硫酸 5 0 1 ウ エルを加え反応を停止し、 各ゥエルの A4S。 を測定した。
検体の代わりに既知量の酵母由来成分を添加したものより標準曲線を作成し、 検体中に含有される酵母由来成分量を求めた。 各溶出画分の r一 HSAモノマー濃度と酵母由来成分濃度を図 1に示した。 ま た、 各溶出画分の r— HS Aモノマー濃度と A35。 ZA28。 値を図 2に示した。
r -HS A及び酵母由来成分は拮抗剤フリーの条件で全てカラムに吸着された c 吸着された双方は拮抗剤 （塩化アンモニゥム） 濃度の上昇に従い溶出され、 r— H S Aのピークの方が酵母由来成分のピークより低濃度領域で溶出され、 しかも 双方のピークはかなり離れており、 良好な分離能を示した。
実施例 2
予め精製水で洗浄しておいた Chelating Sepharose FF Column (Φ16Χ5 η, 10ml) に 5mgZml CuS04 溶液を流し、 ゲルに C u 2 +を結合させた。 カラム 内に遊離する Cu2+を 0. 5 M塩化ナトリウム及び各濃度 （1. 8M, 2. 1 M, 2. 4M) の塩化アンモニゥムを含む 50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0) で洗 浄した後、 本カラムの下位に C u2+を結合させていない Chelating Sepharose FF Colu隠 （(D5 x5cm, 1 ml) を接続し、 同緩衝液により平衡化を行った。
PD- 1 0 (前出） により同緩衝液組成に変更しておいた、 上記参考例 1、 3 を経て得られた精製 r一 HSA含有サンプル 2m 1 (144 mg/ml, A35。/A280 = 0.0253)を本カラムにアブライし、 同緩衝液 98 mlを流し、 キレートクロマト グラフィーカラム非吸着成分を回収した （流速 0.5 ml/min, 7 ml/cm Vhr) 。 実施例 1と同様にして HSA濃度 （HPLCにより定量） 、 ならびに酵母由来 成分濃度 （EL I S Aにより定量） を求めた。 結果を表 4にまとめる。 表 4 ： r— HSAの Cu—キレートクロマトグラフィー精製結果
NH4C1(M) 回収率 ( > 酵母由来成分ノ HSA A350/A 280 供試サンプル 一 1.11X10-7 0.0253
1.8 51 1.95x10- 9 0.0237
2.1 68 2.92X10- 9 0.0249
2.4 93 2.78X10"9 0.0241 塩化アンモニゥム濃度の上昇に従い、 r一 H S Aの回収率が高くなり、 2 . 4 IV [の塩化アンモニゥムの系では回収率が 9 3 %であった。
純度は r一 H S Aモノマー濃度に対する酵母由来成分濃度の比率で提示したが、 キレートクロマトグラフィ一処理前の純度と比較して、 3つの系全てにおいて、 2オーダーに近い純度の向上が認められた。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 遺伝子操作により産生されるヒト血清アルブミンを含有する画分を C u— キレートクロマトグラフィーで処理することを含むヒト血清アルブミンの高度精 製方法。
2 . 遺伝子操作により産生されるヒト血清アルブミンを含有する画分の C u— キレートクロマトグラフィーによる吸着成分を、 塩化アンモニゥムを含有し、 か つ p H 5〜 7付近の緩衝液にて溶出することを特徴とする請求の範囲第 1項記載 の方法。
3 . C u—キレ一トク口マトグラフィ一処理が、
(a) 遺伝子操作により産生されるヒト血清アルブミ ンを含有する画分を、 C uィ オンを結合させたキレートクロマトグラフィー担体と接触させ、
(b) 担体に吸着されたヒト血清アルブミンを、 拮抗剤を含有する p H 5〜7付近 の緩衝液を用いて溶出させることを含む請求の範囲第 1項記載の方法。
4 . 拮抗剤が塩化アンモニゥム、 イミダブール、 ヒスチジン、 システィン、 グ リシンおよびヒス夕ミンからなる群より選択される請求の範囲第 3項記載の方法。
5 . 拮抗剤が塩化ァン乇ニゥムである請求の範囲第 4項記載の方法。
6 . 緩衝液が 1〜 3 M塩化ァンモニゥムを含有する請求の範囲第 5項記載の方
7 . キレートクロマトグラフィー担体のリガンドがィミノジ酢酸基である請求 の範囲第 3項記載の方法。
8 . C u—キレートクロマトグラフィー処理が、
(a) 遺伝子操作により産生されるヒト血清アルブミ ンを含有する画分を、 C uィ ォンを結合させ、 拮抗剤を含有する p H 5〜 7付近の緩衝液で平衡化したキレ一 トクロマトグラフィー担体と接触させ、
(b) 非吸着画分を回収することを含む請求の範囲第 1項記載の方法。
9 . 拮抗剤が塩化アンモニゥム、 イミダゾール、 ヒスチジン、 システィン、 グ リシンおよびヒスタミンから選択される請求の範囲第 8項記載の方法。
10. 拮抗剤が塩化ァンモニゥムである請求の範囲第 9項記載の方法。
11. 緩衝液が 1〜3M塩化アンモニゥムを含有する請求の範囲第 10項記載の方
12. キレートクロマトグラフィー担体のリガンドがィミノジ酢酸基である請求 の範囲第 8項記載の方法。
13. Cu—キレートクロマトグラフィー処理の前に以下の①〜⑦の工程を含む 精製処理を行う請求の範囲第 1項記載の方法。
①遺伝子操作により産生されるヒト血清アルブミンを含有する画分を、 分画分 子量 1 0万〜 5 0万、 及び 1 0 0 0〜 5万の限外濾過膜を用いて処理する。
② 5 0〜 7 0 °Cで 3 0分〜 5時間加熱処理する。
③ pH 3〜5で酸処理する。
④ 分画分子量 1 0万〜 5 0万の限外濾過膜を用いて処理する。
⑤ 113〜5、 塩濃度0. 0 1〜0. 2 Mの条件下で陽イオン交換体に接触 させた後に pH 8〜l 0、 塩濃度 0. 2〜 5Mの条件下で溶出する。
⑥ pH 6〜8、 塩濃度 0. 0 1〜0. 5 Mの条件下で疎水性クロマト用担体 に接触させて、 非吸着画分を回収する、 そして
⑦ pH 6〜8、 塩濃度 0. 0 1〜0. 1 Mの条件下で陰イオン交換体に接触 させて、 非吸着画分を回収する。
14. ヒト血清アルブミンが遺伝子操作により調製された酵母により産生された ものである請求の範囲第 1項記載の方法。
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