CN110305891B

CN110305891B - 一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法

Info

Publication number: CN110305891B
Application number: CN201910633290.6A
Authority: CN
Inventors: 刘泽寰; 林蒋海; 戴钰
Original assignee: Guangzhou Low Carbon Biotechnology Research Institute Co ltd; Shenzhen Jiadaogu Investment Management Co ltd; Guangdong Recyclean Low Carbon Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Recyclean Low Carbon Technology Co ltd; Guangzhou Low Carbon Biotechnology Research Institute Co ltd; Shenzhen Jiadaogu Investment Management Co ltd
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2039-07-12
Also published as: CN110305891A

Abstract

验证CRISPR‑Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法，步骤：S1、测定产朊假丝酵母染色体倍数；S2、构建带Cas9片段的产朊假丝酵母表达载体；S3、构建含tRNA_Glu基因、sgRNA下游表达单元的sgRNA初步质粒；S3、选定预敲除和靶点序列，在靶点及互补序列5’端加粘性末端，退火成双链，与初步质粒结合成sgRNA成熟重组质粒；S5、构建含敲除序列的重组供体片段；S6、sgRNA成熟重组质粒转化带Cas9片段的产朊假丝酵母；S7、成熟重组质粒和供体转化携带Cas9的产朊假丝酵母；检测敲除或敲除并引入外源基因的基因表达变化或表型变化验证Cas9介导产阮假丝酵母基因敲除是否可行。

Description

一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法

技术领域

本发明涉及基因敲除领域，更具体地，涉及一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法。

背景技术

自从CRISPR-Cas9技术被报道以来，已经成功应用于各种生物进行基因敲除的研究，包括动物、植物、细菌、单倍体或二倍体酵母。而产朊假丝酵母是一种多倍体酵母，无有性世代，无单倍体菌株。因此，目前对产朊假丝酵母进行基因敲除操作，通常利用Cre-loxP重组酶系统对其进行基因改造，该方法先利用同源重组机制敲除多倍体酵母的一个等位基因，然后借助Cre-loxP系统去除抗生素抗性基因，再敲除另一个等位基因；重复敲除等位基因和去除抗生素抗性基因的步骤直至所有等位基因被敲除。此外，也可利用Cre-loxP重组系统对产朊假丝酵母酵母的URA3进行敲除以构建营养缺陷型菌种，整个敲除过程需要重复四轮才能完成目标菌种的构建。

上述对产朊假丝酵母基因敲除的过程繁琐复杂，因此在产朊假丝酵母中构建一套简单、方便、高效的敲除体系，对于产朊假丝酵母的基因功能及代谢工程改造显得至关重要。但CRISPR-Cas9系统，以下简称Cas9系统，能否应用于产朊假丝酵母的基因敲除仍是未知的，因此，CRISPR-Cas9系统也未应用于产朊假丝酵母的基因敲除，也无法构建一种由Cas9系统介导的产朊假丝酵母基因敲除体系。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法，利用CRISPR-Cas9系统对产朊假丝酵母目标基因进行敲除，验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性，并通过敲除的同时引入外源基因，进一步确认验证结果；同时，提供了对产朊假丝酵母功能性基因敲除的方法。

本发明采取的技术方案是，

一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法，包括以下步骤：

S1、测定产朊假丝酵母染色体的倍数，基因敲除需要考虑到目标菌种的染色体倍数，在不确认倍数的前提下，是否完整敲除难以确认；而不完整敲除则会导致多倍体的回复突变，影响敲除率；因此，在进行基因敲除前获得目标产朊假丝酵母的染色体倍数至关重要。优选的，步骤S1中通过碘化丙啶PI测定细胞DNA含量，并以酿酒酵母的单倍体和二倍体细胞作为参照以确定产朊假丝酵母的染色体倍数，并能通过流式细胞仪进行PI荧光强度的检测，并根据参照菌株分析产朊假丝酵母染色体倍数。

S2、使用限制性核酸内切酶对酵母Cas9表达载体和第一产朊假丝酵母游离型表达载体进行双酶切，并连接产生的Cas9片段和游离型表达载体骨架片段，获得重组质粒pCGGαAL-Cas9；提取酵母Cas9表达载体质粒和第一产朊假丝酵母游离型表达载体质粒后，对两个质粒进行双酶切，双酶切则保证了Cas9片段与第一游离型表达载体骨架片段的导向性连接，避免基因片段连接方向出错，减小了后续筛选过程的工作量。对酶切片段进行琼脂凝胶电泳并胶回收包含Cas9编码区的片段与第一游离型表达载体骨架片段。将回收到的不含启动子的Cas9表达盒片段和含有启动子的第一游离型表达载体片段进行连接，优选的，Cas9表达盒与游离型表达载体骨架按照摩尔比10:1的比例进行连接。

优选的，连接产物还需进行阳性转化子的鉴定，所述阳性转化子鉴定采用PCR鉴定方式。进行阳性转化子鉴定后，挑选单株阳性转化子，提取并获得重组质粒pCGGαAL-Cas9，即将Cas9片段转入至在产朊假丝酵母中可自主复制的游离型表达载体中。

优选的，获得重组质粒后还需进行阳性克隆筛选、Cas9基因表达检测、质粒拷贝数鉴定，以挑选能够转化成功的质粒并确认转化后的重组质粒pCGGαAL-Cas9能在产朊假丝酵母中正常表达；优选的，所述阳性克隆筛选利用游离型表达载体所携带的抗性基因进行培养筛选，经多代培养后提取多代后克隆体的酵母基因组进行PCR扩增鉴定；优选的，Cas9基因表达检测采用RT-PCR方式检测；优选的，通过相对定量法，以产朊假丝酵母中的个别酶基因作为对照来测定Cas9基因在产朊假丝酵母中的拷贝数。

S3、扩增产朊假丝酵母编码谷氨酸的转运RNA（tRNAGlu）基因、sgRNA下游表达单元，并分别引入ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点，tRNAGlu基因与sgRNA扩增产物通过酶切位点进行重叠PCR连接；重叠后的片段以及第二产朊假丝酵母游离型表达载体经双酶切后连接在一起，获得载体pGlu-sgRNA。根据产朊假丝酵母CTC密码子的tRNA序列，以产朊假丝酵母基因组为模板扩增得到tRNAGlu片段，将tRNAGlu片段作为加工后的sgRNA转录启动子，有助于提高基因编辑效率。成熟sgRNA全长96 bp，由20 bp靶位点识别序列以及76 bp的sgRNA结构区构成，如果想更换一个靶位点，仅仅只需要更改这20 bp的识别序列，而ⅡS类限制性核酸内切酶具有切割位点在识别位点之外的特点，利用ⅡS类限制性核酸内切酶能够不受酶切位点的限制而根据需要插入目标序列；以BsmBI为例， BsmBI为ⅡS类限制性核酸内切酶，识别CGTCTCNNNNN，切割位点为最后一个C下游的第二个碱基，产生4个碱基的5’突出粘性末端，因此可以不受酶切位点的限制而根据需要插入目标序列，利用BsmBI的特点，如图1所示，在sgRNA表达载体上引入一段包含两个连续但方向相反的BsmBI位点的序列，酶切后可以产生两个不同的5’突出粘性末端，而且不会有酶切位点识别序列残留。如此，在构建新的sgRNA表达载体时，只需要在20 bp的识别序列，两个5’端加上与BsmBI酶切后产生的粘性末端的互补序列，即可方便的将识别序列连接到表达载体上，从而构建出针对新靶位点的sgRNA载体。相对于其他ⅡS类限制性核酸内切酶同样可以采取上述方式，进行新识别序列的构造。

优选的，所述sgRNA下游表达单元包括sgRNA的结构区和转录终止子区。

优选的，扩增tRNAGlu 基因片段、sgRNA下游表达片段时，引入ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点，方便构造新识别序列，同时利用该ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点可进行tRNAGlu 基因片段、sgRNA下游表达片段的重叠PCR连接，构造能够插入识别位点的加工后sgRNA。

优选的，本发明以tRNA作为sgRNA的转录启动子；根据文献Expression of CRISPR/Cas single guide RNAs using small tRNA promoters可知，依靠tRNA转录后加工过程，产生成熟的sgRNA可以获得比常用的SNR52启动子更高的基因编辑效率。根据产朊假丝酵母的密码子使用频率，本发明选择了谷氨酸（Glu）CTC密码子的tRNA作为sgRNA的启动序列。除此之外，采用其他表达水平较高的转运RNA基因也可进行验证。

优选的，S2具体包括以下步骤：

（1）扩增产朊假丝酵母编码谷氨酸的转运RNA（tRNAGlu）基因，扩增过程中的下游引物5’端引入ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点；扩增sgRNA下游表达单元，扩增过程中的上游引物5’端引入方向相反的两个ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点；所述sgRNA下游表达单元包括sgRNA的结构区以及转录终止子区，sgRNA扩增过程中，上游引物单链状态下5’端引入的一端序列在引物产生互补链成为双链时形成方向相反的两个ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点。

（2）将扩增的tRNAGlu基因与sgRNA扩增产物进行重叠PCR连接获得连接产物，分别对连接产物和第二产朊假丝酵母游离型表达载体进行双酶切，并连接酶切后的连接产物、游离型表达载体骨架片段，获得载体pGlu-sgRNA。扩增后的tRNAGlu基因与sgRNA扩增片段通过相同方向的ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点进行重叠PCR连接，以结合tRNAGlu基因片段和sgRNA基因片段，并提供方向相反的ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点以供靶点识别序列替换或插入。获得重叠PCR片段后，提取第二产朊假丝酵母游离型表达载体质粒，对该质粒、重叠PCR片段进行双酶切获得sgRNA表达盒和游离型表达载体骨架。将所述sgRNA表达盒和第二游离型表达载体骨架进行连接；所述双酶切位点并不与ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点交叉，双酶切采用的具体酶与所述具体的ⅡS类限制性核酸内切酶不同。优选的，sgRNA表达盒片段与第二游离型表达载体骨架按照摩尔比10:1的比例进行连接。

优选的，获得sgRNA表达盒和第二游离型表达载体骨架连接后需进行阳性转化子的鉴定，进行阳性转化子鉴定后获得载体pGlu-sgRNA。

上述第一、第二产朊假丝酵母游离型表达载体具备双酶切位点，能够在产朊假丝酵母中进行自主复制。所述酵母Cas9表达载体具备双酶切位点，Cas9编码区处于双酶切位点之间，且Cas9编码区两端的酶切位点应满足酶切连接后Cas9启动子下游单元表达方向与第一产朊假丝酵母游离型表达载体表达方向一致。同理，sgRNA表达盒与第二产朊假丝酵母表达载体基因上下游表达方向一致。

优选的，步骤S2中双酶切采用的酶为限制性内切酶SpeI和KpnI；步骤S3双酶切采用的酶为限制性内切酶PstI和BamHI。

S4、根据预敲除序列选择靶点识别序列，所述靶点识别序列长20bp；sgRNA具有用于识别预敲除序列的靶点序列，选择预敲除序列后，将包含于预敲除序列内的具有特异性的靶点序列片段转化为sgRNA识别序列，有助于sgRNA根据靶点序列识别预敲除序列，从而针对性的敲除目标基因。根据pGlu-sgRNA载体为识别序列所预留的酶切结合位点，分别在靶点序列及互补序列的5’端加上ⅡS类限制性核酸内切酶产生的粘性末端，经退火形成带有5’突出粘性末端的双链片段，将双链片段与ⅡS类限制性核酸内切酶酶切载体pGlu-sgRNA后获得的骨架连接，获得重组质粒pGlu-sgRNA-预敲除序列，该质粒表达的sgRNA与Cas9系统配合能够实现对产朊假丝酵母目标基因的识别和敲除。

优选的，上述ⅡS类限制性核酸内切酶为BsmBI酶。

优选的，预敲除序列选定为PDC1基因编码区序列，所述PDC1为产朊假丝酵母的丙酮酸脱羧酶基因（PDC1），所选的靶点序列为：

ACCATGAGCGAAATCACATT，如序列表SEQIDNo.1所示。

S5、构建含有敲除序列的同源重组供体基因片段；包含有预敲除序列的成熟sgRNA能够对携带Cas9片段的产朊假丝酵母基因组进行敲除，但敲除的结果容易受到干扰，从而影响到验证过程的结果。在此，提供一种包含敲除序列的同源重组供体片段，结合该片段和包含有预敲除序列的成熟sgRNA对携带Cas9片段的产朊假丝酵母进行同源重组，从而进一步确认敲除的有效性，增强验证过程的可信性。

所述步骤S5中的同源重组供体片段构建的步骤具体包括：

（1）设计上下游引物扩增供体片段，供体片段即外源基因可从GenBank等网站获得全序列，进而实现供体片段的构建，在供体片段构建完成后可转化结合其他表达载体形成带有供体片段的克隆载体。通过上下游引物，供体片段能够得到扩增；优选的，供体片段可选择为外源基因的编码区，并在其前后连接预敲除序列的启动子、终止子、部分CDS片段，从而使外源基因易于表达。

（2）设计特异性引物分别扩增预敲除序列的启动子、终止子、CDS片段，引入重叠PCR片段序列，将所述终止子、CDS片段通过重叠PCR连接；以产朊假丝酵母的基因组为模板，根据产朊假丝酵母预敲除序列的启动子、终止子以及CDS区序列，设计特异性引物并在上下游引物的5’端分别加上限制性酶切位点。同时在CDS区序列上游引物的5’端加上终止子末端的20个碱基，以作为重叠PCR的引物。以产朊假丝酵母的基因组为模板，利用特异性引物扩增得到启动子启动子、终止子以及部分CDS片段。利用特异性引物将终止子和部分CDS片段的PCR产物通过重叠PCR连接到一起，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，然后回收纯化PCR产物，产物为终止子-CDS片段。

（3）依次将所述启动子、终止子-CDS片段克隆进携带供体片段的表达载体中，经筛选、测序验证、酶切后获得同源重组片段预敲除序列-供体-TT-CDS。将产朊假丝酵母的启动子和携带有供体片段的克隆载体分别进行双酶切后，将胶回收得到的预插入序列启动子片段与携带有供体片段的克隆载体进行连接，转化大肠杆菌后利用启动子上游引物和供体片段下游引物作为特异性引物筛选阳性克隆。以M13F引物测序验证，测序正确的克隆为预插入序列启动子-供体片段克隆载体。将上一步骤中连接好的产朊假丝酵母终止子-CDS片段和预插入序列启动子-供体片段克隆载体分别双酶切后，再将终止子-CDS片段与预插入序列启动子-供体片段克隆载体进行连接，转化大肠杆菌后利用特异性引物供体片段上游引物和预插入序列-终止子下游引物筛选阳性克隆。以M13R引物测序验证，测序正确的克隆其命名为预敲除序列-供体-TT-CDS克隆载体。对该克隆载体进行双酶切后获得预敲除序列-供体-TT-CDS同源重组供体片段。

优选的，步骤S5中的供体片段为米根霉（rhizopus oryzae）的乳酸脱氢酶基因LDHA。

优选的，所述供体片段为未修改编码序列的外源基因或根据产朊假丝酵母密码子偏好性进行密码子优化后的外源基因序列。通过Genbank等网站获得公布的供体片段，能够通过PCR扩增或加左右同源臂与预敲除序列进行部分同源重组，但外源基因基于原序列和宿主基因组的同源重组效率不高。为了提高外源基因在产朊假丝酵母基因组的表达水平、效率，则可以对供体进行优化；在获得供体片段基因序列的同时能够获得其编码的氨基酸序列，根据产朊假丝酵母密码子的偏好性，针对于目标菌株产朊假丝酵母高频率使用的密码子，能够对供体片段进行密码子优化，从而使外源基因在目标基因组上能够得到高表达。

S6、重组质粒pGlu-sgRNA-预敲除序列转化携带重组质粒pCGGαAL-Cas9的产朊假丝酵母，经过测序验证或PCR鉴定或预敲除序列的基因表达水平测定，验证是否敲除成功，初步验证Cas9介导敲除产阮假丝酵母的目标基因是否可行；成熟sgRNA与Cas9系统共同作用，能够识别产朊假丝酵母基因组中的预敲除序列，即目标基因，而目标基因的敲除会导致产朊假丝酵母中该基因的表达水平发生变化，通过检测目标基因的表达水平或敲除后产朊假丝酵母基因序列能够直观的了解是否成功敲除，敲除的程度为多少。进而实现Cas9系统应用于产朊假丝酵母基因敲除的可行性。

S7、重组质粒pGlu-sgRNA-预敲除序列和重组供体片段转化携带重组质粒pCGGαAL-Cas9的产朊假丝酵母，经过测序验证或PCR鉴定或供体的基因表达水平测定进一步验证Cas9介导的产阮假丝酵母基因敲除是否可行。在步骤S6的基础上，进一步确认S6的敲除、验证结果；当S6单独转化成熟sgRNA时，敲除的成功及程度能够实现初步验证，但结合敲除并引入外源基因则能通过外源基因的表达了解是否敲除成功，对敲除过程增加了验证力度。

优选的，上述步骤中实际操作过程可能会涉及到大肠杆菌质粒提取、琼脂糖凝胶电泳、PCR或酶切产物回收纯化、凝胶回收DNA、制备大肠杆菌感受态细胞、大肠杆菌的转化、制备产朊假丝酵母感受态细胞、产朊假丝酵母的电转化、酵母基因组的提取、总RNA的提取、T载克隆等操作，该类操作均采用生物领域的通用方法，此类通用方法及步骤具体如下所示：

（一）大肠杆菌质粒的提取

收集5 mL过夜培养的菌液，参照天根生化科技有限公司的TIANprep MiniPlasmid Kit试剂盒提取质粒，具体步骤如下：（1）10,000 rpm 离心2 min，倒弃上清液，收集菌体。（2）加入300 μL Buffer P1/RNaseA混合液，彻底重悬细胞。（3）加入300 μLBuffer P2，轻轻混匀8次使菌体充分裂解，静置1 min。（4）加入400 μL Buffer P3，立即轻轻上下颠倒8次，充分混匀。10,000 rpm离心5 min。（5）将上一步的上清液倒入收集管吸附柱中，10,000 rpm离心1 min。（6）倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600 μL Buffer PD，10,000 rpm离心1 min。（7）倒弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入600 μL Buffer PW（已经用无水乙醇稀释），10,000 rpm离心1 min。（8）倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中,10,000 rpm离心2 min，室温放置8 min晾干柱子。（9）将吸附柱放置于干净的1.5 mL离心管中，向吸附膜的中间部位滴加80 μL50°C预热的H2O，室温放置3min，10,000 rpm离心3 min，丢弃柱子，用微量分光光度计测量其浓度后，质粒保存于-20℃。

（二）PCR产物或者酶切产物的琼脂糖凝胶电泳分析

参照《分子克隆实验指南（第三版）》，具体操作如下：（1）称取0.25 g琼脂糖，加入25 mL 1×TAE缓冲液后，使用微波炉加热使其溶解，冷却至55℃左右时，加入2 μL EB替代染料。混匀后将琼脂糖溶液倒入制胶板中，插入合适的梳子，室温下静置直至胶完全凝固。（2）取出梳子，将琼脂糖凝胶转移至电泳槽中，倒入1×TAE电泳缓冲液至没过凝胶。依次将5μL DNA maker和混有上样缓冲液的PCR产物加入凝胶孔中。（3）在120 V恒定电压下电泳15min左右后，将凝胶转移至凝胶成像仪中，紫外灯下观察结果并保存。

（三）PCR产物或者酶促反应液中DNA片段的回收纯化

根据凝胶DNA微量回收试剂盒HiPure Gel Micro Kit进行PCR产物或酶切产物的纯化回收，具体步骤如下：（1）短暂离心PCR产物或酶促反应液，用移液枪测量其体积后转移至1.5 mL的离心管中。（2）加入等体积的Buffer GDP,涡旋混匀。（3）将吸附柱子套在收集管中，并将上一步的混合液转至DNA吸附柱中。12,000×g离心1 min，倒弃滤液；（4）加入300 μL Buffer GDP至柱子中，静置2 min。12,000×g离心1 min，倒弃滤液；（5）加入600 μLBuffer DW2至柱子中。12,000×g离心1 min，倒弃滤液；（6）把柱子放回收集管中。12,000×g离心3 min；（7）把柱子套在1.5 mL离心管中，加入25 μL的50°C预热的无菌水至柱子膜中央，放置3 min。12,000×g离心2 min，丢弃柱子，用微量分光光度计测其浓度后，把DNA片段保存于-20°C。

（四）凝胶回收DNA片段

具体步骤：（1）琼脂糖凝胶电泳结束后，将凝胶放置于紫外灯下，然后迅速切下含有目的DNA片段的凝胶，并尽量去除多余的凝胶；（2）将切下的凝胶块转移至1.5 mL的离心管中，称取凝胶的重量。按1 mg凝胶块1 μL体积计算，加入等体积的Buffer GDP。50°C水浴20 min，期间上下颠倒离心管数次，让凝胶块溶解完全；（3）短暂离心收集液体后，将DNA吸附柱套在2 mL收集管中。把≤700 μL溶胶液转移至柱子中。12,000×g离心2 min；接下来的步骤按照上述方法（三）中的（4）～（8）步进行操作。

（五）大肠感受态的制备

大肠杆菌E.coli DH5感受态细胞的制备，参照《分子克隆实验指南（第三版）》[50]，具体操作如下：（1）取大肠杆菌DH5甘油保存菌以1%的接种量接种于5 mL LB液体培养基中，37°C，185 rpm摇床培养过夜；（2）取过夜培养的的大肠杆菌DH5以1%的接种量转接至50 mL LB液体培养基中，37°C，185 rpm培养，当培养液的OD600在0.3-0.4时停止培养；（3）将菌液转移至无菌的50 mL离心管中，冰浴15 min后，于4°C，6,000×g离心5 min；（4）倒弃上清液，加入30 mL预冷的0.1 M CaCl2溶液，轻轻重悬菌体；（5）冰浴30 min后，于4°C，8,000×g离心2 min；（6）用移液枪小心吸尽上清液，加入3~5 mL预冷的含15%甘油0.1 MCaCl2溶液轻轻重悬菌体，每管分装50 μL，置于冰上待用，或于-80°C保存。

（六）大肠杆菌的转化

具体步骤：（1）取10 μL连接产物或者质粒加入到50 μL新鲜制备的大肠杆菌感受态中，轻轻吸打混匀，于冰上静置30 min；（2）于42°C水浴热激90 s后，冰上静置5 min；（3）加入500 μL LB液体培养基，37°C，175 rpm复苏45 min；（4）8,000×g离心3 min后，倒弃大部分上清液，剩余约200 μL用来重悬菌体；（5）将重悬液全部涂于含相应抗生素的LB固体培养基上，于37°C恒温培养箱中倒置培养12 h左右。

（七）产朊假丝酵母感受态的制备

具体步骤：（1）产朊假丝酵母的活化：将产朊假丝酵母甘油菌以2%接种量接种于5mL YPD培养基中，30°C，200 rpm摇床培养24 h；（2）将活化后的产朊假丝酵母再次以2%的接种量接种于5 mL YPD培养基中，培养12 h左右，转接至100 mL YPD培养基中，使其初始OD600为1.0。30°C，200 rpm摇床继续培养3 h左右。稀释10倍后测菌液的OD600在0.3~0.5时，停止培养，开始制备感受态细胞；（3）将菌液转移至无菌的50 mL离心管中，冰上放置40min后，4°C，5,000×g离心5 min，倒弃培养基，往离心管中加入8 mL无菌水轻轻重悬菌体；（4）加入1 mL 10×TE Buffer，1 mL 1 M醋酸锂，轻轻混匀后于30°C，100 rpm孵育50 min；（5）之后加入300 μL 1 M DTT轻轻混匀，30°C，185 rpm孵育15 min；（6）加预冷的无菌水至50 mL，4°C，4,000×g离心8 min，倒弃上清；（7）加入5 mL预冷的1 M山梨醇溶液，轻轻吸打重悬菌体，4°C，4,000×g离心8 min；（8）倒弃上清，加入200 μL预冷的1 M山梨醇重悬菌体，使细胞终浓度约为1×1010个/mL；（9）将产朊假丝酵母感受态细胞以50 μL/管分装到预冷的1.5 mL无菌的离心管中，置于冰上待用。

（八）产朊假丝酵母的电转化

具体步骤：（1）向每管产朊假丝酵母感受态细胞中分别加入20 μL（约5 μg）的重组质粒，轻轻混匀，冰浴15 min后转移至预冷的电转杯中；（2）电压为1.8 kv，电击5 ms后，立即加入1 mL预冷的1 M山梨醇溶液并混匀，常温静置15 min；（3）在无菌条件下将电转杯中的菌液全部转移至无菌的4 mL离心管中，加入2 mL YPD液体培养基并混匀，于30°C，175rpm复苏4 h；（4）4,000×g离心8 min后，倒弃大部分上清液，剩余200 μL重悬菌体；（5）将菌体重悬液全部涂于含G418的YPD固体培养基上，30°C培养箱中倒置培养3-5天。

（九）酵母基因组的提取

根据美基生物公司的SolPure DNA Kits操作步骤：（1）吸取1 mL酵母培养液至1.5mL离心管，12,000×g离心2 min收集菌体；（2）加入300 μl Buffer SE，20 μL Lyticase（5U/μl）和20 μL（1 M）DTT至酵母细胞中。用移液枪重悬酵母细胞后，37°C水浴1 h；（3）12,000×g离心2 min收集酵母原生质体，小心弃去上清液；（4）加入400 μL Buffer WLB和2 μLRNase Solution至原生质体中，高速涡旋30 s后，65°C水浴45 min；冰上放置3 min后，加入100 μL Buffer PPS至裂解液中，涡旋30 s；（5）12,000×g离心5 min，收集上清液倒入新的1.5 mL离心管中；（6）加入400 μL异丙醇至上清液中；（7）颠倒离心管30次，12,000×g离心1min；（8）小心倒弃上清液，并将离心管反扣于吸水纸上吸干剩余的溶液；（9）加入500 μL70%乙醇至DNA沉淀中，涡旋混匀，12,000×g离心1 min；（10）小心倒弃上清液，把离心管反扣于吸水纸上，空气干燥15 min；（11）加入200 μL无菌水至DNA沉淀中，涡旋5 s；（12）65°C水浴45 min溶解DNA后，于-20°C保存。

（十）总RNA的提取

产朊假丝酵母总RNA的提取，参考博日科技有限公司的BIOZOL总RNA提取试剂操作步骤：（1）挑选培养至对数生长期的酵母细胞，将50 mL酵母培养液转移至50 mL的离心管中，4℃,12,000 g离心3 min收集菌体；（2）吸取菌体至研钵中，在液氮条件下将样品研磨成粉末；（3）在样本中加入1 mLBIOZOL后，将匀浆样品在室温下孵育15 min，使样品充分裂解至匀浆液呈透明；（4）将匀浆液4℃,12,000g离心5 min后,弃沉淀取上清；（5）按照1:5（氯仿:BIOZOL）的比例（v/v）加入200 μL氯仿。盖紧管盖,涡旋30 s混匀，将其置于冰上孵育15min后，于4℃，12,000×g离心10 min后取上清。（6）将上清液转移至干净的1.5 mL离心管中，加入等体积冰浴的异丙醇，上下颠倒10次混匀，将混匀的样品在-20℃条件下孵育40min，4℃，12,000×g离心10 min。（7）弃上清,加入1 mL冰预冷的75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次,颠倒洗涤离心管管壁,尽可能让沉淀悬浮起来，4℃，12,000×g离心10 min，再次去除上清后，在阴凉处适度干燥RNA沉淀。（避免过分干燥,那样会降低RNA的可溶性）（8）用50 μl的无RNase水溶解RNA。抽提好的RNA，可保存于-70℃。

（十一）T载克隆

（1）PCR产物加A：由于Prime STAR HS DNA Polymerase反应的产物是平末端，无法连接到T-vector上，因此需要加A反应，反应体系如下：

10×PCR Buffer2 μL

dNTPs(2.5 mM each)1 μL

DNA1 μg

Taq DNA polymerase0.5 μL

dd H2Oup to 20 μL

Total20 μL

72℃反应15 min后按照PCR产物纯化步骤纯化DNA，并用微量分光光度计测定DNA浓度，-20℃保存。

（2）按照Thermofisher DNA Ligase试剂盒说明书，纯化的DNA片段与pMD19-T载体连接，反应体系如下：

10×Buffer2 μL

pMD19-T1 μL

DNA2 μL

Ligase1 μL

ddH2O补至20 μL

将连接产物按照上述方法（六）转化大肠杆菌。

除上述通用方法之外也可根据根据量级或菌株的不同做适应性调整，也可采用类似原理的通用方法实现操作。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：应用CRISPR-Cas9系统至产朊假丝酵母的基因敲除，通过鉴定敲除后预敲除序列的表达水平或产朊假丝酵母组基因组序列确认是否成功将目标基因敲除，验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性；提供应用CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的方法，为产朊假丝酵母基因工程的改造提供了新策略，为高效、快速、稳定地进行工业酵母菌株的定向基因改造奠定基础，也为其它微生物细胞的基因修饰研究提供了借鉴，具体方法还包括含Cas9基因片段的产朊假丝酵母表达载体构建、sgRNA重组质粒构建以及靶点识别序列插入至sgRNA，并提供了功能性外源基因基于产朊假丝酵母预敲除序列启动子、终止子、CDS区进行供体片段构建的基本方法。同时，合理应用产朊假丝酵母高频表达的密码子，实现对重组供体片段的密码子优化。此外，根据产朊假丝酵母的基因表达状况，选择性的将tRNAGlu片段作为转录启动子，提高了产朊假丝酵母中基因编辑的效率；在sgRNA重组质粒过程中引入ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点，实现tRNAGlu和sgRNA下游表达单元扩增产物的重叠PCR连接，并利用ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点的特殊性在sgRNA下游表达单元扩增过程中引入方向相反的ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点，提供靶点识别序列插入点的同时不干扰tRNAGlu与其重叠PCR连接，实现了高效、简单的sgRNA加工。在进行单纯的基因敲除后实现了进一步验证，即通过同样的成熟sgRNA和同源重组供体片段转化产朊假丝酵母，根据供体片段的表达能够间接的验证敲除的效果，实现了多重验证。在整体的验证过程中，提供了一种简单、易操作的基因敲除方法，为后续产朊假丝酵母应用CRISPR-Cas9系统提供基础，在产朊假丝酵母的基因改造上具有实质性进步，并促进该类菌株在工业上的应用和发展。

附图说明

图1为BsmBI酶切位点示意图；

图2为产朊假丝酵母游离型表达载体pCGGαAL-Cas9构建流程图；

图3为含有pCGGαAL-Cas9的大肠杆菌菌落PCR鉴定图；

图4为pCGGαAL-Cas9转产朊假丝酵母阳性克隆的鉴定图；

图5为Cas9基因转录表达PCR鉴定图；

图6为tRNA_Glu启动子克隆电泳图；

图7为含有pGlu-sgRNA的大肠杆菌菌落PCR鉴定图；

图8为含pGlu-sgRNA-PDC1的大肠杆菌菌落PCR鉴定；

图9为乳酸脱氢酶基因LDHA嵌合片段基因整合示意图；

图10为含有供体片段的pUC57-PDC1p-LDHA-TT-CDS载体构建流程；

图11为所示PDC-pro片段PCR图；

图12为含pUC57-PDC-pro-LDHA的大肠杆菌菌落PCR图；

图13为PDC1-TT和PDC1-CDS重叠PCR产物图；

图14为PDC1-TT-CDS插入的大肠杆菌菌落PCR鉴定图；

图15为pUC57-PDC1p-LDHA-TT-CDS质粒双酶切结果；

图16为pGlu-sgRNA-PDC1转Cu-Cas9阳性克隆的筛选；

图17为PDC1p-LDHA-TT-CDS片段转化Cu-Cas9阳性克隆的筛选；

图18为蛋白定量标准曲线；

图19为乳酸脱氢酶酶活的测定；

图20为产朊假丝酵母游离型表达载体pCuARS-GAPGαA结构图；

图21为产朊假丝酵母游离型表达载体pCuARS-GAPZαAm结构图。

具体实施方式

以下内容为本发明的进一步说明，不应理解为对本发明的限制。在没有违背本发明所涉及的技术方法实质下，对本发明的中的方法、条件和步骤进行简单的改动均属于本发明要求保护的范围。

实施例

CRISPR-Cas9介导产朊假丝酵母中PDC1基因的敲除及LDHA基因插入

本实施例所用的产朊假丝酵母ATCC22023购于广东省微生物菌种保藏中心；酵母Cas9表达载体p415-GalL-hCas9和sgRNA表达载体p426-crRNA由Addgene公司提供；产朊假丝酵母游离型表达载体：pCuARS-GAPGαA、pCuARS-GAPZαAm，其中pCuARS-GAPGαA的结构和特殊序列如图20所示，pCuARS-GAPZαAm的结构和特殊序列如图21所示；引物合成及DNA测序由Invitrogen公司完成；引物序列-F代表上游引物，引物序列-R代表下游引物。

一、产朊假丝酵母染色体倍数的测定

酵母Cyberlindnera jadinii是Candida utilis近亲，它是二倍体，而产朊假丝酵母被认为是多倍体，基因组的倍性水平为2-5倍，通过FACS分析评估产朊假丝酵母DNA含量也并未解决产朊假丝酵母基因组水平的不确定性，因而对产朊假丝酵母进行PDC1基因敲除实验之前需要确定染色体的倍数。

测定酵母菌株的倍性可以通过碘化丙啶（PI）法测定细胞的DNA含量，然后通过与单倍体、二倍体标准菌株对比推算待测菌种的染色体倍数。由于产朊假丝酵母无单倍体或者二倍体细胞，而酿酒酵母的基因组大小约为12 Mb，产朊假丝酵母的基因组大小约为13Mb，因此本实验以酿酒酵母的单倍体和二倍体细胞作为参照来确定产朊假丝酵母的染色体倍数，每个样品做两个平行，具体操作如下：

（1）将野生型产朊假丝酵母菌株与酿酒酵母单倍体标准菌（W303A）、二倍体标准菌As2.489分别接种于5 mL YPD液体培养基中，30℃，200 rpm培养48 h，使细胞进入平台期。取1 mL菌液到1.5 mL离心管，8,000 rpm，离心10 min收集菌体，菌体重悬于1 mL PBS缓冲液中，8,000 rpm离心2 min，用PBS重复洗涤2-3次，然后用1 mL PBS重悬菌体。

（2）10,000 rpm离心2 min收集菌体，加入Buffer SE 300 μL、Lyticase（5 U/μL）20 μL、20 μL DTT，用移液枪吹打几次重悬细胞，37℃温浴1 h。10,000 rpm离心2 min收集菌体，加入10 mg/mL的RNaseA 10 μL，50℃水浴50 min消化RNA，然后再加入20 mg/mLproteinase K 40 μL，50℃水浴50 min。10,000 rpm离心2 min后收集菌体，重悬于1 mLPBS后稀释至108个细胞/mL菌液。

（3）上机前每1 mL样品加入20 μL 1 mg/mL的碘化丙锭（PI），避光反应15 min。

（4）用流式细胞仪检测细胞的PI荧光强度，分析产朊假丝酵母染色体倍数。

结果如表1所示，表1为染色体倍数的鉴定结果，单倍体标准菌株、二倍体标准菌株、产朊假丝酵母平均荧光强度比值大约为1:2:3。表明本研究的出发菌株产朊假丝酵母ATCC22023为三倍体菌株。

菌株平均荧光强度

单倍体酿酒酵母496.3250.325

二倍体酿酒酵母1069.00024

产朊假丝酵母147922

表1

二、产朊假丝酵母Cas9表达载体的构建与验证

1. 提取质粒p415-GalL-hCas9和pCuARS-PGAPGαA，然后用限制性内切酶SpeI和KpnI分别酶切p415-GalL-hCas9质粒和pCuARS-GAPGαA质粒,反应体系为50 μL：

p415-GalL-hCas9：5 μL

SpeI:5 μL

KpnI:5 μL

10×Green Buffer：5 μL

ddH2O：补至50 μL

37℃水浴1 h后，琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果并保存，胶回收含Cas9编码区的片段与质粒pCuARS-GAPGαA骨架片段。

2. Cas9表达盒与质粒pCuARS-GAPGαA片段的连接

将回收到的不含启动子的Cas9表达盒片段和含有GAP启动子的载体pCuARS-GAPGαA骨架按照摩尔比10:1的比例进行连接，连接体系为20 μL：

Cas9片段0.3pmol

pCuARS-PGAPGαA 0.03pmol

10×T4 DNA ligation buffer2μL

T4 DNA ligase1μL

ddH2O补至20μL

22℃连接1 h后，连接产物用来转化大肠杆菌DH5α，具体流程如图2所示。

3. 阳性转化子的鉴定

待平板上长出转化子后，用无菌的牙签挑取少量菌体混于预先配置好的20 μLPCR反应体系中进行PCR鉴定。本实施例中将菌株接种至含卡那霉素的LB平板，待含卡那霉素的LB平板长出单菌落即转化子，用无菌的牙签随机挑选5个单菌落用Cas9-F和Cas9-R进行菌落PCR鉴定，将菌体混于预先配置好的20 μL PCR反应体系。其中，阴性对照不含模板。反应体系为：

10×buffer（含有Mg2+）：15 μL

Cas9-F（10 µM）：3 μL

Cas9-R（10 µM）：3 μL

dNTPs（10 mM）：3 μL

Taq酶（2 U/μL）：3 μL

ddH2O：补至150 μL

然后分装，每管20 μL。反应条件为：

94°C5 min

94°C30 s

55°C30 s35 cycles

72°C1 min 30 s

72°C10 min

PCR鉴定结果如图3所示，其中M：DNA maker DL2000，1～5：挑取的单菌落，0：阴性对照，5个单菌落均为阳性克隆，挑选其中两株活化保种；并挑选一株阳性转化子，提取质粒后命名为pCGGαAL-Cas9，于-20°C保存。

三、重组质粒pCGGαAL-Cas9转化产朊假丝酵母

1. 阳性克隆的筛选

（1）将重组质粒pCGGαAL-Cas9通过电穿孔转化法转入产朊假丝酵母并涂布含G418的YPD固体培养基，待菌落长出后将在含G418的YPD固体培养基上长出来的单菌落划线至一个新的含G418的YPD固体培养基上，30°C倒置培养过夜；

（2）用无菌牙签挑选再次长起来的9个克隆分别接种于5 mL含G418的YPD液体培养基中。培养48 h左右提取酵母基因组，通过PCR扩增鉴定阳性克隆；

（3）进行PCR反应，反应体系为100 µL：

基因组模板：0.5 μL

10×buffer（含有Mg2+）：10 μL

Cas9-F（10 µM）： 2 μL

Cas9-R（10 µM）：2 μL

dNTPs（10 mM）：2 μL

Taq酶（2 U/μL）：2 μL

ddH2O：补至100 μL

反应条件为：

94°C5 min

94°C30 s

55°C30 s35 cycles

72°C1 min 30 s

72°C10 min

本实施例中的Cas9引物如表2所示；

基因引物名称引物序列（5’-3’）

Cas9Cas9-FCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACT

Cas9-RACTTGGGAAGCTTAATGATGAGGTC

表2

PCR反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。电泳结果如图4所示，其中M：DNA maker DL2000，1～9：挑取的单菌落，0：阴性对照，表明9个单克隆均为阳性克隆，将重组菌株命名为Cu-Cas9.

2. RT-PCR检测Cas9基因表达

挑选阳性重组产朊假丝酵母，接种于5 mL含G418的YPD液体培养基中，培养48 h左右，提取总RNA。通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），以RNA为模板经逆转录反应产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增从而检测Cas9基因是否表达。

（1）cDNA第一条链合成：

首先从制备好的总RNA中去除基因组DNA。在无RNase的PCR管中加入以下试剂：

总RNA1 μg

10×Reaction Buffer with MgCl21 μL

DNaseI（RNase-free）1 μL

Water（RNase-free）补至10 μL

将PCR管置于37℃反应30 min。然后加入1 μL 50 mM的EDTA在65℃反应10 min。将制备好的RNA作为反转录的模板。

（2）第一链cDNA合成

在PCR管中加入以下组分（先将RNA模板与RNase-free Water混匀，65℃孵育5 min后，冰浴2 min，然后加入其他反应组分）：

总RNA（已去除DNA）50 ng

5×TransScript All-in-One Super Mix for PCR4 μL

Cas9-R（10 μM）1 μL

RNase-free Water补至20 μL

轻轻混匀各组分,在25℃孵育10 min后，于42℃再孵育30 min；85℃加热5 s终止反应。按照以下体系继续进行PCR反应：

cDNA Template1 μL

Cas9-F（10 µM）：2 μL

Cas9-R（10 µM）：2 μL

dNTPs（10 mM）：2 μL

Taq酶（2 U/μL）：2 μL

ddH2O：补至50 μL

分装2管，反应条件为：

94°C5 min

94°C30 s

55°C30 s35 cycles

72°C1 min 30 s

72°C10 min

反应结束后，电泳检测PCR结果，结果如图5所示，其中M：DNA maker DL2000，1：PCR结果，电泳结果表明Cas9基因在产朊假丝酵母细胞内可正常转录表达。

3. pCGGαAL-Cas9质粒拷贝数鉴定

本实验采用相对定量法，以产朊假丝酵母木糖醇脱氢酶基因（xylitoldehydrogenase，xdh1）作为对照来测定Cas9基因在产朊假丝酵母中的的拷贝数。通过比较Cas9基因与产朊假丝酵母基因组上xdhl基因的相对含量关系，对Cas9拷贝数进行相对定量。挑选阳性重组产朊假丝酵母，接种于5 mL含G418的YPD液体培养基中。培养48 h左右，提取基因组DNA。参照荧光定量PCR试剂盒的说明书，按照下表配置PCR体系：

基因组DNA20 ng

正向引物（10 μM）0.4 μL

反向引物（10 μM）0.4 μL

2×Green qPCR Super Mix10 μL

ddH2O补至20 μL

反应条件为：

94°C30 s

94°C5 s

65°C30 s

Melt Curve

所述xdh1基因的引物如表3所示：

基因引物名称引物序列（5’-3’）

CuXDH1XDH1FCAAGGTCAACATCGAGCCTA

XDH1RCCATTGTGCAGGTTGAAGTC

表3

考虑到非理想状态下引物的扩增效率有可能达不到理论值，即100%，故将基因组按照10倍梯度进行8次稀释之后，分别作为模板进行扩增，并测定引物的实际扩增效率，计算Cas9基因的相对拷贝数，荧光定量PCR结果如表4所示，表4表示了重组酵母Cu-Cas9中Cas9基因的拷贝数，在重组产朊假丝酵母Cu-Cas9中，Cas9基因的拷贝数是基因组的8.22倍。

表4

四、构建sgRNA表达质粒

1. 质粒的提取

将分别带有p426-crRNA和pCuARS-GAPZαA的大肠杆菌接种到含有氨苄青霉素和博来霉素的LB培养基中，37℃，200 rpm培养过夜，提取质粒。

2. 产朊假丝酵母tRNAGlu基因的扩增

根据NCBI上公布的产朊假丝酵母基因组序列，设计特异性引物扩增产朊假丝酵母编码谷氨酸（CTC密码子）的转运RNA，tRNAGlu基因，在下游引物Cu-Glu-R-srna的5’端加上BsmBI序列（斜体），以作为重叠PCR的引物，序列如下：

Cu-Glu-F-PstI：

CTGGAGCTGAATTCTGCAGAATCTCACAACAACAAGAAAAATCCGGC

Cu-Glu-R-srna：

GCTATTTCTAGCTCTAAAACCGAGACGAGCGTCTCGTTCCGGTACGGGGAATCGAACC

使用TaKaRa高保真DNA聚合酶扩增，反应体系如下：

5×PCR Buffer (Mg2+)10 μL

dNTPs (2.5 mM each)4 μL

Cu-Glu-F-PstI (10 μM)1 μL

Cu-Glu-R-srna (10 μM)1 μL

基因组DNA0.5 μL

Prime STAR DNA Polymerase0.5 μL

ddH2O补至50 μL

PCR反应条件

98°C5 min

98°C30 s

55°C30 s35 cycles

72°C1 min

72°C10 min

在以产朊假丝酵母基因组为模板扩增得到tRNA_Glu后，进行琼脂糖凝胶电泳，如图6所示，其中M：DNA maker DL2000，1～2：PCR结果，扩增片段的大小约为100 bp，与预期长度一致。

3. 高保真酶扩增sgRNA下游表达单元

通过引物BsmBI-F和cr-RNA-R以p426-crRNA为模板扩增得到sgRNA下游表达单元（包括sgRNA的结构区以及转录终止子区）。引物序列如下：

BsmBI-F：GGAACGAGACGCTCGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG

cr-RNA-R：GTTATGGATCCGGTACCTTGACTAGTGGCCGCAAATTAAAGCCTTCG

使用TaKaRa高保真DNA聚合酶扩增，反应体系如下：

5×PCR Buffer (Mg2+)10 μL

dNTPs (2.5 mM each)4 μL

BsmBI-F (10 μM)1 μL

cr-RNA-R (10 μM)1 μL

p426-crRNA0.5 μL

Prime STAR DNA Polymerase0.5 μL

ddH2O补至 50 μL

PCR反应条件

98°C5 min

98°C30 s

55°C30 s35 cycles

72°C1 min

72°C10 min

上述体系分别扩增两个目的片段后，进行琼脂糖凝胶电泳，再进行PCR产物胶回收。

4. 重叠PCR

将上述得到的两个片段以重叠PCR连接起来，引入BsmBI酶切位点。反应体系如下：

5×PCR Buffer(Mg2+)10 μL

dNTPs(2.5 mMeach)4 μL

tRNAGlu基因1 μL

sgRNA下游表达单元1 μL

Prime STAR DNA Polymerase0.5 μL

ddH2O补至50 μL

PCR反应条件如下

98°C5 min

98°C30 s

55°C30 s35 cycles

72°C1 min

72°C10 min

按照上述反应程序进10个循环之后，分别加入Glu-F-PstI和cr-RNA-R各1 μL，按照上述程序继续运行30个循环。待反应结束之后，取PCR反应液5 μL，进行琼脂糖凝胶电泳，查看PCR反应结果。之后，纯化PCR产物，-20℃保存。

5. sgRNA表达质粒的构建：

(1) 提取质粒pCuARS-GAPZαAm，然后用限制性内切酶PstI和BamHI酶切pCuARS-GAPZαAm质粒和上一步骤中的重叠PCR产物,反应体系为50 μL：

pCuARS-GAPZαAm：5 μg

PstI:5 μL

BamHI:5 μL

10×Green Buffer：5 μL

ddH2O：补至50 μL

37℃水浴1 h后，琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果并保存，胶回收sgRNA表达盒片段和pCuARS-GAPZαAm骨架。

(2) sgRNA表达盒片段与质粒pCuARS-GAPZαAm骨架的连接

将回收到的sgRNA表达盒片段和pCuARS-GAPZαAm骨架按照摩尔比10：1的比例进行连接，连接体系为20 μL：

sgRNA表达盒片段 0.3 pmol

pCuARS-GAPZαAm骨架0.03 pmol

10×T4 DNA ligation buffer2 μL

T4 DNA ligase1 μL

ddH2O补至20 μL

22℃连接1 h后，连接产物转化大肠杆菌，涂布在含博来霉素的LB平板。

(3) 阳性转化子的鉴定

待平板上长出转化子后，用无菌的牙签挑取少量菌体混于预先配置好的20 μLPCR反应体系中，以重叠PCR的两条外引物鉴定阳性克隆。其中，阴性对照不含模板。反应体系为：

10×buffer（含有Mg2+）：15 μL

Glu-F-PstI（10 µM）：3 μL

cr-RNA-R（10 µM）：3 μL

dNTPs（10 mM）：3 μL

Taq酶（2 U/μL）：3 μL

ddH2O：补至150 μL

然后分装，每管20 μL。反应条件为：

94°C5 min

94°C30 s

55°C30 s35 cycles

72°C1 min 30 s

72°C10 min

鉴定结果如图7所示，其中M：DNA maker DL2000，1～7：挑取的单菌落，从图中可以看出，挑选的7个克隆中，1-7均为阳性克隆，保存阳性克隆，并挑选阳性克隆经测序验证序列正确性，载体命名为pGlu-sgRNA。

6. 产朊假丝酵母PDC1靶点识别序列的选择

根据PDC1基因编码区序列，通过程序筛选，选定了PDC1编码区与启动子交界处的20 bp（-3-+17 nt）作为靶点，序列为：ACCATGAGCGAAATCACATT。靶点序列及互补序列的5’端分别加上BsmBI酶切产生的粘性末端（小写字母），结果如下：

靶点序列：5’-ggaaACCATGAGCGAAATCACATT-3’

互补序列：5’-aaacAATGTGATTTCGCTCATGGT-3’

7. PDC1 sgRNA载体构建

以BsmBI酶切pGlu-sgRNA质粒，然后进行琼脂糖凝胶电泳以及胶回收，得到不含靶位点的pGlu-sgRNA骨架；将PDC1的靶点序列和互补序列通过退火形成带有5’突出粘性末端的双链片段，将其与骨架连接，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆，涂布在含有博来霉素的LB平板上；待培养12 h左右长出单菌落后，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定结果如图8所示，其中M：DNA maker DL2000，1～5：挑取的单菌落，0：阴性对照，挑选的5个单菌落均为阳性克隆，将其命名为pGlu-sgRNA-PDC1。

五、同源重组片段的构建

如图9所示，为了在敲除PDC1的同时引入LDHA基因，构建含LDHA编码区的同源重组片段。在LDHA编码区两端加上产朊假丝酵母PDC1启动子和终止子以及部分CDS区的序列，以PDC1的启动子和CDS区作为同源重组时的同源臂。PDC1的启动子和终止子作为LDHA基因表达的启动子和终止子，构建携带同源重组供体的具体流程如图10所示。

1. LDHA基因的获取

根据GenBank上已公布的米根霉LDHA基因序列（登录号为KR018745.1），从而获得LDHA基因编码的氨基酸序列；再根据产朊假丝酵母密码子的偏好性，采用最高频率的密码子对基因序列进行密码子优化。优化后的序列由通用生物系统（安徽）有限公司合成，获得带有LDHA基因的克隆载体pUC57-LDHA。

2. 产朊假丝酵母启动子PDC1pro、终止子PDCTT以及部分PDC1 CDS序列的获得

以产朊假丝酵母的基因组为模板，根据产朊假丝酵母PDC1的启动子、终止子以及CDS区序列，设计特异性引物并在上下游引物的5’端分别加上限制性酶切位点，引物序列如表5所示：

基因引物名称引物序列（5’-3’）

CuPDC1-ProCuPDC1-Pro-F2CACTGGTTTATGCCTGGTTAAG

CuPDC1-Pro-FGTCAGTTGGTACCGTTGTCGTCTTAC

CuPDC1-Pro-RTGCAAAACCATGGTATCGATTGTTTTAGTTTTGTTTG

CuPDC1-TTCuPDC1-TT-FTGTTAATCTAGAAGGAAACCGGAGCAGGACCG

CuPDC1-TT-RAGCACGTCGACTCGAGTAGACAACAAAACTACAGC

CuPDC1-CDSCuPDC1TT-CDS-FCCACTTTGATCTACGTTGAAGTGAGACTCAAACAAGTTGAG

CuPDC1TT-CDS-RCTCAACTTGTTTGAGTCTCTCACTTCAACGTAGATCAAAGTGG

CuPDC1-R5AAGCTTCTTAACTCTGGAGTAACCATC

CuPDC1-R6TTCAGAGGCAGCAGAGTTG

表5

同时在PDC1 CDS区序列上游引物的5’端加上PDC1TT末端的20个碱基，以作为重叠PCR的引物。以产朊假丝酵母的基因组为模板，利用特异性引物扩增得到启动子PDC1pro、终止子PDC1TT以及部分PDC1 CDS片段。

本实施例中以产朊假丝酵母的基因组为模板，通过特异性引物进行扩增得到产朊假丝酵母PDC1启动子片段PDC1pro，结果如图11所示，其中M：DNA maker DL2000，1：PDC-pro片段，片段长度与预期大小一致。

3. PDC1pro克隆进pUC57-LDHA

将产朊假丝酵母的PDC1pro和pUC57-LDHA用KpnI和NcoI分别双酶切后，将胶回收得到的PDCpro片段与pUC57-LDHA载体进行连接，转化大肠杆菌后利用Cu-PDC1-pro-F和LDHA-R作为特异性引物筛选阳性克隆， LDHA引物如表6所示。以M13F引物测序验证，测序正确的克隆命名为pUC57-PDC1p-LDHA。

基因引物名称引物序列（5’-3’）

LDHALDHA-FCACGCCTTTGTTTTGGGTGAG

LDHA-RATGGTTGACCACCGATAGAAGC

表6

本实施例中，用KpnI和NcoI对PDC1-pro片段与质粒pUC57-LDHA进行双酶切后连接转化大肠杆菌，将其涂布在含氨苄霉素的LB平板上；待平板上长出单菌落后进行菌落PCR鉴定，鉴定结果如图12所示，其中M：DNA maker DL2000，1～6：挑取的单菌落，0：阴性对照。从图中可以看出，挑选的6个单菌落中均是阳性克隆。阳性克隆经测序验证序列正确，所得质粒命名为pUC57-PDC1p-LDHA。

4. 重叠PCR连接好终止子PDC1-TT和部分PDC1 CDS片段

利用特异性引物将终止子PDC1TT和部分PDC1 CDS片段的PCR产物通过重叠PCR连接到一起，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，然后回收纯化PCR产物，将其命名为PDC1TT-CDS。

本实施例中，以产朊假丝酵母的基因组为模板，通过特异性引物进行扩增得到产朊假丝酵母PDC1终止子片段PDC1TT，以及PDC1部分编码区片段PDC1 CDS。再利用特异性引物将终止子PDC1TT和部分编码区片段的PCR产物通过重叠PCR连接到一起，并将其命名为PDC1-TT-CDS，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图13所示，其中M：DNA makerDL2000，1：重叠后PDC1-TT-CDS片段，2：PDC1部分CDS片段，3：PDC1TT片段，片段长度与预期大小一致。

5. PDC1TT-CDS克隆进pUC57-PDC1p-LDHA

将上一步骤中连接好的产朊假丝酵母PDC1TT-CDS片段和pUC57-PDC1p-LDHA分别用XbaI和SalI进行双酶切后，再将PDC1TT-CDS片段与pUC57-PDC1p-LDHA载体进行连接，转化大肠杆菌后利用特异性引物LDHA-F和Cu-PDC1-TT-R筛选阳性克隆。以M13R引物测序验证，测序正确的克隆其命名为pUC57-PDC1p-LDHA-TT-CDS。

本实施例中，用XbaI和SalI对PDC1-TT-CDS片段与质粒pUC57-PDC1p-LDHA进行双酶切后连接转化大肠杆菌将其涂布在含氨苄霉素的LB平板上；待平板上长出单菌落后进行菌落PCR鉴定，鉴定结果如图14所示，其中M：DNA maker DL2000，1～5：挑取的单菌落，0：阴性对照，从图中可以看出，挑选的5个单菌落均为阳性克隆，经测序验证正确的克隆命名为pUC57-PDC1p-LDHA-TT-CDS。

6. 提取pUC57-PDC1p-LDHA-TT-CDS质粒，用KpnI和SalI对质粒进行双酶切，获得同源重组片段PDC1p-LDHA-TT-CDS，如图15所示，其中M：DNA maker DL8000，1：KpnⅠ和SalI双酶切结果，2：pUC57-PDC1p-LDHA-TT-CDS质粒，片段长度与预期大小一致

六、PDC1 sgRNA质粒转化产朊假丝酵母

将PDC1的sgRNA表达载体pGlu-sgRNA-PDC1质粒转化表达Cas9的产朊假丝酵母。转化后，以4500×g，离心5 min收集菌体涂布于含有博来霉素和G418的双抗生素的YPD平板上，30°C恒温培养箱倒置培养3-5天，挑选单菌落进行活化后提取基因组。以引物Cu-PDC1-Pro-F和Cu-PDC1-R5进行PCR鉴定阳性转化子。

本实施例中将PDC1的sgRNA表达载体pGlu-sgRNA-PDC1质粒转化表达Cas9的产朊假丝酵母（Cu-Cas9），挑选单菌落进行活化并提取基因组。以距离敲除位点5’端200bp的上游序列，和3’端200bp的下游序列设计引物对转化子进行PCR鉴定，结果如图16所示其中，M：DNA maker DL2000，1～4：挑取的单菌落。PCR产物经测序验证，与敲除前的序列进行比对，完全一致，所以单独转化pGlu-sgRNA-PDC1来敲除PDC1基因没有成功。

七、 PDC1 sgRNA质粒和LDHA同源重组片段转化产朊假丝酵母

将pGlu-sgRNA-PDC1质粒和供体片段PDC1p-LDHA-TT-CDS共转化表达了Cas9蛋白的产朊假丝酵母，涂布于含有博来霉素和G418的双抗生素平板上，30°C恒温培养箱倒置培养3-5天。挑选单菌落进行活化后提取基因组，以引物Cu-PDC1-pro-F2和Cu-PDC1-R5进行PCR鉴定阳性转化子。

本实施例中，单独转化pGlu-sgRNA-PDC1来敲除PDC1基因没有成功，这可能是因为酵母等真核微生物细胞中，更倾向于使用同源重组（Homologous recombination，HR）而不是非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）的DNA修复机制，单独的sgRNA可能无法形成有效的基因敲除。因此，采用以LDHA基因替代PDC1基因的方式敲除PDC1。将pGlu-sgRNA-PDC1质粒和重组同源片段PDC1p-LDHA-TT-CDS共转化表达Cas9的产朊假丝酵母，挑选单菌落进行活化并提取基因组。利用基因组整合位点5’同源臂上游的序列设计引物Cu-PDC1-Pro-F2，与3’同源臂上的引物Cu-PDC1-R5对转化子进行PCR鉴定，结果如图17所示，其中M：DNA maker DL2000，1～4：为挑取的单菌落。

从图17中可以看出，PCR扩增出了两种大小的条带：300 bp左右的扩增条带表示无外源片段插入的PDC1基因片段；而1600 bp左右的扩增条带表示外源同源重组片段PDC1-pro-LDHA-TT-CDS插入PDC1后的片段。图17表明，虽然外源片段成功插入了PDC1基因位点，但并非所有的PDC1等位基因均被插入而只是部分敲除。为了避免由于挑选的菌落不够造成的实验误差，重新挑选了100个单菌落的进行鉴定实验，得到的实验结果与图17一致，仍然是部分敲除。

八、重组菌株乳酸脱氢酶酶活的测定

1. 产朊假丝酵母胞内蛋白的提取

重组菌株胞内蛋白的提取参照生工生物工程有限公司一步法酵母活性蛋白提取试剂盒，具体步骤如下：

（1）随机挑选四株阳性重组菌株和Cu-cas9接种于不含抗生素的YPD液体培养基中，30℃，200 rpm培养过夜后，转接于50 mLYPD液体培养基中，培养36 h。

（2）取适量菌液4500 rpm室温离心5 min，收集酵母细胞，去上清称取湿酵母的重量。

（3）按照每50 mg湿重的菌体加入500 μL的提取试剂（每毫升提取试剂加入1 μL的蛋白酶抑制剂、20 μL DTT、10 μL PMSF），用枪头反复地吹打均匀。

（4）盖上离心管的盖子，将其放在脱色摇床上300 rpm室温震荡30 min左右。

（5）13,000 rpm离心20 min，将上清液转移到一个新的离心管中，即为粗酶提取液。

2. BCA法测定粗酶液蛋白含量

参考EasyII Protein Quantitave Kit（BCA）的步骤：

（1）使用1×PBS将BSA Standard Solution稀释为500 μg/mL；

（2）将BCA Solution A和BCA Solution B按50:1的比例稀释成工作液（BCA工作液），充分混匀后，24 h内使用；

（3）在96孔板的样品孔中依次加入0，1，2，4，8，12，16，20 μL稀释后的牛血清白蛋白（BSA）标准液，加1×PBS补足至20 μL；

（4）用1×PBS将待测样品按照一定比例稀释后，取20 μL加入96孔板的样品孔中；

（5）向样品孔中加入200 μL的BCA工作液，37℃放置40 min；

（6）将96孔板置于酶标仪570 nm波长下检测；

（7）以BSA浓度为横坐标，OD570为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测蛋白样品的浓度。如图18所示在蛋白含量0-500 μg的范围内，与吸光度的线性关系很好，可以用来计算待测蛋白样品的浓度。

3. 重组菌株乳酸脱氢酶酶活的测定：

乳酸脱氢酶酶活的测定原理为：pH7.5的条件下，乳酸脱氢酶在催化丙酮酸转化为乳酸的同时，将NADH氧化成NAD⁺。NADH在340 nm处有特定的吸收峰，而NAD⁺无此吸收峰，340nm波长吸光值减少的速度与乳酸脱氢酶的活力成正比，因此通过测定反应过程中340 nm处吸光度的变化值可以计算出酶活。以25℃（室温），pH7.5条件下每分钟减少1 μmol的NADH所需的酶量定义为一个酶活力单位。

重组菌株乳酸脱氢酶酶活的测定方法：在测定酶活之前先将丙酮酸钠溶液及NADH溶液预热至室温，以0.1 mol/L pH7.5的磷酸盐缓冲液将紫外分光光度计A340 nm吸光值调为零，然后比色皿中依次加入2.9 mL丙酮酸钠溶液，0.1 mL NADH溶液，用移液枪混匀后立即测定其340 nm光吸收值（A340）。往比色皿加入10 μL酶液并迅速混匀，每隔30 s测一次A340 nm的光吸收值并记录数值，连续测定3 min。每组做两个平行，酶活力的计算公式如下：

（1）LDHA的酶活力(U/mL)：

C =

C：LDHA的酶活力(U/mL)；A₃₄₀：吸光值的降低值；

V₁：反应液总体积（mL）；V₂：加入粗酶液的体积(mL)；

N：粗酶液稀释倍数；T:A₃₄₀的变化时间（min）；

L：比色皿光程（cm）；

：NADH在340 nm的摩尔消光系数（其值为6.22mL·μmol^-1·cm^-1）

（2）LDHA比活力：

比活力（U/mg）=

其中，提取液中LDHA总活力=LDH活力（U/mL）总体积（mL）

本实施例中将上述四株重组菌以及出发菌株Cu-Cas9在YPD培养基中培养36 h后，提取细胞内粗酶液，并分别测定它们乳酸脱氢酶的酶活力，结果如图19所示，其中LDHA-0：出发菌株，LDHA1-4：重组菌株。

在出发菌株（Cu-Cas9）中并未检测到乳酸脱氢酶的酶活，而阳性重组菌株中检测到了乳酸脱氢酶的酶活，乳酸脱氢酶基因在产朊假丝酵母中成功表达，其中LDHA-3重组菌株酶活性最高为0.041（U/mg）。

上述结果初步验证了CRISPR-Cas9系统应用于产朊假丝酵母基因敲除的可行性，在上述结果中只能实现部分敲除，表明通过CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因是可行的，但仍有其他因素影响敲除的结果，无论是预敲除基因还是sgRNA载体都有可能影响敲除结果。但本实施例利用上述提供的方法实现了初步验证，为后续的验证CRISPR-Cas9系统介导产朊假丝酵母、产朊假丝酵母的基因敲除提供基础。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 广东利世康低碳科技有限公司

广州利世康工业科技有限公司

暨南大学

<120> 一种验证CRISPR/Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

accatgagcg aaatcacatt 20

Claims

1.一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、测定产朊假丝酵母染色体的倍数；

S2、使用限制性核酸内切酶对酵母Cas9表达载体和第一产朊假丝酵母游离型表达载体进行双酶切，并连接产生的Cas9片段和游离型表达载体骨架片段，获得重组质粒pCGGαAL-Cas9；

S3、扩增产朊假丝酵母编码谷氨酸的转运RNA（tRNA_Glu）基因、sgRNA下游表达单元，并分别引入ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点，tRNA_Glu基因与sgRNA扩增产物通过酶切位点进行重叠PCR连接；重叠后的片段以及第二产朊假丝酵母游离型表达载体经双酶切后连接在一起，获得载体pGlu-sgRNA；

S4、根据预敲除序列选择靶点识别序列，分别在靶点序列及互补序列的5’端加上ⅡS类限制性核酸内切酶产生的粘性末端，经退火形成带有5’突出粘性末端的双链片段，将双链片段与ⅡS类限制性核酸内切酶酶切载体pGlu-sgRNA后获得的骨架连接，获得重组质粒pGlu-sgRNA-预敲除序列；

S5、构建含有敲除序列的同源重组供体基因片段；

S6、重组质粒pGlu-sgRNA-预敲除序列转化携带重组质粒pCGGαAL-Cas9的产朊假丝酵母，经过测序验证或PCR鉴定或预敲除序列的基因表达水平测定，验证是否敲除成功，初步验证Cas9介导敲除产朊假丝酵母的目标基因是否可行；

S7、重组质粒pGlu-sgRNA-预敲除序列和重组供体片段转化携带重组质粒pCGGαAL-Cas9的产朊假丝酵母，经过测序验证或PCR鉴定或供体的基因表达水平测定进一步验证Cas9介导的产朊假丝酵母基因敲除是否可行；

所述步骤S3包括以下步骤：

（1）扩增产朊假丝酵母编码谷氨酸的转运RNA（tRNA_Glu）基因，扩增过程中的下游引物5’端引入ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点；扩增sgRNA下游表达单元，扩增过程中的上游引物5’端引入方向相反的两个ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点；

（2）将扩增的tRNA_Glu基因与sgRNA扩增产物进行重叠PCR连接获得连接产物，分别对连接产物和第二产朊假丝酵母游离型表达载体进行双酶切，并连接酶切后的连接产物、游离型表达载体骨架片段，获得载体pGlu-sgRNA；

步骤S4中的预敲除序列为PDC1基因编码区序列，所选的靶点序列为：

ACCATGAGCGAAATCACATT。

2.根据权利要求1所述的一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法，其特征在于，所述步骤S5中的同源重组供体片段构建的步骤具体包括：

（1）设计上下游引物扩增供体片段；

（2）设计特异性引物分别扩增预敲除序列的启动子、终止子、CDS片段，引入重叠PCR片段序列，将所述终止子、CDS片段通过重叠PCR连接；

依次将所述启动子、终止子-CDS片段克隆进携带供体片段的表达载体中，经筛选、测序验证、酶切后获得同源重组片段预敲除序列-供体-TT-CDS。

3.根据权利要求1所述的一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法，其特征在于，步骤S3、S4中的ⅡS类限制性核酸内切酶为BsmBI酶。

4.根据权利要求1所述的一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法，其特征在于，步骤S5中的供体片段为LDHA基因。

5.根据权利要求1所述的一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法，其特征在于，步骤S2中双酶切采用的酶为限制性内切酶SpeI和KpnI；步骤S3双酶切采用的酶为限制性内切酶PstI和BamHI。

6.根据权利要求1至5任一项所述的一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法，其特征在于，所述sgRNA下游表达单元包括sgRNA的结构区和转录终止子区。

7.根据权利要求1至5任一项所述的一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法，其特征在于，所述供体片段为未修改编码序列的外源基因或根据产朊假丝酵母密码子偏好性进行密码子优化后的外源基因序列。

8.根据权利要求1至5任一项所述的一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法，其特征在于，步骤S1中通过碘化丙啶测定细胞DNA含量，并以酿酒酵母的单倍体和二倍体细胞作为参照以确定产朊假丝酵母的染色体倍数。

9.一种敲除产朊假丝酵母目标基因的方法，其特征在于，包括步骤：

A1、测定产朊假丝酵母染色体的倍数；

A2、使用限制性核酸内切酶对酵母Cas9表达载体和第一产朊假丝酵母游离型表达载体进行双酶切，并连接产生的Cas9片段和游离型表达载体骨架片段，获得重组质粒pCGGαAL-Cas9；

A3、扩增产朊假丝酵母编码谷氨酸的转运RNA（tRNA_Glu）基因、sgRNA下游表达单元，并分别引入ⅡS类限制性核酸内切酶酶切位点，tRNA_Glu基因与sgRNA扩增产物通过酶切位点进行重叠PCR连接；重叠后的片段以及第二产朊假丝酵母游离型表达载体经双酶切后连接在一起，获得载体pGlu-sgRNA；A4、根据预敲除序列选择靶点识别序列，分别在靶点序列及互补序列的5’端加上ⅡS类限制性核酸内切酶产生的粘性末端，经退火形成带有5’突出粘性末端的双链片段，将双链片段与ⅡS类限制性核酸内切酶酶切载体pGlu-sgRNA后获得的骨架连接，获得重组质粒pGlu-sgRNA-预敲除序列；

A5、构建含有敲除序列的同源重组供体基因片段；

A6、重组质粒pGlu-sgRNA-预敲除序列和重组供体片段转化携带重组质粒pCGGαAL-Cas9的产朊假丝酵母。

10.根据权利要求9所述的一种敲除产朊假丝酵母目标基因的方法，其特征在于，预敲除序列为PDC1基因编码区序列，所选的靶点序列为：ACCATGAGCGAAATCACATT；供体片段为LDHA基因。