BG62068B2 - Хирудинмутеини и техни полиалкиленгликолови конюгати - Google Patents

Хирудинмутеини и техни полиалкиленгликолови конюгати Download PDF

Info

Publication number
BG62068B2
BG62068B2 BG98604A BG9860494A BG62068B2 BG 62068 B2 BG62068 B2 BG 62068B2 BG 98604 A BG98604 A BG 98604A BG 9860494 A BG9860494 A BG 9860494A BG 62068 B2 BG62068 B2 BG 62068B2
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
glu
gly
gin
asn
thr
Prior art date
Application number
BG98604A
Other languages
English (en)
Inventor
Manfred Kurfuerst
Klaus Ruebsamen
Bernhard Schmied
Wolfgang Koerwer
Juergen Schweden
Hans HOEFFKEN
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6394620&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG62068(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Publication of BG62068B2 publication Critical patent/BG62068B2/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
    • Y10S530/858—Proteins from animals other than mammals or birds insects; venom

Abstract

Изобретението се отнася до нови хирудинмутеини и техни полиалкиленгликолови конюгати с формула [Z-(CH2)n-[O-(CH2)n]m-W-]pHir и до метод за получаването им. Съединенията са подходящи за профилактика илечение на сърдечносъдови заболявания.

Description

(54) ХИРУДИНМУТЕИНИ И ТЕХНИ ПОЛИАЛКИЛЕНГЛИКОЛОВИ КОНЮГАТИ (57) Изобретението се отнася до нови хирудинмутеини и техни полиалкиленгликолови конюгати с формула и до метод за получаването им. Съединенията са подходящи за профилактика и лечение на сърдечносъдови заболявания.
претенции , 2 фигури (54) ХИРУДИНМУТЕИНИ И ТЕХНИ ПОЛИАЛКИЛЕНГЛИКОЛОВИ КОНЮГАТИ
Област на техниката
Изобретението се отнася за нови хирудинмутеини и техните полиалкиленгликолови конюгати, тяхното получаване и използването им както за профилактика и лечение на сърдечносъдови заболявания, така също и за модифициране на макромолекулни носители.
Предшестващо състояние на техниката
Хирудинът е отдавна известен, природно разпространен протеин със свойството да препятства съсирването на кръвта. Той е найсилният и най-селективен от досега известните инхибитори на тромбина (Naturwissenschaften (1955) 42, 537; Hoppe-Seylers Z. fur Biol. Chemie (1985) 366, 379). Този полипептид, който се изолира от кръвен гел от Hirudo medicinalis, се състои от 65 аминокиселини, съдържа три дисулфидни моста и е сулфатиран в положение тирозин 63. Освен това, съществуват още няколко природноразпространени изоформи, които се различават от първоначалния хирудин по размяната на аминокиселини в различни положения. (Folia Haematol. (1988), 115, 30). Също така, познати са гентехнологично получени варианти (Biochemistry (1988), 27, 6517; FEBS-Lett. (1988), 229, 87). Хирудинът и различните варианти са достъпни днес по гентехнологичен път, при което у получените чрез гентехнологични методи хирудини липсва сулфатния остатък при аминокиселината Туг 63 (Biochemistry (1989), 28, 2941; DNA (1986), 5, 511). Добрата физиологична поносимост на тези инхибитори на кръвосъсирването също е известна от дълго време (Pharmazie (1981), 10, 653).
Въпреки достатъчните си фармакодинамични свойства, хирудинът, поради минималната стойност на полуживот в кръвта от около 50 min, е по-малко подходящ за продължително терапевтично приложение. Известно е, че времето на полуживот на протеините може да се удължи чрез конюгиране с макромолекули /J. Biol. Chem. (1977), 252, 3582; Biochim. Biophys. Acta (1981), 660, 293/. Често след такова получаване на производни, например с полиетиленгликол, се наблюдава значително влошаване на ензимната активност, което силно ограничава приложимостта на такива модифицирани протеини /Cancer Treat. Rep. (1979), 63, 1127; Chemistry Lett. (1980), 773/ . В случая c хирудина напоследък е показано от Walsmann, че чрез свързване с декстран може да се постигне ясно удължаване на времето на полуживот от около 50 min на повече от 7 h, обаче с драстична загуба на активност (Pharmazie (1989), 44, 72). Терапевтичното приложение на такива декстрин-хирудини е в противоречие, въпреки достатъчно удълженото време на полуживот, с твърде ниския добив на продукта, драстично намалената специфична активност, както и с възможно свързаните с това промени на фармакодинамичните свойства.
Конюгиране на протеини с макромолекули се постига често чрез реакция на карбоксилните групи на аспарагинова или глутаминова киселина чрез реакция на сулфхидрилната група на аминокиселината цистеин или чрез взаимодействие на аминогрупите от страничните вериги на аминокиселината лизин от съответния протеин. Често обаче точно споменатите аминокиселини са от съществено значение за функцията на съответните протеини. Получаването на производни от един протеин може да бъде свързано с промяна на физикохимичните или ензимните свойства дори до инактивиране. Хирудинът съдържа няколко остатъка от аспарагинова киселина и глутаминова киселина, главно в С-крайната област на молекулата. Лизиновите остатъци се намират в положения 27, 36 и 47 в хирудиновата молекула. Въз основа на това може да се мисли за свързване през С-края или N-края на молекулата. Известно е обаче, че както киселите аминокиселини от С-крайна област (FEBS Lett. (1983), 164, 307-313), така и основните лизинови остатъци, по-специално силно експонирания в молекулата лизинов остатък № 47, участват решаващо във взаимодействието на хирудина с протеазата тромбин (Biol. Chem. Hoppe-Seyler(1985), 366,379-385). Реакциите в N-края, като например удължаване (Biochemistry (1989), 28, 10079), водят до драстично намаление на инхибиращата активност на хирудина. Въз основа на това не може да се очаква, че получаването на производни на хирудин може да се постигне без значителна загуба на активност. Това очакване е ясно потвърдено от проведените от Walsmann (Pharmazie (1989), 44, 72) опити за получаване на производни на лизиновия остатък на хирудина с декстран.
Поради големия брой кисели аминокиселини при конюгиране на макромолекули с карбоксилните странични вериги на хирудина не може да се очаква хомогенен продукт. Дори при получаване на производно само на основните функции на полипептида, се очаква смес до около 32 различни съединения. При моно-, ди- и тризаместените производни е допустимо голямо число позиционни изомери, които се приличат по физични и химични свойства, но се различават по биологичната си активност. Дори ако по-големият брой теоретично допустими конюгати допринасят само в следи за общата смес, трябва да се очакват значителни проблеми при разделянето на един нехомогенен продукт.
Техническа същност на изобретението
Намерено е, че конюгирането на полиалкиленгликолови производни чрез вмъкване на подходящи хирудинмутеини може да се управлява толкова добре, че да може да се получи с приемливи разходи за пречистване химически еднородно хирудин-полимерно производно. Изненадваща е констатацията, че конюгати с формула I от полиалкиленгликол или полиалкиленгликолови производни с инхибиращи кръвосъсирването хирудинмутеини [Z-(CHJ)4-[0-(CH!>J.-W-]pHir където Z означава един от остатъците OH, -NH2, -NH-CO-R, -О-R или -O-CO-R (R означава С^-С^-алкилова група), η има стойност 2. 3 или 4, m има стойност от 50 до 500, W е директна ковалентна връзка или свързваща група, р има стойност 1, 2 или 3 и Hir означава свързан чрез аминогрупата(ите) на лизиновата странична (и) верига (и) cZ-(CH2)n[0-(СН,) ] -)У-остатъка(ците) полипептид с 4 Z η m формула II
A-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly10 Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn20 Val-Cys-Gly-B-Gly-Asn-C-Cys-lle-Leu30 (II)
Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-GIn-Val40 Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-D-Pro-GIn-Ser50
His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-E-lie-Pro60
Glu-Glu-Tyr-Leu-F
65, в която
A = Val-Val, = lle-Thr, = Leu-Thr или = Pro-Val,
B = Gin или Glu,
C = Lys, Arg или Asn,
D = Lys, Arg, Asn или Gin,
E = Glu или Pro,
F = Asp или Gin, при което в полипептида с формула II една или повече аминокиселини в положения 30-38 са заменени или делетирани и се съдържат два допълнителни лизинови остатъка чрез заместване на една от наличните аминокиселини в положения 30-38, притежават ясно удължена бионаличност, при което биологичната активност остава напълно или в много голяма степен запазена.
Изобретението се отнася още до полипептидите с формула II.
С оглед на по-просто провеждане на реакцията и химически еднороден продукт, изгодно е лизиновите остатъци, при които взаимодействието е PEG не е желано, да се заменят с други, по-слаби нуклеофилни аминокиселини. Като особено подходящо се оказва при посочените мутеини замяната на Lys 47 с
Arg 47 или също Gin 47. Съответните продукти на свързване PEG-мутеин имат подобни високо специфични активности както мутеин, от който не са получавани производни. Чрез броя на наличните, съответно нововъведените лизинови остатъци, може да се влияе на частта на свързаните полимери и с това на молекулното тегло на конюгата.
Такива хирудинмутеини могат да се получат много добре по гентехнологичен път. Най-напред се получават синтетично кодиращите за съответния мутеин нуклеинови киселини. Тези синтетични гени след това могат да бъдат снабдени с подходящи регулира- 15 щи последователности (промотор, терминатор и пр.) и да се приведат към експресия в хетерологови системи (FEBS-Lett. (1986), 202, 373; Biol. Chem. Hoppe-Seyler (1986), 367, 731). Експресията може да се осъществи в еукариотни системи (клетки на бозайници, дрожди или нишковидни гъби) или в прокариотни системи (Е. coli, Bacilli и т.н.). Експресията в Е. coli се извършва за предпочитане чрез слят протеин, от който хирудинът може да се освободи и след това да се активира (DNA (1986), 5, 511). В следващите примери е описано получаването само на един от претендираните съгласно изобретението мутеини, като останалите се получават аналогично.
Като свързващи групи W се имат пред20 вид следните групи:
-Х-СО-; -X-CO-NH-U-NH-CO-; -Х-СОСН,-СН2-СО-; -Х-СН2-СО- или
Y в които X означава -S-, -Ο-, -NH-, U С,-С6-алкиленова група или р-фениленова група и Y - -С1-, -ОН, или Н.
Новите хирудинполиалкиленгликолови производни могат да се получат при взаимодействие на хирудинмутеини с формула II с полиалкиленгликолови производни с формула III г-<снг),-[о-<сн2)п]т-Е (III) в която Z, m и η имат посочените значения, и Е е един от остатъците -X-CO-V, -X-C0-NH-U-N=C=O, -X-CO-CH2-CH2-CO-V, -X-CH2-CO-V,
или -0-SO2-R, като X, U и Y имат посочените значения, a V означава
като Q означава 1-3 халогенни атоми или 1-2 нитрогрупи или ацетилна група и R има значение на метил, етил, норм-пропил, изопропил, фенил, толил или тресил.
Взаимодействието на съединение с формула III с хирудинмутеини се осъществява как4 то следва.
Активираният полиалкиленгликол с формула III взаимодейства с хирудинмутеин в стехиометрични количества или в излишък в подходящ буфер (pH 6-10), във вода, в даден случай при прибавка на помощна основа, като натриев или калиев карбонат или хидрогенкарбонат, алкален хидроксид, триетиламин, Νметилморфолин, диизопропиламин или пиридин в органичен разтворител (метанол, етанол, изопропанол, ацетонитрил, диметилформамид, N-метилпиролидон, дихлорометан, диметилсулфоксид, тетрахидрофуран, 1,4-диоксан, толуен) или в смес от споменатите разтворители, при температури от -20 до 100°С, за предпочитане при температури от 0 до 60°С. Получените конюгати се изолират и се пречистват и характеризират с обичайните за химията на протеините методи.
Описаните съгласно изобретението конюгати на полиалкиленхирудинмутеин показват в сравнение с хирудина задоволителен фармакологичен профил на действие. Те имат не само благоприятните фармакодинамични свойства на хирудините, но показват освен това и значително удължено биологично действие и по-добра бионаличност. Освен това, полиалкилгликолхирудинмутеиновите конюгати показват отчетливо минимална антигенност в сравнение с хирудина. Въз основа на тези си свойства описаните полиалкиленови конюгати превъзхождат хирудина, хепарина и нискомолекулния хепарин при терапията и профилактиката на тромбоемболични заболявания. Те могат да се прилагат много успешно например при инфаркт на миокарда, при дълбоки тромбози на вените, заболявания с периферни артериални запушвания, белодробна емболия, както и при екстракорпорално кръвообращение например хемодиализа или кардиопулмонарен байпас. Освен това полиалкиленгликолхирудинмутеиновите конюгати могат да се прилагат за препятстване на реоклузия след повторно отваряне на артериални съдове чрез механични методи или лиза. Новите хирудинмутеин-полиалкиленгликолови производни могат да бъдат успешно въведени за наслояване на изкуствени повърхности, както например мем брани за хемодиализа и изискващите се за това системи от маркучи, при заместване на съдове или при апарати сърце-бял дроб.
Съединенията съгласно изобретението могат да се дават по обичайния начин орално или парентерално (подкожно, венозно, мускулно, интраперитонеално).
Дозирането зависи от възрастта, състоянието и теглото на пациента, както и от начина на приложение. Според формата на приложение и индикациите обикновената доза на действащото вещество възлиза по правило на от 20 до 40 000 ATU/kg телесно тегло.
Новите съединения могат да се прилагат в употребяваните галенични форми на приложение в твърдо или течно състояние, например като разтвори, мази, кремове или спрейове. Те се получават по обичайния начин. При това действащите вещества могат да се преработват с обичайните помощни вещества като пълнители, консерванти, регулиращи течливостта средства, омокрящи, диспергиращи, емулгиращи средства, разтворители и изтласкващи газове (виж Н. Sucker et al., Pharmazeurische Technologie, Thieme Verlag, Stuttgart, 1978).
Примери за изпълнение на изобретението
Пример 1. Получаване на хирудинмутеини.
а) Конструиране на векторите
Протеин А-векторът pRIT 2Т (фиг.1) е търговско достъпен и подробно описан (Pharmacia, номер за поръчване № 27-4808-01). С негова помощ могат да се получат пептиди и протеини, като слят протеин с протеин А, от Staphylococcus aureus в Е. coli. За целта е необходимо нуклеиновите киселини, които трябва да се експресират, да се вмъкнат в полилинкера на вектора pRIT 2Т при запазване на четящата система на протеин A. pRIT 2Т ДНК се отрязва с рестрикционни ендонуклеази EcoRI и Sal II съгласно указанията на производителя, отрязъкът се разделя на нискотопящ се агарозен гел и по-големият фрагмент от вектора се изолира от гела в чиста форма. Основната техника на генната технология, както и подробни указания за работа, се намират в Sambrook et al., (1989) “Molecular cloning” 2nd edition, CSH-Press.
b) Кодиращите последователности за претендираните съгласно изобретението хирудинмутеини се синтезират с помощта на апарат за ДНК-синтеза от фирма Applied Biosystems, модел 380А съгласно предписание и с химикали от производителя. Пълната кодираща област се съставя от 3 частични последователности до по две комплементарни олигонуклеотиди. Комплементарните един на друг олигонуклеотиди се подават заедно, нагряват се 5 min при 90°С и се охлаждат в интервал от 30 min до стайна температура. Получените при това фрагменти с две разклонения се киназират в техните 5'-краища и се лигират заедно. Така образуваният хирудинов ген може да се вмъкне в EcoRI и Sal I положенията на линеаризирания експресиращ вектор pRIT 2Т в правилно ориентиране и при запазване на четящата система на протеина А.
За получаване на различни мутеини се комбинират едни с други следните последователности (фиг.2):
HL 1 1А 1А+2А+ЗА Ser32-*Lys32 Asp33-»Asn33 Glu35->Gln35
HL 11В 1А+2А+ЗВ Ser32->Lys32 Asp33-»Asn33 Glu35-> Gln35 Lys47-»Arg47
HL 12А 1А+2В+ЗА Asp33->Lys33 Glu35-»Gln35
HL 12В 1А+2В+ЗВ Asp33->Lys33 Glu35-»Gln35 Lys47-»Arg47
HL 14А 1А+2С+ЗА Asp33-»Lys33 Lys36-»Arg36
HL 14В 1А+2С+ЗВ Asp33-»Lys33 Lys36-»Arg36 Lys47->Arg47
HL 14С 1А+2С+ЗС Asp33-> Lys33 Lys36-> Arg36 Lys47-»Gln47
Получените след лигирането химерни плазмиди (pRIT 2T-Hir) се трансформират за ДНК-амплификация в ламдализогенен Е. coli щам № 4830-1 (Pharmacia, № за поръчка 274808-01), ДНК се изолира от отделните клонове и се анализира чрез ДНК-секвенционен анализ за наличие на правилната последователност.
Пример 2. Експресия на слетия протеин.
Съответният експресионен плазмид pRIT 2T-Hir се трансформира в щам Е. coli № 4830. Този щам съдържа хромозом на термочувствителния ламбда-репресор С1 857.
В ерленмаерова колба с дефлектор се стерилизират 100 ml MIM-среда (MIM = 32 g триптон, 20 g екстракт от дрожди, 6 g Na2HPO4, 3 g К2НРО4, 0,5 g NaCl, 1 g NH4C1 на литър и 0,1 mM MgSO4, както и 0,001 mM FeCl3) и се прибавя ампицилин (до 100 pg/ml). Средата се инокулира с 1 ml прясна култура на една нощ от щам pRIT 2TA-Hir/№ 4830-1 и при разклащане се инкубира при 28°С, докато абсорбцията при 550 nm стане 0,6. Тогава се прибавят 100 ml затоплена до 65°С прясна MIMсреда и още 4 h се инкубира при 42°С. През това време се синтезира желаният слят протеин. Чрез прибавяне на лизозим до 75 mg/ml и инкубация (3 h, 37°С) се отстраняват по ензимен път клетъчните стени. След това клетките се изключват механично (преса на Мапton-Gaulin, цикъл на замразяване, силно разбъркване) чрез топлинен шок при 80°С или хипотонно лизиране и разтворимият слят протеин се освобождава в средата.
Пример 3. Пречистване на слетия протеин.
Клетъчните отломки се отстраняват чрез центрофугиране и бистрата надутаечна течност се изпомпва в lgG-сефарозна колона (lgGSepharose®6 “Fast Flow”, Pharmacia, № за поръчка 17-0969-01). Съхранението на материалите за колоната, подготовката и поставянето на колоната, условията на нанасяне и елуиране се изпълняват по данни на производителя. Така за 6 1 Uberstand се прилага слой от гел 200 ml и скорост на елуиране от около 3 1/ h. При този етап слетият протеин се свързва обратимо с гелната матрица посредством не говата lgG-свързваща протеин А част (добив около 95%). След нанасянето колоната се промива с 10 об. спрямо слоя TST (50 mM TrisНС1 pH 7,6; 150 mM NaCl и 0,05% Tween®20). Елуирането се извършва с 0,5 М ацетатен буфер pH 2,8.
Пример 4. Отцепване на слетия протеин.
Елуатьт от колоната от пример 3 се лиофилизира и се съхранява при -20°С. За отцепването елуатьт се разбърква със 70%-на мравчена киселина до концентрация на протеин от около 25 g/Ι. След промиване с аргон за отцепването на хирудинмутеина се прибавя 1 g BrCN във вид на твърдо вещество за g слят протеин. Отцепването се осъществява под аргон при 37°С за около 4 h. Излишъкът от бромоциан, разтворителят и други летливи съставки се отстраняват чрез лиофилизация. Накрая се промива три пъти с вода.
Пример 5. Ренатуриране и пречистване на хирудинмутеините.
Лиофилизатът се смесва до 1-100 mg/ml протеин с 6М гуанидин-солна киселина, 0,1 М Tris-HCl pH 5, 02 MDTT. След инкубиране в продължение на 2 h пробата се обезсолява чрез G-10-изключваща хроматография (еквилибриране с 10 mM НС1). Обезсолената проба се разрежда 1:20 в 0,1 М Tris/HCl, 5 mM GSH/ 0,5 mM GSSG, 1 mM EDTA, pH 8,7 и се инкубира 1 h (GSH е редуциран и GSSH оксидиран глутатион). Чрез тази обработка нараства специфичната активност на хирудинмутеините с фактор около 3-5. След коригиране на pH стойността на 7,6 с НС1, прибавяне на NaCl до 150 mM и Tween®20 до 0,05%, се повтаря хроматографията на lgG-сефароза (пример 3). Докато слетият партньор на протеин А и неразпаднатият слят протеин се свързват с колоната, активните хирудинмутеини минават в елуата с чистота, по-голяма от 90%. Чрез класическите методи на протеиновата химия се пречистват по-нататък до клинична чистота.
Пример 6. Получаване на метокси-полиетиленгликол(8000)-^сукцинимидокарбонати.
а) N-сукцинимидо-хлороформиат
В разтвор на около 30 g фосген в 200 ml дихлорметан при 0°С в течение на 30 min се внасят 21,0 g калиева сол на N-хидроксисукцинимид и сместа се разбърква 2 h при 0°С. След това, през суспензията се прокарва в продължение на 1 h азот, за да се продуха излишният фосген (промивна кула). Суспензията се филтрира и филтратът се концентрира под вакуум до сухо. N-сукцинимидо-хлороформиатът, 10,6 g, представлява жълтеникаво масло и е онечистен с неорганични соли и дисукцинимидокарбонат. Суровият продукт може да взаимодейства с полиалкиленгликол без допълнително пречиствани или може да се освободи от неорганичните соли чрез разтваряне в 150 ml диетилов етер, филтриране и отново концентриране.
Ь) метокси-полиетиленгликол (8000) -Nсукцинимидокарбонат
10,0 g метокси-РЕС(8000)-ОН се разтварят в 20 ml сух пиридин чрез леко затопляне. След охлаждане до стайна температура разтворът взаимодейства при стайна температура с 890 mg N-сукцинимидо-хлороформиат и се разбърква в продължение на една нощ. След прибавяне на излишък от диетилов етер сместа се разбърква 30 min на ледена баня, изпадналото твърдо вещество се филтрира, прекристализира се два пъти из изопропанол, утаява се из диетилов етер, филтрира се и се суши. Получават се 10 g метокси-полиетиленгликол (8000)-М-сукцинимидокарбонат под формата на безцветно твърдо вещество.
Пример 7. Получаване на метокси-полиетиленгликол (8000)-4-нитрофенил карбонат.
а) 4-нитрофенилформиат
В суспензия от 20,0 g нитрофенол в 60 ml толуен се вкарват при 0°С около 43 g фосген-газ. Сместа се разбърква 4-5 h при 0°С. След това при -15°С бавно се прибавя на капки разтвор на 20 ml триетиламин в 20 ml толуен и се разбърква една нощ на размразяваща се ледена баня. Излишният фосген се продухва с азот и след това реакционната смес се филтрира. Филтратът се концентрира под вакуум до сухо. Остатъкът, 33,7 g кафеникаво маслообразно вещество съдържа освен 4-нитрофенол-хлороформиат, още и разтворител и сол. Сместа кристализира в хладилник и може да се използва без по-нататъшно пречистване.
Ь) метокси-полиетиленгликол (8000) -4нитрофенилкарбонат.
Получаването и пречистването се осъществяват аналогично на пример 6.
Пример 8. Получаване на метокси-полиетиленгликол (8000) -2,4,5-трихлорофенилкарбонат.
a) 2,4,5-трихлорофенилхлороформиат
В разтвор от 10,0 g 2,4,5-трихлорофенол в 50 ml дихлорметан се вкарват при 0°С около 7 g фосген-газ и сместа се разбърква при 0°С 15 min, в продължение на 30 min се прибавят на капки 7,2 ml хинолин в 20 ml дихлорметан и оранжево оцветената суспензия се разбърква още 1 h на ледена баня. След това през суспензията се пропуска азот в продължение на 1 h, за да се продуха излишният фосген (промивна кула). След това сместа се филтрира, филтратът се промива два пъти с вода, суши се, отново се филтрира и се концентрира под вакуум до сухо. Получават се 4,45 g масловиден кафеникав, относително чист 2,4,5-трихлорофенилхлороформиат, който кристализира в хладилник и може да се използва без по-нататъшно пречистване.
b) Метокси-полиетиленгликол(8000)-
2,4,5 -трихл орофенилкарбонат.
Получаването и пречистването се осъществяват аналогично на пример 6.
Пример 9. Взаимодействие на хирудинмутеин HL 14В с метокси-полиетиленгликол (8000) -4-нитрофенилкарбонат mg хирудинмутеин HL 14В (специфична активност 8900 ATU /mg) се разтварят до концентрация 20 mg/ml в 0,1 М натриев хидрогенкарбонатен буфер с pH 8,0, взаимодейства с 80 mg 4-нитрофенил-активиран метоксиполиетиленгликол (8000 Da), разтворен в 0,5 ml 1,4-диоксан, и се инкубира 3 h при 25°С. След това реакцията се спира чрез прибавяне на 100-кратен излишък от Tris-база, освободеният 4-нитрофенол се отстранява чрез екстракция и хирудин-PEG конюгатьт се нанася на колона с HP-Q-Sepharose® (Pharmacia). Колоната се елуира с линеен градиент от NaCl от 0 до 400 mM NaCl в 20 тМ Tris/HCl, pH 8,0.
Частта от желаното PEG2-npon3B°flHo е в свързано състояние около 80-85%; частта на нежеланите PEG( и PEGj-производни е максимум на 5-10%. Специфичната активност на пречистения PEG2-HL 14В конюгат е 8300 U/ mg протеин. Молекулното тегло се определя чрез гелфилтрация на Superose® на 2200023000 Da.

Claims (6)

  1. Патентни претенции
    1. Конюгати с формула I от полиалкиленгликол или полиалкиленгликолови производни с инхибиращи кръвосъсирването хирудинмутеини [Z-CCH.VKHCiyX-W^Hir в които Z означава един от остатъците OH, -NH2, -NH-CO-R, -О-R или -O-CO-R, където R означава С,-С4-алкилова група, η има стойност 2, 3 или 4, m - от 50 до 500, W е директна ковалентна връзка или свързваща група, р има стойност 1, 2 или 3 и Hir означава свързан чрез аминогрупата(ите) на лизиновата странична (и) верига(и) cZ-(CH2)n-[0(СН2)п]га-\У-остатъка(ците) полипептид с формула II
    A-Tyr-Thr-Asp-Cys-Ttir-Glu-Ser-Gly10 Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glii-Gly-Ser-Asn20
    Val-Cys-Gly-B-Gly-Asn-C-Cys-lle-Leu30 (II)
    Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-GIn-Val40 Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-D-Pro-GIn-Ser50
    His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-E-lle-Pro60
    Glu-Glu-Tyr-Leu-F
    65, в която
    A = Val-Val, = lle-Thr, = Leu-Thr или = Pro-Val,
    B = Gin или Glu,
    C = Lys, Arg или Asn,
    D = Lys, Arg, Asn или Gin,
    E = Glu или Pro,
    F = Asp или Gin, при което в полипептида с формула II една или повече аминокиселини в положения 30-38 са заменени или делетирани и се съдържат два допълнителни лизинови остатъка чрез заместване на една от наличните аминокиселини в положения 30-38.
  2. 2. Конюгат съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че полиалкиленгликолът е полиетиленгликол.
  3. 3. Конюгат съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че молекулното тегло на полиетиленгликола е между 4000 и 15 000 Da.
  4. 4. Конюгат съгласно претенции 1 до 3, характеризиращ се с това, че един или два полимерни остатъка са свързани за хирудинмутеина.
  5. 5. Конюгат съгласно претенции 1 до 4, характеризиращ се с това, че D означава Arg или Gin.
  6. 6. Конюгат съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че Hir означава полипептид с формула
BG98604A 1989-12-01 1994-02-28 Хирудинмутеини и техни полиалкиленгликолови конюгати BG62068B2 (bg)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3939800 1989-12-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG62068B2 true BG62068B2 (bg) 1999-01-29

Family

ID=6394620

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG98604A BG62068B2 (bg) 1989-12-01 1994-02-28 Хирудинмутеини и техни полиалкиленгликолови конюгати

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5663141A (bg)
EP (1) EP0502962B1 (bg)
JP (1) JP3187044B2 (bg)
AT (1) ATE135374T1 (bg)
BG (1) BG62068B2 (bg)
CA (1) CA2067224C (bg)
DE (1) DE59010205D1 (bg)
ES (1) ES2084149T3 (bg)
WO (1) WO1991008229A1 (bg)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
DE4117784A1 (de) * 1991-05-31 1992-12-03 Basf Ag Herstellung von protein-polyalkylenglykolkonjugaten
FR2687681B1 (fr) * 1992-02-20 1995-10-13 Transgene Sa Conjugues polyethyleneglycol-hirudine, leur procede de preparation et leur emploi pour le traitement des thromboses.
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5661001A (en) * 1993-08-04 1997-08-26 Ciba-Geigy Corporation High molecular weight desulphatohirudin
DE4437502A1 (de) * 1993-12-02 1995-06-08 Basf Ag Hirudin-Konjugate aus Hirudin und lipophilen Verbindungen
DE4404168A1 (de) * 1994-02-10 1995-08-17 Hoechst Ag Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung
DE19533817C2 (de) * 1995-09-13 1999-12-09 Max Planck Gesellschaft Komplex-gebundene Hemmstoffe aktivierbarer Stoffwechselenzyme als molekulare Marker zur Diagnostik und Therapieüberwachung
DE19915862A1 (de) * 1999-04-08 2000-10-12 Max Planck Gesellschaft Verwendung von molekulargewichtserweitertem Hirudin als Antikoagulans bei der extrakorporalen Nierenersatztherapie
US20040228852A1 (en) * 1999-04-08 2004-11-18 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V Use of increased molecular-weight hirudin as an anticoagulant in extracorporeal kidney replace therapy
US6809076B2 (en) * 2000-03-20 2004-10-26 Abbott Gmbh & Co. Kg Use of anticoagulant agents in the extracorporeal treatment of blood
WO2001070273A1 (en) * 2000-03-20 2001-09-27 Knoll Gmbh The use of anticoagulant agents in the extracorporeal treatment of blood
DE10102878A1 (de) 2001-01-23 2002-08-01 Haemosys Gmbh Oligo- oder Polyalkylengekoppelte Thrombininhibitoren
DE10162521A1 (de) * 2001-12-19 2003-07-17 Goetz Nowak Verwendung von molekulargewichtserweiterten Substanzen in der Tumortherapie
CN101094867B (zh) 2004-10-19 2011-08-24 隆萨股份公司 用于固相肽合成的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE58903988D1 (de) * 1985-04-11 1993-05-13 Hoechst Ag Hirudin-derivat.
JP2514950B2 (ja) * 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
FR2628429B1 (fr) * 1988-03-08 1990-12-28 Transgene Sa Variants de l'hirudine, leurs utilisations et les procedes pour les obtenir
AU614121B2 (en) * 1988-05-04 1991-08-22 Novartis Ag Improvements in the production of polypeptides
DE3819079A1 (de) * 1988-06-04 1989-12-07 Hoechst Ag Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung
CA2000887A1 (en) * 1988-11-01 1990-05-01 Cecilia S.L. Ku Thromboresistant materials and methods for making same

Also Published As

Publication number Publication date
US5663141A (en) 1997-09-02
ES2084149T3 (es) 1996-05-01
JP3187044B2 (ja) 2001-07-11
EP0502962A1 (de) 1992-09-16
DE59010205D1 (de) 1996-04-18
WO1991008229A1 (de) 1991-06-13
CA2067224C (en) 2001-02-13
CA2067224A1 (en) 1991-06-02
EP0502962B1 (de) 1996-03-13
ATE135374T1 (de) 1996-03-15
JPH05503092A (ja) 1993-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4519324B2 (ja) 共有結合で架橋されたインスリンダイマー
BG62068B2 (bg) Хирудинмутеини и техни полиалкиленгликолови конюгати
US5314872A (en) Glucan sulfate, stabilized fibroblast growth factor composition
US5312736A (en) Anticoagulant analogues of the tissue factor extrinsic pathway inhibitor (EPI) with reduced affinity for heparin
FI102843B (fi) Menetelmä oleellisesti puhdistettujen insuliinijohdannaisten valmistam iseksi
DE69133354T2 (de) Interleukin 1-beta protease und ihre inhibitoren
US5977310A (en) Peg-modified HGF
US4990455A (en) Novel human TNF polypeptide mutants and DNA&#39;s encoding said mutants
AU617291B2 (en) Method of chain combination
BG100420A (bg) Ацилиран инсулин
JPH08506095A (ja) 改変インシュリン様成長因子
EP1575490A2 (en) Modified glucagon-like peptide-1 analogs
KR20000016402A (ko) 렙틴(ob단백질)의 프레그먼트
US7144989B2 (en) Pegylated non-hypertensive hemoglobins, methods of preparing same, and uses thereof
JPH06502407A (ja) 血小板凝集阻害剤
CZ285225B6 (cs) Aprotininová analoga
US5095004A (en) Fluorine containing atrial natriuretic peptides
US5120715A (en) Method for purifying fibroblast growth factor protein
Tokunaga et al. Synthesis and expression of a human growth hormone (somatotropin) gene mutated to change cysteine‐165 to alanine
JPH08511157A (ja) Ｘａファクター阻害活性を有する新規ポリペプチド
US5376635A (en) Fluorine containing atrial natriuretic peptides
HU200939B (en) Process for stabilizing htnf obtained by recombinant dna technique
EP0900235B1 (en) Fragments of cr1 and their use
WO2005085283A1 (ja) 修飾インターロイキン−１１及びそれを含有する医薬組成物
JPS63316798A (ja) 新規なペプチド及びこれを有効成分とする創傷治療剤