JPH05503092A

JPH05503092A - ヒルジン突然変異蛋白質及びヒルジンポリアルキレングリコール複合体

Info

Publication number: JPH05503092A
Application number: JP3501205A
Authority: JP
Inventors: クルフュルスト，マンフレート; リュープザーメン，クラウス; シュミート，ベルンハルト; ケルヴァー，ヴォルフガング; シュヴェーデン，ユルゲン; ヴォルフガングヘフケン，ハンス
Original assignee: ビーエーエスエフ　アクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1990-11-22
Publication date: 1993-05-27
Anticipated expiration: 2016-07-11
Also published as: WO1991008229A1; BG62068B2; EP0502962A1; EP0502962B1; DE59010205D1; US5663141A; CA2067224C; JP3187044B2; CA2067224A1; ATE135374T1; ES2084149T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒルジンポリアルキレンゲリコール複合体本発明は、新規ヒルジン突然変異タンパク質及びそのヒルジンポリアルキレンゲリコール複合体、その製造並びに心臓血管疾病の予防及び処置及び高分子担体の変性のためのその使用に関する。

ヒルジンは、以前から公知の、天然に存在する血液凝固抑制特性を有するタンパク質である。これは、最も強力でかつ選択的な従来公知のトロンビン抑制剤である（Ｎａｔｕｒｗｉ　５ｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ　、　（１９５５）　４２．５３７　；Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙ　１ｅｒｓ　Ｚ、ｆｕｅｒ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＊ｉｅ、（１９８５）３６６．３７９）、薬用水蛭（Ｈｉｒｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）から単離可能なポリペプチドは、アミノ酸６５個からなり、ジスルフィド架橋３個を有し、かつチロシン６３の位置でスルフェート化されている。更に、なお多（の天然に存在する異性体が存在し、これらは、元のヒルジンとは、種々の箇所で異なっている（Ｆｏｌ　ｉａ　Ｈａｅｍａｔｏ　＋、　（１９８８）　、　１１５．３０）　、同様に、遺伝子技術で製造された変種は、公知である（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（＋９８８）、２７，６５１７．ＦＥＢＳ−Ｌｅｔｔ、（＋９８８）、２２９．８７）。　ヒルジン及び種々異なる変種は、今日、遺伝子技術法で入手でき、その際、遺伝子技術法を用いて製造されたヒルジンには、アミノ酸のＴｙ　ｒ　６３で、スルフェート基が欠けている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（＋９８９）、２８，２９４＋、ＤＮＡ（１９８６）、５，５１１）、同様に、この凝固抑制剤の良好な生理学的認容性は、相当以前から公知である（Ｐｂａｒｍａｚ　１ｅ（１９８１）、１０，６５３）。

良好な薬効的特性にもかかわらず、ヒルジンは、約５０秒の血中での僅かな半減時間に基づき、長時間の治療的使用にはほとんど適さない、タンパク質の半減時間が高分子との複合により延長しうることは公知である（Ｊ、　Ｂ　ｉｏ　１．　Ｃｈｅｗ、　（１９７７）　、　２５２．３５８２　；Ｂ　１ｏｃｈ　ｉｎ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ　。

Ａｃｔａ（＋９８１）、６６０，２９３）、　Ｌばしば、このような例えばポリエチレングリコールを用いる誘導体化後には、酵素活性の明らかな劣悪化が認められ、これは、これらの変性されたタンパク質の使用可能性を著しく制限する（Ｃａｎｃｅｒ、　Ｔｒｅａｔ、　Ｒｅｐ、　（１９７９）　、　６３．１１２７　；Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔ、　（＋９８０）　、　７７３）　、ヒルジンの場合、パルスマン（Ｗａｌｓｍａｎｎ）によって、デキストランとの結合により、とりわけ著しい活性の消失下で、約５０分〜７時間以上までの明らかな半減時間延長が達成されうろことが最近明らかにされた（Ｐｈａｒｍａｚ　ｉｅ　（＋９８９）　、　４４．７２）、良好に変えられた半減時間にもかかわらず、非常に僅かな収率の生成物、著しく減少した特異活性並びにこれとおそら（結び付いた薬効的特性の変化には、こ゛のようなデキストラン−ヒルジンの治療的使用を妨げている。

タンパク質と高分子とのの複合は、しばしば、アミノ酸アスパラギン酸又はグルタミン酸のカルボキシル基の反応を介して、アミノ酸システィンのスルホヒドリル基の反応を介して、又は相当するタンパク質のアミノ酸リシンの側鎖アミノ基の反応によって達成される。しかしながら、前記のアミノ酸は、しばしば、直接的に、相当するタンパク質の機能にとって、極めて重要である。タンパク質の誘導体化は、不活性化に至る物理学的／化学的又は酵素的特性の変化と結び付きうる。ヒルジンは、複数のアスパラギン酸−及びグルタミン酸基を、主に分子のＣ −末端範囲に含有している。リシン基は、ヒルジン分子中２７．３６及び４７の位置に存在する。更に、分子のＣ−末端又はＮ−末端を介する結合が考えられる。しかしながら、Ｃ−末端範囲での酸性アミノ酸（ＦＥＢＳ、Ｌｅｔｔ、（＋９８３）、１６４３０７−３１３）も、塩基性リシン基も、殊に分子中で著しく露出したりシン基Ｎｏ、　４７も、ヒルジンとプロテアーゼトロンビンとの相互作用に決定的に関与している（Ｂ１０１、ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ（＋９８５）、３６６．３７９−３８５）、　Ｎ−末端の所での反応、例えば延長（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（＋９８９）、２８．１００７９）は、ヒルジンの抑制作用の著しい減少をもたらす、従って、ヒルジンの誘導体化は、著しい活性消失なしに達成されることを期待できなかった。この予想は、パルスマン（Ｐｈａｒｍａｚｉｅ（＋９８９）、４４．７２）により実施されたデキストランを用いるヒルジンのりシン基の誘導体化のための操作により裏付けされた。

多くの酸性アミノ酸の数に基づき、高分子とヒルジンのカルボキシル側鎖との複合の際に、単一の生成物は期待されない、ポリペプチドの塩基性官能基の誘導　一体化の場合ですら、３２までの異なる化合物から成る混合物が予想される。モノ−、ジー及びトリー置換された誘導体においては、その物理学的及び化学的特性においては十分に同じであるが、その生物学的活性においては異なっている多くの位置異性体が考えられる、理論的に考えられる複合体の多くは、痕跡量範囲内でのみ全混合に寄与する場合ですら、不均一な生成物の分離の際の重大な問題を計算に入れなくてはならない。

ところで、ポリアルキレングリコール誘導体の複合は、適当なヒルジン−突然変異タンパク質の使用により、非常に良好に制御され、容認可能なＮ製経費で、化学的に単一のヒルジン−ポリマー誘導体が得られることが判明した。意外にも、一般式Ｉ：［Ａ−（ＣＨ：）−−［：Ｏ−（ＣＨｉ）−１ｍ−Ｂ−］ｐＨ＋ｒ　（１）［式中、Ａは、基−ＯＨ，−ＮＨ，、−ＮＨ−Ｇｏ−Ｒ１−〇−Ｒ又は− ０−Ｃ〇−Ｒを表わし、ここでＲは、０１〜Ｃ４−アルキレン基を表わし、ｎは、２．３又は４の数を表わし、ｍは、５０〜５００の数を表わし、Ｂは、直接共有結合又はリンカ−を表わし、ｐは、ｌ、２又は３の数を表わし、Ｈｉｒは、リシン−側鎖のアミノ基を介して（Ａ−（ＣＨ，）。−（０−（ＣＨ，）、）、− ８−）、−基に結合したヒルジン基を表わすコのヒルジン−ポリアルキレンゲリコール誘導体は、明らかに延長された生体有用性（Ｂｉｏｖｅｒｆｕｅｇｂａｒｋｅｉｔｅｎ）を有し、その際生物学的作用が完全に又は十分に得られることを発見した。

ヒルジン−突然変異タンパク質としては、一般式■■：Ａ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−ＡＳｐ−ＣｙＳ−Ｔｔｌｒ−Ｇｌｕ−５＠ｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ− Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−５ａｒ−ｘｓｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ− Ｇｌｙ−Ｂ　−Ｇｌｙ−＾ｓｎ−Ｃ−Ｃｙｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−ＩＩＤ　−Ａｓｎ−Ｇ】ｎ−Ｃｙｓ−ＶａＩ−Ｙｈｒ−Ｇｌｙ−ＧＩｕ−ＧＩｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｅ　−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−５ｉｒ−Ｈｌｓ−Ａｓｎ−＾５ｐ−Ｇリー＾５ｐ− Ｐｈｓ−Ｇｌｕ−Ｇ　−！１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｆ［式中、Ａは、Ｖａｌ−Ｖａｌ、ｌｌ５−Ｔｈｒ、　Ｌｅｕ−Ｔｈｒ、　Ｐｒｏ −Ｖａｌを表わし、Ｂは、Ｇｉｎ又はＧｌｕを表わし、Ｃは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎを表わし、Ｄは、−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−又は−Ｇｌｙ−Ｕ−Ｖ−Ｇｌｙ−Ｘ −Ｙ−を表わし、ここで、Ｕは、Ｓｅｒ、　Ｌｙｓ又は直接結合を表わし、■は、Ａｓｐ、　Ｌｙｓ、　Ａｓｎを表わし、Ｘは、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ又は直接結合を表わし、Ｙは、Ｌｙｓ、　Ａｒｇ、Ａｓｎを表わし、Ｅは、Ｌｙｓ、　Ａｒｇ、　Ａｓｎ、　Ｇｌｎを表わし、Ｆは、　Ａｓｐ、Ｇｌｎを表わし、Ｇは、Ｇｌｕ、　Ｐｒｏを表わす］の化合物並びにその塩がこれに該当する。

リシン３０からグルタミン３８の間の領域が変化したこのような突然変異タンパク質が、ＰＥＧとの複合に殊に適当であることが判明した。この範囲内で、次いでリシン基２７と同様の効率で結合する付加的リシン１個又は２個を押入することができる。更に、より簡単な反応操作及び化学的に単一な生成物のために、ＰＥＧとの反応が望まれないりシン基を弱い核性の他のアミノ酸に代えることは、有利である。前記の突然変異タンパク質において、Ｌｙｓ４７のＡ　ｒ　ｇ　４７又はＧ１ｎ４７での交換は、殊に好適なものであることが分かった。相当するＰＥＧ−突然変異タンパク質−結合生成物は、誘導体化されていない突然変異タンパク質と同様に、高い特異活性を有する。存在するもしくは新たに押入されたりシン基の数により、結合可能なポリマーの割合に、かつ従って複合体の分子量に影響が及ぼされる。

このようなヒルジン突然変異タンパク質は、遺伝子技術的方法で、非常に良好に製造することができる。

先ず、それぞれの突然変異タンパク質に関してコード化する核酸を合成的に製造する０次いで、このような合成遺伝子に適当な調節配列（プロモーター、ターミネータ−等）を与え、かつ異種系内に発現させることができる（ＦＥＢＳ−Ｌｓｔｔ、　（１９８６）　２０２．３７３　（１９８６）　；Ｂ　ｉｏ　１．　Ｃｈｅ＋ｌ。

Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ（＋９８６）３６７、７３１）　、この発現は、真核生物系（１１１乳票細胞、酵母又は糸状真菌ＩＩ）又は原核生物系（Ｅ、コリ、桿菌）中で行なうことができる。Ｅ。

コリ中での発現は、それからヒルジンを遊離させ、かつ引き続き活性化させることができる融合タンパク質を介して行なうのが有利である（ＤＭＡ　（１９８６）　５．５１１）　、次の例で、本発明により請求する突然変異タンパク質のいくつかの製造のみを記載するが、他の突然変異タンパク質も、同様に入手可能である。

リンカ−Ｂとしては、次の基がこれに該当するニーＸ−Ｃ０−、−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｗ−ＮＨ−ＧＯ−、−Ｘ−ＣＯ−ＣＨ，−ＣＨ！−ＣＯ−、−Ｘ−ｃＨ！− Ｃｏ−又は［式中、Ｘは、−５−１−０−、−ＮＨ−を表わし、かつＷｌｌｃ８〜Ｃ，−アルキレン基又はｐ−）二二しン基を表わし、かつＹは、−ＣＩ、−ＯＨ又はＨを表わす］。

この新規ヒルジンポリアルキレンゲリコール誘導体は、一般式１１のヒルジン− 突然変異タンパク質を、一般式ＩＩＩ　：［Ａ−（ＣＨ，）、−［０−（ＣＨユ）、］、−Ｅ　（ＩＩ＋）［式中、Ａ、ｍ及びｎは、前記のものを表わし、かっＥは、基−ｘ−ｃｏ−ｚ、−Ｘ−Ｃｏ−ＮＨ−１１−Ｎ＝Ｃ−０，−Ｘ−ＣＯ−ＣＨｚ−ＣＨｔ−ＣＯ−Ｚ、−Ｘ−ＣＨ， −Ｃｏ−Ｚ、又は−〇−５Ｏ，−Ｒを表わし、ここで、Ｘ、Ｗ及びＹは、前記のものを表わし、かつＺは、を表わし、Ｑは、ハロゲン原子１〜３個又はニトロ官能基１〜２個又はアセチル −基１個を表わし、かつＲは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｌ−プロピル、フェニル、トリル又はトレシルを表わすコのポリアルキレングリコール誘導体と反応させることにより製造することができる。

ＩＩ＋とヒルジン−突然変異タンパク質との反応は、次のようにして行なわれる：式Ｉ１１の活性化されたポリアルキレングリコールを化学量論量で又は過剰量で、適当な緩衝液（ｐＨ６〜１０）中、水中で、場合により補助塩基、例えば炭酸 −又は炭酸水素−ナトリウム又は−カリウム、水酸化アルカリ、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジイソプロピルアミン又はピリジンの添加下に、有機溶剤（メタノール、エタノール、インプロパツール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ドルオール）又は前記溶剤の混合物中で、−２０℃〜＋１００℃の温度、有利にはＯ℃〜＋６０℃の温度で、ヒルジン、脱スルフェートヒルジン、ヒルジン−突然変異タンパク質と反応させる。生じた複合体を単離し、かつタンパク質化学における常法を用いて精製し、特性付けする。

本発明に記載のポリアルキレン−ヒルジン−複合体は、ヒルジンに比べてより有効な薬効的作泪面を示す。

これは、ヒルジンの有利な薬物学的特性を有するだけでなく、更に、著しく延長された生物学的作用及びより良好な生体有用性を有する。更に、ポリアルキレングリコール−ヒルジン−複合体は、ヒルジンに比べて、明らかに低い抗原性を示す、この特性に基づいて、記載のポリアルキレン−複合体ヒルジン、ヘパリン及び低分子量ヘパリンは、血栓性塞栓疾病の治療及び予防において優れている。これらは、例えば心筋梗塞、重い静脈血栓症、末梢動脈閉塞症、肺塞栓症で、並びに体外循環、例えば血液透析又は心肺バイパスにおいて使用することができる。

更に、ポリアルキレンゲリコール−ヒルジン−複合体は、機械的方法及び溶解による動脈血管の再開通（Ｗｉｅｄｅｒｏｅｆｆｎｕｎｇ）後の再閉塞（Ｒｅｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）の抑制のために使用することができる。

更に、この新規ヒルジン−ポリアルキレングリコール−誘導体は、代用血管及び心臓−肺装置において、人工表面、例えば血液透析膜及びこれに必要な管系を被覆するために有効に使用される。

本発明の化合物は、通常、経口又は非経口（皮下、静脈内、筋肉、腹膜内）で投与することができる。

配量は、患者の年齢、状態及び体重並びに適用方法に依存する。それぞれの適用形及び症状に応じて、１日の作用物質用量は、一般的にＡＴＵ約２０−４００００　／体重ｋｇである。

新規化合物は、慣例のガレメス式適用形で、固体又は液体で、例えば溶液、軟膏、クリーム又はスプレーとして使用することができる。これは、常法で製造される６その際、作用物質は、慣例のガレヌス式助剤、例えば充填剤、貯蔵剤、流動調節剤、湿潤剤、分散剤、乳化剤、溶剤及び／又は噴射ガスを用いて加工することができる（）１．５ｕｃｋｅｒ等：Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、　Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、　１９７８参照）。

例１ヒルジン−突然変異タンパク質の製造ａ）ベクターの構成プロティンＡ−ベクターｐＲＩＴ　２Ｔ　（図１）は、市場で得られ、かつ詳述されている（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｅ５ｔｅｌｌ　Ｎｏ、２７−４８０８−０１）　、これを用いて、ペプチド及びタンパク質を黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）からのプロティンＡとの融合タンパク質として、Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で、製造することができる。このために、実検すべき核酸をプロティンＡ−レーゼラスター（Ｌｅｓｅｒａｓｔｅｒ）の保持下に、ベクターｐＲＩＴ　２Ｔのポリリンカー中に導入すべきである。　ｐＲＩ７２丁ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１及びＳａｌ　＋を用いて、製造者の指示に従って切断し、切断バッチを低沸点アガロースゲルを通して分離し、かつこのゲルから、より大きなベクターフラグメントを純粋形で単離した。

遺伝子技術の基本技術並びに詳細な作業教示は、サンブローク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等の（１９８９）　ｒモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）Ｊ第２版、Ｃ３Ｈ−Ｐｒｅｓｓ中に記載されている。

ｂ）本発明に記載のヒルジン突然変異タンパク質に関してコード化する配列を、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社のＤＮＡ−合成装置、モデル３８０Ａを用いて、その指示に従い、かつ製造者の化学薬品を用いて合成した。その際、完全コード化領域を、３部分配列から、相補的オリゴヌクレオチドそれぞれ２本に構成する。互いに相補的なオリゴヌクレオチドを一緒にし、９０℃まで５分間加熱し、かつ室温まで３０分間かかって冷却した。その除虫じる２本鎖フラグメントを、その５′−末端でキナーゼ化（ｋｉｎａｓｉｅｒｅｎ）させ、かつ連結させた。こうして形成されたヒルジン遺伝子を、線状化された発現ベクターｐＲＩＴ２ＴのＥｃｏ　Ｒ１及びＳａｌ　１位置に、正しい配向で、かつプロティンＡ−レーゼラスターの保持下に、導入することができた。

種々異なる突然変異タンパク質を製造するために、次の配列（図２）を互いに組み合わせた突然変異タンパク質　組み合わせ配列　変　化ヒルジン　ｌＡ＋２Ａ＋３ＡＨＬ　ｌ　ｌＡ＋２Ａ＋３Ｂ　Ｌｙｓ４７−＋Ａｒｇ４７Ｇｌｕ３５−＋ＧＩＮ３５Ｇ　Ｉ　ＬＩ３５→Ｇ　ｌＮ３５連結反応により生じるキメラプラスミド（ｐＲＩＴ　２Ｔ−Ｈｉｒ）を、ＤＮＡ　増幅のために、ラムダ−溶原株中で形質転換させ、ＤＮＡを単一クローンから単離し、かつＤＮＡ−配列分析により、正しい配列の存在に関して検査する。

例２融合タンパク質の発現その都度の発現プラスミドｐＲＩＴ　２Ｔ−ＨｉｒをＥ、コリ（ｃｏｌｉ）　Ｎ４８３０−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｅ５ｔｅ１１−Ｎｏ、２７−４８０８− ０１）株中で形質転換させた。この株は、染色体的に、感熱性のラムダ−リプレッサーＣｌ８５７を含有している。

テシケータを備えた１１エーレンマイヤーフラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒｋｏｌｂｅｎ）中で、ＭＩＭ−媒体（Ｍ　Ｉ　Ｍ＝　１１当たりトリプトン３２ｇ、酵母抽出物２０　ｇ、Ｎａ、ＨＰｏ、６ｇ、ＫＨ！Ｐ０．　３ｇ、ＮａＣｌ　０．５ｇ、ＮＨ４Ｃｌ　１　ｇ及びＭｇ５Ｏ，０、１ｍ　Ｍ並びにＦｅＣ１，Ｏ、ＯＯ１ｍＭ）１００ｍｌを滅菌し、かつアンピリジン（１００μｇ／ｍｌまで）を添加した。この媒体に、ｐＲＩＴ　２ＴＡ−Ｈｉｒ／Ｎ　４８３０−１株の新しい１晩経過培養液（Ｕｅｂｅｒ−Ｎａｃｈｔ−Ｋｕｌｔｕｒ）　ｌ　ｌを接種し、かつ振動下に、５５０ｎｍでの吸光度が０．６になるまで、２８℃で培養した０次いで、６５℃の温かい新製旧Ｍ／ａｍｐ−媒体１００ｍ１を加え、かつ４２℃で更に４時間培養した。この時間内に、所望の融合タンパク質が合成された。リソチーム７５ｍｇ／ｌの添加及びインキュベーション（３時間、３７℃）により、細胞壁を酵素的に除去した。次いで、細胞を機械的に（マトン−ガラリン −プレス（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌ　１ｎ−Ｐｒｅｓｓｅ）、凍結サイクル（Ｅｉｎｆｒｉｅｒｚｙｋｌｕｓ）、激しい撹拌）、８０’Ｃまでの熱ショック又は低張性溶菌（ｈｙｐｏｔｏｎｅ　Ｌｙｓｅ）により溶解させ、かつ可溶性融合タンパク質を媒体中に遊離させることができた。

例３融合タンパク質の精製細胞砕片を遠心分離により除去し、かつ澄明な上澄をＩｇＧ−セフ７０−スーカラム（ＩｇＧ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ［Ｆ］６＋Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ″、　Ｐｈａｒｍａｃｉ　ａ、　Ｂｅ５ｔ、Ｎｏ、　１７−０９６９−０１）を介してポンプ導入する。カラム物質の成層、カラムの準備及び設計、装入条件及び流速は、製造者の報告に従う。

従って、上澄６１のために、２００　ｍ　ｌのゲル層及び約３１／時間の流速を使用した。この工程において、融合タンパク質をそのＩｇＧ−結合プロチインへ一部を介して可逆的に、ゲルマトリックスに結合させた（収率的９５％）。装入後に、カラムをＴＳＴ　（５０ｍ　Ｍ　トリス−ＨＣＩ　ｐＨ７，６；　１５０ｍＭ　ＮａＣ１及び０．０５％トウイーン（Ｔｗｅｅｎ）８２０　）　ｌ　Ｏ尿量を用いて洗浄した。０．５Ｍ酢酸塩ｍ衝液ｐＨ２゜８を用いて、溶離を行なった。

例４融合タンパク質の分解例３からのカラム溶出物を凍結乾燥させ、かつ−２０℃で貯蔵した。これを、分解のために、７０％アミノ酸中に、約２５ｇ／ｌのタンパク質濃度で入れた。

アルゴンで掃気の後に、ヒルジンの離脱のために、融合タンパク質１ｇ当たり固体としてのＢｒＣＮ　１　ｇを添加した。この分解をアルゴン気下、３７℃で約４時間行なった。過剰量のシアン化臭素、溶剤及び他の揮発性成分を凍結乾燥により除去した。引き続き、水で３回洗浄した。

例５ヒルジン又はヒルジン突然変異タンパク質の変性及び精製凍結乾燥物を１〜１００ｍｇ／タンパク質　ｍｌで、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、Ｏ，１Ｍトリス／ＨＣｌｐＨ８，５，０，２Ｍ　ＤＴＴ中ニ入レタし２時間のインキュベーンコン後に、プローブをＧ−１０−溶解（八ｕｓｓｃｈｌｕｓｓ）クロマトグラフィ　（ｌｏｍＭＨｃｌを用いて平衡させた）により、脱塩させた。

この脱塩させプローブをＯ，ＩＭトリス／ＨＣｌ、５ｍＭＧＳＨ１０，５ｍＭ　Ｇ５５Ｇ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，７中１２０で希釈し、かつ１時間インキュベーションした（ＧＳＨは、還元グルタチオン及びＧ５５Ｈは、酸化グルタチオンである）。この処理により、ヒルジンの特異的活性が３〜５倍上昇した。ＨＣＩを用いてｐＨ７，６までｐＨ値を調節し、ＮａＣ１１５０ｍＭまで及びトウイーン＠０．０５％まで添加した後に、ＩｇＧ−セファロースを通すクロマトグラフィーを繰り返した（例３）。プロティンＡ−融合成分及び分解されなかった融合タンパク質がカラムに付着する一方、活性ヒルジンは、〉９０％の純度で流液中に存在した。これは、典型的なタンパク質化学法により、臨床的純度になるまで更に精製することができた。

例６メトキシ−ポリエチレングリコール（８０００）　−Ｎ−スクシンイミド−カルボネートの製造ａ）Ｎ−スクシンイミドークロロホルミエートジクロロメタン２００　ｍ　ｌ中のホスゲン約３０ｇの溶液中に、０℃で３０分かかって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−カリウム塩２１．０ｇを入れ、かつこの混合物を０℃で２時間撹拌する。引き続き、過剰のホスゲンを放出するために、窒素を１時間、懸濁液に通した（洗浄塔）、この！ｌ！濁液を濾過し、かつ濾液を真空中で濃縮乾固させる。

Ｎ−スクシンイミドークロロホルミエート１０．６ｇは、黄色油状物として存在し、かつ無機塩及びジスクシンイミドーカルポネートで汚染されている。粗生成物は、更に精製せずに、ポリアルキレングリコールとの反応のために使用することができるか、又はジエチルエーテル１５０ｍ１中での溶解、濾過及び新たな濃縮によって、無機塩から遊離させることができる。

ｂ）メトキシ−ポリエチレングリコール（８０００）　−Ｎ　−スクシンイミド −カルボネートメトキシ−Ｐ　Ｅ　Ｇ　（８０００）−〇ＨＩＯ，Ｏｇを簡単な加温により乾燥ピリジン２０ｍ１中に溶かす。室温まで冷却後に、溶液にＮ−スクシンイミドークロロホルミエート８９０ｍｇを加え、かつ１晩撹拌する。過剰量のジエチルエーテルの添加後に、混合物を水浴中で３０分撹拌し、沈殿した固体を濾別し、インプロパツールから２回再結晶させ、ジエチルエーテルから沈殿させ、濾別し、かつ乾燥させる。メトキシ−ポリエチレングリコール（８０００）　−Ｎ−スクシンイミド−カルボネート８．１０ｇが無色固体として生じる。

例７メトキシ−ポリエチレングリコール（８０００）　−４−二トロフェニルーカルポネートの製造ａ）４−ニトロフェニルークロロホルミエートトルオール６０ｍ１中のニトロフェノール２０．０ｇの懸濁液中に、０℃でホスゲン約４３ｇをガス導入する。この混合物を０℃で４〜５時間撹拌する。引き続き、−１５℃でゆっくり、ドルオール２０ｍ１中のトリエチルアミン２０ｍ１の溶液を滴加し、かつ１晩、氷を溶かした冷却浴中で撹拌する。過剰のホスゲンを窒素により放出し、かつ引き続き、反応混合物を濾過する。濾液を真空中で濃縮乾固させる。油状の茶色残分３３．７ｇは、４−ニトロフェノールークロロホルミエートの他に、溶剤及び塩を含有する。混合物を冷蔵庫中で結晶化させ、かつこれは、更にｆｌＩ製せずに使用することができる。

ｂ）メトキシ−ポリエチレングリコール（８０００）　−４−二トロフェニルーカルボネート製造及び精製を例６と同様に行なう。

例８メトキシ−ポリエチレングリコール（８０００）　−２，４。

５−トリクロロ−フェニルカルボネートの製造ａ）２，４．５−トリクロロフェニルークロロホルミエートジクロロメタン５０ｍ１中の２．４．５−トリクロロフェノール１０．０ｇの溶液中に、０℃でホスゲン約７ｇをガス導入し、かつ混合物を０℃で１５分撹拌する。ジクロロメタン２０ｍ１中のキノリン７．２ｍｌを３０分かかって滴加し、がっ橙色懸濁液を水浴中で更に１時間撹拌する。引き続き、過剰のホスゲンを放出するために、１時間、窒素を懸濁液に通す（洗浄塔）、引き続き、混合物を濾過し、濾液を水で２回洗浄し、乾燥させ、新たに濾過し、かつ真空中で濃縮乾固させる。油状の茶色残分は、比較的きれいな２，４゜５−トリクロロフェニルクロロホルミエートであり、これを冷蔵庫中で結晶化させ、かつ更に精製せずに使用することができる。

ｂ）メトキシ−ポリエチレングリコール（８０００）　−２。

４．５−トリクロロ−フェニルカルボネート製造及び精製を例６と同様にして行なう。

例９メトキシ−ポリエチレングリコール（８０００）　−４−二トロフェニルカルボネートとヒルジンとの反応によるＰＥＧ、−ヒルジンの製造脱スルフェートヒルジン（特異的活性：　８０００Ａ　Ｔ　Ｕ／ｍｇ）４０ｍｇを０，１Ｍポレート緩衝液、ｐＨ８゜０　２０ｍ１中に溶かし、かつメトキシ− ポリエチレングリコール（８０００）　−４−ニトロフェニルカルボネート８０ｍｇを加え、かつ２５℃で３時間インキュベーションする。１００倍モル過剰のトリス塩基との反応の終了後に、反応パッチを２０ｍＭトリス／ＨＣＩ、ｐＨ８，０に対して透析させ、かつ生じる生成物混合物をＨＰ−Ｑ−セファｏ−ス［Ｆ］−カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ■）上に装入する。カラムを、２０ｍＭトリス／ＨＣ１、ｐＨ８，０中０〜４００ｍＭ　ＮａＣｌの直線Ｎａｃｌ勾配を用いて展開させる。ＰＥＧ、−ヒルジン−複合体は、２００ｍＭＮａＣｌで溶離する。

結合パッチ中のＰＥＧ、−付加生成物の収率は、約５０％であり、ヒルジンの残り５０％は、ＰＥＧ、−誘導体として、又は誘導体化されずに存在する。

結合パッチから精製したＰＥＧ、−ヒルジン−複合体の特異な活性は、８０００　Ｕ　／タンパク賀ｍｇ（発色基質３２２３８　（Ｋａｂｉ）、（ＦＥＢＳ−Ｌｅｔｔ、　（１９８３）、１６４．３ｏ７）を用いるトロンビン抑制試験により測定、タンパク質は、標準（Ｐｉｅｒｃｅ）として血清アルブミンを用いるＢＣＡ−試験により測定する）、複合体の分子量１５０００Ｄａ（スペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）＠−１２−クロマトグラフィー、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）であった。

例１０ＰＥＧ、−ヒルジンの製造脱スルフェートヒルジン４０ｍｇを０．０５Ｍホウ酸ナトリウムー又は炭酸ナトリウム！ｌ衝液、ｐＨ８゜０　１０ｍ１中に溶かし、かっＨ，Ｏ又は１．４ジオキサン中の２．４．５−トリクロロフェニル−又は４−二トロフェニルー活性メトキシポリエチレングリコール（８０００Ｄａ）　２４０　ｍ　ｇの溶液を加え、かつ２５℃で３時間インキュベーションする。１００倍モル過剰のトリス塩基との反応の終了後に、反応バッチを２０ｍＭトリス／ＭＣ１，ｐＨ８，０に対して透析する。生じる生成物混合物をＨＰ−Ｑ−セファロース［Ｆ］−カラム上に装入し、次いでカラムを０〜４００ｍＭＮａＣ１の直線ＮａＣｌ勾配を用いて展開させる。　Ｐ　Ｅ　Ｇ　ｒ−ヒルジン−錯体は、１２０〜１３０ｍＭ　ＮａＣ１で溶離する。

ＰＥＧ、−ヒルジンの割合は、結合パッチ巾約５０％であり、残りのヒルジンは、結合ＰＥＧ−基ｌ及び３個を有するＰＥＧ−誘導体に分かれた。

精製したＰＥＧ、−複合体の特異な活性を、例９に記載のようにして測定すると、かっ６２００Ｕ／タンパク質ｍｇであり、複合体の分子量は、２２０００Ｄａ〜２３０００Ｄａであった（スヘロース＠−１２）。

例１１ヒルジン突然変態タンパク質ＨＬ］４Ｂとメトキシ−ポリエチレン−グリコール（８０００）　−４−二トロフェニルカルボネートとの反応ヒルジン突然変異タンパク質ＨＬ１４Ｂ（特異な活性８９００ＡＴＵ／ｍｇ）１０ｍｇを例１０により、濃度２０　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉまで、Ｏ，１Ｍ炭酸ナトリウム、緩衝液ｐＨ８，０中に溶カシ、１．４ジオキｆン０．５ｍｌ中に溶かした４−ニトロフェニル−活性化メトキシポリエチレングリコール（８０００Ｄａ）８０ｍｇを加え、かつ２５℃で３時間インキュベーションした。

次いで、反応を１００倍過剰量のトリス−塩基の添加によって中断させ、遊離した４−ニトロフェノールを除去し、かつヒルジン−ＰＥＧ複合体をアニオン交換クロマトグラフィー（例９参照）により精製する。

結合パッチ中の所望のＰＥＧ、−誘導体の割合は、約８０〜８５％であり、不所望のＰＥＧ、−及びＰＥＧ、−の割合は、それぞれ最大約５〜ｌＯ％であった。

精製したＰＥＧ、−ＨＬ　１４Ｂ−複合体の特異な活性は、８３００Ｕ／タンパク質ｌ１ｇであった０分子量は、スベロース［有］−ゲル濾過により、２２０００−２３０００Ｄａと測定された。

例１２ＰＥＧ、−ヒルジン−複合体の薬剤作用２群のイヌ（ピーグル犬、各群につき４匹）に、それぞれＰＥＧ、−ヒルジン４００００／Ｋｇを静脈内又は皮下適用した（０．２ｍｌ　Ｖａｔ）　、注射の０．２５．０．５、ｌ、２．３．４．６．８．２４．３２．４８．５６．７２及び８０時間後に、血液各２ｍｌを０．１ＭＮａ−クエン酸塩中に取った。引き続き、血小板の少ない血漿を１０分の遠心分離により４０００ｇ製造し、かつ血漿のＰＥＧ−ヒルジン濃度をトロンビン抑制により、５２２３８（Ｋａｂｉ）での発色基貿検定において測定した。比較のために、同じイヌを他の実験において、ヒルジンで処理した０次いで、血漿−ヒルジン濃度の時間的経過を前記のように間並びに良好な生物学的有用性が明らかになる。

図１ εｃｏＲＩ　Ｓｍａｌ　８ａｍＨＩ　５ａｌＩ　ＰｓｉＩ゛−一一薬剤作用ＰＥＧ　−ヒルジン　及び　「−ヒルジン注射後の時間（時間） −ＰＥＧ２−ヒルジン　＋「−ヒルジン（４０００ＡＴＵ／に９）　（４０００ＡＴＵ／ｋｇ）図４薬剤作用ＰＥＧ２−ヒルジン　及び　ｒ−ヒルジン注射後の時間（時間） −ＰＥＧ２−ヒルジン　＋ｒ−ヒルジン（４０００ＡＴＵ／ｋｇ）　（４００００ＡＴＬＪ／ｋｇ）国際調査報告一一一一師一一１−ρＣＴ／ＥＰ　９０１０１９９８国際調査報告ＰＣＴ／ＥＰ　９０１０１９９８

Claims

【特許請求の範囲】

１．ポリアルキレングリコール又はポリアルキレングリコール誘導体とヒルジン、脱スルフェートヒルジン又は血液凝固抑制ヒルジン−突然変異タンパク質とからの式Ｉ：［Ａ−（ＣＨ２）ｍ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｎ］ｍ−Ｂ−］ｑＨｉｒ（Ｉ）［式中、Ａは、基−ＯＨ，−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ、−Ｏ−Ｒ又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒを表わし、ここでＲは、Ｃ１〜Ｃ４−アルキレン基を表わし、ｎは、２、３又は４の数を表わし、ｍは、５０〜５００の数を表わし、Ｂは、直接共有結合又はリンカーを表わし、ｐは、１、２又は３の数を表わし、かつＨｉｒは、リシン−側鎖のアミノ基を介してＡ−（ＣＨ２）ｎ−（Ｏ−（ＣＨ２）ｎ）ｍ基に結合している一般式：【配列があります】（ここで、Ａは、【配列があります】を表わし、Ｂは、Ｇｌｎ又はＧｌｕを表わし、Ｃは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎを表わし、Ｄは、−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−又は【配列があります】を表わし、ここで、Ｕは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又は直接結合を表わし、Ｖは、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｓｎを表わし、Ｘは、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ又は直接結合を表わし、Ｙは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎを表わし、Ｅは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎを表わし、Ｆは、Ａｓｐ、Ｇｌｎを表わし、Ｇは、Ｇｌｕ、Ｐｒｏを表わす）のポリペプチドを表わす］の複合体。
２．ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項１記載の複合体。
３．ポリエチレングリコールの分子量が４０００〜１５０００Ｄａである、請求項２記載の複合体。
４．ポリマー基１又は２個がヒルジンに結合している、請求項１から３までのいずれか１項記載の複合体。
５．１種以上のアミノ酸が３０〜３８の位置で交換もしくは欠失している、請求項１記載のヒルジン突然変異タンパク質。
６．３０〜３８の位置に、１又は２個の付加的リシン基を含有する、請求項５記載のヒルジン突然変異タンパク質。
７．付加的に、４７及び／又は３６の位置で、リシンがアルギニン又はグルタミンに交換されている、請求項６記載のヒルジン突然変異タンパク質。
８．式：【配列があります】の、請求項５記載のヒルジン突然変異タンパク質。
９．式：【配列があります】の、請求項５記載のヒルジン突然変異タンパク質。
１０．式：【配列があります】の、請求項５記載のヒルジン突然変異タンパク質。
１１．式：【配列があります】の、請求項５記載のヒルジン突然変異タンパク質。
１２．式：【配列があります】の、請求項５記載のヒルジン突然変異タンパク質。
１３．疾病を予防するための、請求項５から１２までのいずれか１項記載のヒルジン突然変異タンパク質並びに相当するポリマー複合体。
１４．表面被覆のための、請求項５から１２までのいずれか１項記載のヒルジン突然変異タンパク質。
１５．表面被覆のための、請求項１から４までのいずれか１項記載のポリマー複合体。