JPH0315389A - アンクロッド様ポリペプチドをコードする新規ｄｎａ配列およびそれらの発現生成物より成る組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明はアンクロツド（ａｎｃｒｏｄ）活性を示すポリ
ペプチドをコ′−ドする新しいＤＮＡ配列、およびそれ
らを含んで或る組換えＤＮＡ分子に関する。

更に本発明はこれらＤＮＡ分子により形質転換された宿
主およびそれらにより発現された組換えポリペプチドに
も関する。更に本発明はこれら組換えポリペプチドを用
いた薬学的に有効な組成物および方法に関する。

背景技術 ある種の蛇の毒が抗凝血活性を有する成分を含んでいる
ことは多午にわたり知られている。

これらの戊分のうちの一つであるアンクロツドはマライ
産マムシ（Ｍａｌａｙａｎ　ｐｉｔ　ｖｉｐｅｒ）、ア
グキストロドン・ロドストーマ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏ
ｎｒｈｏｄｏｓＬｏｍａ）　ｓから単離されている（米
国特許第３．７４３．７２２号および米国特許第３，８
７９，３６９号）。

アンクロツドは約３８．０００の分子量を有する重度に
グリコシルされた酵素である。天然アンクロツドは多午
にわたり知られているが、その調整物の純度は不確かで
ある。その上、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列は単離されまたは合威されたことはなく、またそのア
ミノ酸配列も決定されていない。

正常な血餅形成は、７イブリノゲンから７イブリノペプ
チドＡおよび７イブリノペブチドＢの両方を分裂して血
餅の主或分であるフイブリンを生成するトロンピンによ
り仲介される。アンクロツドはフイブリノゲンから７イ
ブリノペプチドだけを分裂させることによってその抗凝
血作用を発揮する。これによってそれ以上にはトロンビ
ンによって分裂され得ず、そして正常メカニズムにより
循環から除かれる分子が得られる。またアンクロツドは
既に形威された血餅の溶解を早めることも報告されてい
る．この作用は間接的なものであり、そしてアンクロツ
ドの組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔＰＡ）および
／またはウロキナーゼの生体内合成を誘発する能力によ
るものとされている。

アンクロッドは過去２０年、世界の多くにわたり臨床用
途に利用可能となっている。それは少くとも慣用の抗凝
血剤、例えばヘパリンやワルファリンなどと同程度に有
効であるが出血合併症が少い点で著しくより安全である
ことが示されている（Ｚ．　　Ｓ．　　ＬａＬａｌｌｏ
，　”ＲｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅＳｔｕｄｙｏｎ　　
Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　　ａｎｄ　　Ａｄｖｅｒ
ｓｅ　　Ｅｆｆｅｃｔｓｏｒ　　ＴｒｅａＬｍｅｎｔ　
　ｗｉｔｈ　　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−Ｌｉｋｅ　　Ｅｎｚ
ｙｍｅｓ−ＡＭｕｌＬｉｃｅｎＬｅｒ　　Ｔｒｉａ！”
，Ｔｈｒｏｎ＋ｂ．　　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，５０
．　ｐｐ．　６０４〜０９　（１９８３））臨床研究に
より、深部（ｄｅｅｐ）静脈血栓症の防止、糸球体血栓
に伴う糸球体ネ７ローゼ患者の腎機能改善、全身性エリ
テマトーデスに伴う急速な臓器劣化および凝固性冗進状
態の反転、不安定および安定狭心症における症状の軽減
および除去および血栓性発作症候群における神経学的劣
化においてアンクロツドが安全かつ有効であることが示
されている（Ｇ＋Ｄ．　Ｏ．　Ｌｏｖｅなど，“Ｓｕｂ
ｃｕｔａｎｅｏｕｓ　Ａｎｃｒｏｄｉｎ　Ｐｒｅｖｅｎ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｅｅｐ　Ｖｅｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂｏ
ｓｉｓ　Ａｆｔ−ｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　
Ｆｒａｃｔｕｒｅｄ　Ｎｅｃｋ　ｏｆ　Ｆｅｍｕｒ”，
Ｌａｎｃｅｔ．　２．　　ｐｐ−６９８〜７００　（１
９７８）；　Ｓ．　Ｋｉｎなど．″Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕ
ｌ　Ｔｒｅａｔａ＋ｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ａｎｃｒｏｄ　
ｏｆ　Ｇｌｏ−ｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ　ｗｉ
Ｌｈ　Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ　Ｔｈｒｏａ＋ｂｉ　ｉｓ
Ｄｕｅ　ｔｏ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｉｂｒ
ｉｎｏｌｙｓｉｓ”，　ＣＩｉｎ．Ｒｅｓ．．　　３４
．　　ｐ．６９８Ａ　（１９８６）　；　Ａ．　Ｋ．　
Ｄｏｓｅｋｕｎなど．“Ａｎｃｒｏｄ　ｉｎ　Ｓｙｓｔ
ａｍｉｃ　Ｌｕｐｕｓ　Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓｗ
ｉｔｈ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　
ａｎｄ　ＦｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓＥｆｆｅｃｔｓ”．
　Ａｒｃｈ．　Ｉｎｔｅｒｎ．　Ｍｅｄ１１４４．ｐｐ
・３７−４２（１９８４）；　Ｐ．　Ｇｌａｓ−Ｇｒｅ
ｅｎｖａｌｔなど．“Ａｎｃｒｏｄ：Ｎｏｒｍａｌｉｚ
ａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｆｉｂｒｉｎｏｊｙｔｉｃ　　
Ｅｎｚｙｍａ　　Ａｂｎｏ−ｒｍａｌｉＬｉａｓ　　ｉ
ｎ　　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　　ｗｉｔｈ　　Ｓｙｓｔｅａ
＋ｉｃ　　ＬｕｐｕｓＥｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ　　
ａｎｄ　　Ｌｕｐｕｓ　　Ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ”，Ｊ．
Ｌａｂ．ＣＩｉｎ．Ｍｅｄ．，１０５．ｐｐ．９９〜ｌ
０７　　（１９８５）；　　Ｍ．Ｂ−Ｌｅｏｎなど，“
Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ　Ｃｌｏｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｔ
ｈｒｏ＋ｍｂｏ−ｌｙＬｉｃ　　Ｔｈｅｒａｐｙ　　ｉ
ｎ　　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　　ｗｉｔｈ　　Ｒｅｆｒａｃ
ｔｏｒｙＣｈｒｏｎｉｃ　　Ｓｔａｂｌｅ　　Ａｎｇｉ
ｎａ：　　Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｉｃ．Ｃｏｒｏ−ｎａ
ｒｙ　　Ｂｌｏｏｄ　　ＦＩＯＷ，ａｎｄ　　Ｍｅｔａ
ｂｏｌｉｃ　　Ｃｈａｎｇｅｓ’．，Ｃｉｒｃｕｌａｔ
ｉｏｎ，　　７０，　ｐ−３２３（１９８４）；　Ｖ．
　Ｈｏｓｓｍａｎなど．“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｔｒ
ｉａｌ　ｏｆ　Ａｎｃｒｏｄ　ｉｎ　Ｉｓｃｈｅｍｉｃ
Ｓｔｒｏｋｅ”，Ａｒｃｈｉｖｅｓ　　ｏｆ　　Ｎｅｕ
ｒｏｌｏｇｙ，４０　　（Ｎｌ３）＋ｐｐ　８０３〜８
０８．１９８７）　　。

更にアンクロツドはストレグトキナーゼおよびウロキナ
ーゼとの併用で血栓溶解を高めまたそれら剤の投与後に
普通みられる再閉ａｍ象を防止する目的に用いられ或功
している（Ｂ．Ｃｅｒｃｅｋなど．“Ａｎｃｒｏｄ　Ｅ
ｎｈａｎｃｅｓ　ｔｈｅ　ＴｈｒｏｍｂｏＪｙ−ｔｉｃ
　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｒ　Ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ　
ａｎｄ　Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　，Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｒａ
ｓ．．　４７．　ｐｐ．４１７〜２６　（１９８７））
。

今日までのその有効性にも拘らず、アンクロツドを約６
週間以上投与するとこの化合物を服用している患者に免
疫応答が充進してくる．これらの抗体がアンクロンド、
投与組成物に含まれる不純物またはそれら両方の組合せ
に対して生じたものかどうかは明らかでない。生戒する
抗アンクロツド抗体はアンクロツドの作用を減じまたは
消してしまう。現在のところ、これら抗体を生じる患者
の治療を有効に統けるには二つの方法しかない。一つの
方法は他の、作用の弱いまたは危険度の高い薬剤を投与
する方法である。もう一つの方法は形を変えたアンクロ
ツド、例えばノイラミニダーゼ処理アンクロツド（ＮＴ
Ａ）　（．米国特許第４．５８５．６５３号）を投与す
る方法である。ＮＴＡは天然アンクロツドに存在するシ
アル酸残基を欠いている。

アングロツドの広汎な使用のもう一つの障害はその入手
可能性およびコストにある。この化合物はその天然給源
である蛇毒から入手し得るに過ぎない。従って、商業的
に採算のとれる量の化合物の製造には蛇の飼育施設およ
びそれらの毒を採集する専門家が必要となる。その上、
一定の時間に蛇から採集し得る毒量には限りがある。

そこで、アンクロツドに所望される性質を示すが、より
効率的にかつ商業的に採算のとれる量で生産できる化合
物の必要性が依然として存在している。更に、かかる化
合物は、その有効性を減じる免疫応答を誘発することな
く長時にわたり投与できるべきである。

発明の概要 本発明はアンクロツドおよびアンクロツド様ポリペプチ
ドの発現（　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）をコードするＤＮ
Ａ配列を提供することにより前記課題を解決するもので
ある。更に本発明はこれらＤＮＡ配列より或る組換えＤ
ＮＡ分子を提供する。更に、これらＤＮＡ配列を細菌宿
主で発現させると天然アンクロツドに特徴的な糖部分を
欠くアンクロッド様ポリペプチドが生戊する。二の特徴
は、天然のグリコシル化されたポリペプチドによる治療
に比べ、本発明の組換え細曹ポリペプチドで治療した患
者に誘発される免疫応答を減じる上で有益であり得る。

更に、本発明は本発明の組換えアンクロツド様ポリペプ
チドを使用する血餅（ｂｌｏｏｄ　ｃｌｏｔ）を溶解す
る、およびその形戊を防止するための組戊物および方法
を提供する。これらの組或物および方法は血栓溶解性発
作および心疾患の治療Ｊこ特に有用である。

以下の開示より理解されることになるが、本発明は天然
のカウンターパートよりも迅速かつ低廉に生産できるア
ンクロツド様ポリペプチドをほぼ無限に供給できる。更
に、本発明のアンクロツド様ポリペプチドは、天然化合
物よりも驚くべき程にかつ予想外に使用上安全でありか
つ強力である。

本発明の詳細な説明 本明細書に用いる用語「アンクロツド様ポリペプチド」
とは天然アンクロツドのアミノ酸配列に対し少くとも７
０％、より好ましくは少くとも９０％の相同性（ｈｏ■
ｏｌｏｇｙ）を有し、そして天然アンクロツドのフイプ
リノゲン溶解活性を示し（すなわち、フイブリノゲンか
らフイブリノペプチドＡは分裂させるがフイブリノペプ
チドＢは分裂させず）、あるいはＬＰＡまたはウロキナ
ーゼの生体内合戊の誘発能を示すポリペプチドのことで
ある。かかるアンクロツド様ポリペプチドには天然アン
クロツドのアミノ酸配列より成る分子のはか一以上の欠
失、置換、挿入、逆位または付加を含む分子が包含され
るがそれらに限定されることはない。かかるペプチドの
例はプローアンクロンド（その天然シグナル配列を含む
アンクロツド）　、＋ｍａｔ−ａｓｐ−プローアンクａ
ｙドおよびｍｅｔ−アンクロツドなどである。

本明細書に用いる用語「患者」は任意の噛乳動物、特に
人間、である。

本発明はアンクロツド様ポリペプチドの発現をコードす
るＤＮＡ配列に関する。本発明のＤＮＡ配列の単離また
は合成はまず、天然アンクロツドのアミノ酸配列の全部
または一部の解明を必要とする。

アンクロツドの単離方法は当該技術分野において周知で
あり、またいくつかの米国特許（米国特許第３．７４３
．７２２および３，８７９，３６９号）の主題となって
いる。単離生戊物はアミノ酸配列決定にかけられること
になるので、そのアンクロツドを最大限に精製すること
が極めて好ましい．従ってアンクロツドの好ましい精製
は、アグマチンーアガロースでのアフイニチイ・クロマ
トグラフイを用いた第一精製段階およびひき続いての陰
イオン交換クロマトグラフイ樹脂、好ましくはＤＥＡＥ
への異物吸着より放る。最終精製工程には、好ましくは
別のイオン交換樹脂例えばＤＥＡＥ１次いで逆相樹脂例
えば７エニルを用いた、ＨＰＬＣが採用される。

アンクロツドは比較的大きなポリペプチドであるため、
そのアミノ酸配列の測定には、配列決定するに十分小さ
なペプチド断片の作威が必要となる。当業者であれば全
アミノ酸配列がインタクトなポリペブチドの配列決定に
よっては決定され得ないことを認識しよう。

タンパク分解断片の作成は、多くの周知方法のうちのい
ずれの方法によっても達戊することができる。好ましく
は、アンクロツド断片はポリペグチドを特定アミノ酸の
ところで分裂させる化合物で処理することにより作成さ
れることになる。これらの化合物′には、臭化シアン、
トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＡ
ｓｐ−ＮおよびエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃが包含さ
れるがそれらに限定されるものではない。

天然アンクロツド中に存するいかなる分子内結合、特に
ジスルフイド結合を分裂および配列決定に先立ち破壊し
ておく必要があることは当業者に明白であろう。分子内
タンパク質結合の破壊方法は当該技術分野において周知
である。

これらの方法は、典型的にはそのタンパク質を還元剤例
えばβ−メルカプトエタノールまたはジチオトレイトー
ルなどを用いて処理してジスルフイド結合を還元した後
、得られたスルフヒドリル部分をアルキル化することよ
り或る。アルキル化はジスルフイド結合の再形戊を防止
し、また標準的方法により行うことができる。

ポリペプチド断片の実際の配列決定は常法、例えばエド
マン分解またはカルボキシペグチダーゼＡ消化を行った
後アミノ酸分析することにより行うことができる。極め
て好ましくはポリペグチド配列決定はオンライン式アミ
ノ酸アナライザに接続された自動式タンパク質配列測定
装置で行われることになろう。共有結合的に結合した糖
残基を含むアミノ酸は前記方法によっては同定し得ない
ことに留意すべきである。これらのアミノ酸は好ましく
は質量分析法により分析される。

一旦アンクロツドの全アミノ酸配列が決定されれば、ポ
リペプチド主鎖の全部または一部をコードする合戊遺伝
子を設計することができる。

これらの合威遺伝子は特定の宿主での発現に適したもの
とすることもできる。これは、優先コドンを用いて各ア
ミノ酸をコードすることにより達成することができる（
Ｍ．　　Ｗａｔｓｏｎ，　　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒ
ｅｓ．．　１２．　ｐｐ．　５１４５〜６４　（１９８
４））。あるいはまた、アンクロツドのアミノ酸配列に
基づいてオリゴヌクレオチドグローブを設計し、次いで
蛇毒腺ｃＤＮＡライブラリの検索に用いてアンクロツド
ｃＤＮＡを単離することができる。

アンクロツド様ポリベプチドをコードする遺伝子の合或
は当業者に知られた標準的方法を用いて行われる。好ま
しくは、遺伝子は様々な部分のアンクロツドポリペプチ
ド配列をコードする小さな、センスおよびアンチーセン
ス合虞オリゴヌクレオチドの相補対から構築される。

これら相補対のオリゴヌクレオチドが正しくアセンブリ
を行うための３′または５′突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ
）を含んでいることが極めて好ましい。

オリゴヌクレオチドのアセンブリはまず相補オリゴヌク
レオチドを相互にアニーリングすることより或る。その
アニールされた相補対を次いで前記突出部を介して連結
してインタクトな遺伝子を形戊する。オリゴヌクレオチ
ド対の連結は一段階で、またはより好ましくは多段階で
行うことができる。アンクロツドポリペプチドのサイズ
のために、オリゴヌクレオチドの単一相補対として遺伝
子を合戊することは適切でない。

遺伝子コードの縮重の故に多くの異なる合戊ＤＮＡがア
ンクロツド様ポリペプチドをコードできることは当業者
の理解するところであろう。

更にこれらＤＮＡの多くがそれらで形質転換された様々
な宿主において忠実に発現されることも明らかであろう
。従って、本発明は、所望のアンクロツド様ポリペプチ
ドをコードしそしてそれらで形質転換された一以上の宿
主により発現され得る、一つのみならずすべてのＤＮＡ
分子に関する。これらその他のＤＮＡ配列は第４図に示
されたＤＮＡ配列にハイブリダイズするか、または第３
図または第４図に示されたＤＮＡ配列により発現時にコ
ードされるアンクロツド様ポリペプチドを発現時にコー
ドすることになろう。ハイブリダイゼーション条件の例
は、ｌｘｓｓｃ中４２℃でまずハイブリダイゼーション
を行った後、やや高目のストリンジエンシー（ｓｔｒｉ
ｎｇｅｎｃｙ）で、例えば０．１×〜ｌ　Ｘ　ＳＳＣ中
５８℃で洗浄するというものである。

本発明の合威アンクロツド遺伝子はアンクロツド様ポリ
ペプチドコード領域外に付加的ヌクレオチドを含んでい
てもよい。かかる付加的ヌクレオチドは、適切なベクタ
ー中への挿入を可能にし、また合威遺伝子で形質転換さ
れた宿主での発現を至適化する様々な構造的および機能
的特徴を表わすものであってよい。合或アングロツド遺
伝子を構威してもよい前記付加的ヌクレオチドは、５′
および３′制限エンドヌクレアーゼ部位、５′・インー
フレーム分泌シグナル配列、アンクロツド様ポリペプチ
ドが融合タンパク質として発現されるような５′または
３′・インーフレームペプチドまたはポリペプチド、３
’ＲＮＡポリメラーゼ停止配列、ポリアデニル化シグナ
ル、５′プロモータ配列、宿主特異的５′リポゾーム結
合配列（シャインーダルガーノ配列）およびインーフレ
ームーイニシエータメチオニンコドンを包含するがそれ
らに限定されるものではない。

あるいはまた、これら付加的ヌクレオチドのいずれかま
たはすべてがアンクロッド遺伝子を挿入し得る適当なベ
クターに存在していてもよシ１。

これらの特徴を含むベクターは当該技術分野において周
知である。

本発明の合戊アンクロツド遺伝子はアミノ末端メチオニ
ンを欠く戊熟ポリペプチドを欠くために、有用な翻訳開
始にはインーフレームイニシエータメチオニンコドンが
必要とされる。この特徴は、５′・イン−７レーム分泌
配列、５′イン−７レームペプチドまたはポリペプチド
、または５′・インーフレームＡＴＣにより付与スるこ
とができる。

５′・イン−フレームＡＴＧコドンは形質転換宿主にお
いてアンクロッド様ポリペプチドの直接翻訳を誘発する
こととなろう。当業者であればかかる遺伝子の発現生成
物がｍｅｔ−アンクａツドであろうことは分かるであろ
う。かかる生或物は標準的方法により修飾して余分のメ
チオニン残基を除くことができ、あるいはそれが有効な
生物活性を有しているならば直接使用することができる
。

メチオニンおよびそれに続く約２０個のアミノ酸をコー
ドする構造的特徴である、遺伝子の５′端のインーフレ
ームシグナル配列により開始が行われることにより、ア
ンクロツド様ポリベプチドを宿主から分泌させ得るター
ゲテイング機構が提供される．分泌が望ましいのは、細
胞媒体からよりも、本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転
換された宿主の増殖媒質から、またダラム陰性細菌宿主
の場合には細胞質周辺腟（ｐｅｒｉｐｌａｓ−ｎ＋ｉｃ
　ｓｐａｃｅ）からの方がアンクロツド様ポリペグチド
を容易に精製できるからである。またシグナル配列を用
いれば、最終発現生成物を修飾する必要はなくなる。何
故ならばシグナル配列は形質転換宿主により生体内（ｉ
ｎ　ｖｉｖｏ）で除去されるはずだからである。

ペプチドまたはポリペブチドをコードする５′・インー
フレームＤＮＡ配列により開始が行われると融合タンパ
ク質が発現されることとなる。

５′ペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡは
発現に用いる宿主と同種または異種であってよい。その
ＤＮＡは合戊アンクロッド様遺伝子を存在させるべきク
ローニングベクター中に既に存在していてもよく、ある
いは、合成アンクロツド様遺伝子の５′末端に連結して
からベクターに挿入してもよい。そのＤＮＡは天然給源
から得ることができ、あるいはより好ましくは標準的方
法により合戊することもできる。

５′ペプチドまたはポリペプチドのサイズはアミノ＃２
個乃至アミノ酸約ｔｏｏｏ個の範囲であってよい。極め
て好ましくは、そのペブチドまたはポリペプチドのサイ
ズはアミノ酸約２個乃至アミノ酸約１００個の範囲であ
ろう。５′−ペプチドまたはポリペプチドは、機能的イ
ニシェークメチオニンの存在を含む限り任意のアミノ酸
配列で構威されていてもよい。５′ベプチドまたはポリ
ペプチドのアミノ酸配列が融合タンパク質に望ましいま
たは望ましくないものであり得る様々な特徴を与えるこ
とができることは当業者の認識するところであろう。こ
れらの特徴には、宿主細胞内の様々な溶解度、および宿
主細胞分解系に対する様々な感受性が包含される。一旦
精製後は、発現融合タンパク質を当核技術分野において
周知の化学的および酵素的方法により修飾して５′ベプ
チドまたはポリペグチドをアンクロッド様ポリベプチド
から除去してもよい。

あるいは、融合タンパク質が有効な生物活性を有してい
ればそれを直接用いてもよい。

アンクロツド様ポリペグチドをコードするｃＤＮＡの単
離は当該技術分野において周知の方法により行うことが
できる。まず、蛇毒腺ｃＤＮＡライブラリを合威しなけ
ればならない。これは、蛇毒腺ｍＲＮＡを単離し、第一
および第二ＤＮＡｉｌ［を合或し、適切なリンカーまた
はアダプターをそれらｃＤＮＡ分子の末端に付加し、そ
して適切なベクターにそれらｃＤＮＡを挿入することよ
り成る。

これら方法はすべて、当業者により用いられる標準的手
順である。

一旦ｃＤＮＡライブラリが得られれば、ＣＤＮＡ配列を
含むクローンはそのライブラリをｌｉ［識オリゴヌクレ
オチドグローブでグローブすることにより同定される。

かかるグローブはアンクロッドボリペグチド配列に基づ
いて合成されることとなる。それらオリゴヌクレオチド
グローブの合成は、好ましくは自動式オリゴヌクレオチ
ド合皮装置を用いて行われることに．なる。オリゴヌク
レオチドプローブの選択が重複度の低いＤＮＡ配列によ
りコードされるアンクロツド分子の様様な部分からのア
ミノ酸鎖（ｓｔｒｅｔｃｈ）に基づいて行われることに
なることは当業者に明らかであろう。好ましくはオリゴ
ヌクレオチドグローブは次のものである： ５’　−　ＧＴＴＣＡＴＴＴＡＴＡＴＴＡＣＡＴＴＣＡ
丁ＣＡＣＣＴＣＣＡＡＴＧＡＣ−　３’および ５’−　ＣＣＧＴ（；ＡＣＡＣＡＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴ
ＧＴＧ−　３’。

前者のオリゴヌクレオチドはアンクロツドのアミノ酸１
−１２に基づいているのに対し後者の配列はアミノ酸１
４７〜１５２に基づいている。あるいはまた、前述の合
或アンクロツド様遺伝子をグローブとして用いてもよい
。

前記プローブは当業者に周知の多くの方法のうちのいず
れによって標識してもよい（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓなど
，Ａ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，
　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２））　ｏ
極めて好ましくは、標識は３！Ｐ末端標識により行われ
る。

標識オリゴヌクレオチドプロープによるｃＤＮＡの検索
は周知の方法を用いて行うことができる（Ｔ．　Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　ｓｕｐｒａ）。

一旦アンクロッドｃＤＮＡクローンが同定され単離され
れば、ｃＤＮＡインサートをベクターから取り出しそし
てそれが全アンクロッドポリペブチドコード配列を含ん
でいるかどうか分析することができる。そのインサート
が完全長ｃＤＮＡを含んでいない場合には、それ自体を
ｃＤＮＡライブラリを再グローブするのに、そして完全
長ｃＤＮＡを検索するのに用いることができる。また部
分的ｃＤＮＡは合戒オリゴヌクレオチドを付加すること
により完全長ｃＤＮＡに変えることもできるＣＤ．Ｇｏ
ｅｄｄｅ　ｌなど，“Ｄｉｒｅｃｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒ−ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｏ
ｆ　ａ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｃｏｄｉｎｇ　ｆ
ｏｒＨｕｍａｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　，　
Ｎａｔｕｒｅ，　２８１．　ｐｐ．５４４〜４８（１９
７９））。あるいはまた部分的ｃＤＮＡがアンクロツド
分子の生物活性部分をコードする場合には、それは本発
明の範囲に包含されまたそれはアンクロツド様ポリペプ
チドを発現する宿主の形質転換に直接用いることができ
る。

前記ｃＤＮＡ検索法は同じくアンクロツド遺伝子含有ゲ
ノムクローンの単離にも用いることができる。この場合
には蛇毒腺ゲノムＤ？ＪＡを単離し、制限酵素による適
当なサイズの断片に分断し、そして適当なベクターに挿
入してゲノムライブラリを創製する。かかる方法は当該
技術分野において周知である。次にそのゲノムライブラ
リをｃＤＮＡライブラリ検索に用いられるものと同じ方
法により検索することができる。

本発明のＤＮＡ配列および組換えＤＮＡ分子は広い範囲
にわたる様々なベクターに挿入できまたそれらを用いて
発現させることができる．例えば、有用なベクターは、
染色体、非染色体および合戊ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４
０の様々な既知の誘導体および既知の細曹プラスミド、
例えばｃｏＱＥ１ｓｐｃＲ１，　ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ
９およびＲＰ４を含む大腸１１（Ｅ．ｃｏｌｉ）よりの
プラスミド；７７ージＤＮＡ，例えばλファージの多く
の誘導体、例えばＮＭ９８９、および他のＤＮＡ　７ア
ージ、例えばＭｌ３および他の７イラメンタス（　Ｆｉ
ｌａｍｅｎｔｏｕｓ）一本鎖ＤＮＡファージ；酵母に有
用なベクター、例えば２μ講プラスミド；動物細胞に有
用なベクター、例えばＳＶ４０、アデノウイルスおよび
レトロウイルスー由来ＤＮＡ配列を含むもの：およびプ
ラスミドおよび７アージＤＮＡの組合せに由来するベク
ター、例えばファージＤＮＡまたはその他の誘導体を用
いるように修飾されたプラスミドより成っていてもよい
。

かかる発現ベクターは更に少くとも一つの発現コントロ
ール配列によって特徴付けられる。

該配列はベクターに挿入されたアンクロツド様ポリペフ
チドＤＮＡ配列に、そのクローン化されたＤＮＡ配列の
発現をコントロールし、そして調整するために作用的に
連結させることができる。

有用な発現コントロール配列としては例えばハ！系（例
えばｌａｃ　　ＵＶ５）、虹エ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系
、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領
域（ＰＬまたはＰ．）　、ｆｄコートタンパク質のコン
トロール領域、バクテリオファージＴ，プロモーター、
酵母の糖分解プロモーター、例えば３−ホスフオグリセ
レートキナーゼのプロモーター、酵母酸性ホスファター
ゼのプロモー夕、例えばＰｈｏ５、酵母接合因子（　ｙ
ｅａｓｔ−ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）のプロモーター
　ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルスおよび
シミアンウイルスに由来するプロモーター、例えばＳＶ
４０の初期（ｅａｒｌｙ）および後期（ｌａｔｅ）プロ
モーター、および原核または真核細胞およびそれらのウ
イルスまたはそれらの組合せの遺伝子の発現をコントロ
ールすることが知られているその他の配列などが挙げら
れる。好ましい発現コントロール配列はｔａｃ．　ｔｒ
ｐ，　ＬｒＣ％　ｌａｃＵＶ５、ＰイＰＩＩおよびＴ，
である。極めて好ましいのはＰＩｌｌである。

かかる有用な発現ベクターには、クローン化ポリペフチ
ドの真核宿主、例えば動物およびヒト細胞における発現
を可能にするベクターが含まれる〔例えばＰ．Ｊ．　Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎおよびＰ．　Ｂｅｒｇ，Ｊ．　Ｍｏｌ．
　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．，　ｌ．　ｐｐ．　３２７
〜４１（１９８２）；Ｓ．　Ｓｕｂｒａａ＋ａｎｉ　ｅ
ｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．．　ｌ
，　ｐｐ．８５４〜６４　（１９８１）；　Ｒ．　Ｊ．
　Ｋａｕｆｍ−ａｎｎおよびＰ．　　Ａ．　　Ｓｈａｒ
ｐ，　　“Ａｎ＋ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ＡｎｄＥｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｃｏｔ
ｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈＡ　Ｍｏｄｕｌａｒ　
Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ｃ
ｏｍｐｌｅｍ−ｅｎＬａｒｙ　ＤＮＡ　Ｇａｎｅ”，　
Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．＋　１５９＋　ｐｐ．？０
１〜２１　（１９８２）　；　Ｒ．　Ｊ．　Ｋａｕｆ＋
＋＋ａｎｎおよびＰ．　Ａ．Ｓｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．，　　１５９，　　ｐｐ−　　６０１
〜６４（１９８２）；Ｓ．Ｉ．Ｓｃａｈｉｌｌ　　ａｔ
　　ａｌ．，”ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎｄ　　Ｃｈａ
ｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ｐｆ　　Ｔｈｅ　　Ｐ
ｒｏｄｕｃｔ　　ｏｆ　　ＡＨｕｍａｎ　　Ｉｍｍｕｎ
ｅ　　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　　ＤＮＡ　　Ｇａｎａ　
　Ｉｎ　　Ｃｈｉｎｅ一ｓｅ　　ＨａｍｓＬｅｒ　　Ｏ
ｖａｒｙ　　Ｃｅｌｌｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０．ｐｐ．４６５４〜５９（
１９８３）；　　Ｇ．ＵｒｌａｕｂおよびＬ．　Ａ．　
Ｃｈａｓｉｎ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．
　Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７．ｐｐ．４２１６〜２０　　（
１９８０））．更に、各々特定の頻現ベクター内におい
て、アンクロツド様ポリペフチドをコードするＤＮＡ配
列を挿入するために様々な部位を選択することができる
。これらの部位は通常それらを切断する制限工冫ドヌク
レアーゼにより指定される．それらは当業者により十分
認識されている。もち■ろんのことであるが、本発明に
有用な発現ベクターが、選択されたＤＮＡ断片を挿入す
るための制限エンドヌクレアーゼ部位を有している必要
はない。その代わりに、ベクターをその断片に代替手段
により結合させることができる。

発現ベクター　および特に、その中で選択される、特定
ＤＮＡ断片挿入のための部位、およびその中で前記断片
の発現コントロール配列への作用的連結は、様々な要因
、例えば特定の制限酵素により影響を受け得る部位の数
、発現されるべきタンパク質のサイズ、宿主酵素による
タンパク質加水分解に対する目的タンパク質の感受性、
精製段階で除去の困難な宿主細胞タンパク質による、発
現すべきタンパク質の汚染および結合、発現特性、例え
ばベクター配列に対する開始および停止コドンの位置、
および当業者により認識されるその他の要因などによっ
て決定される。ベクターおよびあるＤＮＡ配列に対する
挿入部位の選択はこれらの要因のバランスによって決め
られるがすべての選択が特定のケースに常に等しく有効
であるとは限らない。

これらのベクターで形質転換でき、そして本発明のポリ
ペプチドの発現に用いることのできる有用な宿主には周
知の真核および原核宿主、例えば大腸菌株、例えば大腸
１１ＸＬ−１，大腸菌ＳＧ−９３６、大腸ＩＩＨＢ１０
１，大腸１１Ｗ３１１０、大腸ＩＩＸｌ７７６、大腸菌
Ｘ２２８２、大腸ＷＤＨＩ，　８ヨび大腸菌ＭＲＣＩ，
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ＋ｏｏｎａｓ）　、バチ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　、例えば枯草菌（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、酵母およびその他の真苗、動
物細胞、例えばＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞、ヒト細胞
、昆虫細胞および植物細胞の組織培養を含めることがで
きる。

もちろん、本発明のＤＮＡ配列の発現上、あるいはアン
クロツド様ポリペプチドの産生上すべての宿主／発現ベ
クター組合せが同効率で機能するとは限らないであろう
。しかしながら、宿主一発現ベクター組合せの選択は当
業者であれば本発明の範囲を逸脱することなく本明細書
に記載の原則をしかるべく考慮した後行うことができる
。例えば、選択は多くの要因のバランスをとるべきであ
る。これらには例えば宿主およびベクターのコンパチビ
リティ、ＤＮＡ配列によりコードされる夕冫パク質の宿
主に対する毒性、目的タンパク質回収の容易さ、ＤＮＡ
配列およびそれらに作用的に連結された発現コントロー
ル配列の発現特性、生物学的安定性（ｂｉｏｓａｆｅＬ
ｙ）、コスト、および目的タンパク質の７オールディン
グ（ｆｏｌｄｔｎｇ）　、形態、またはその他のあらゆ
る必要な発現後修飾などが含まれる。好ましい宿主は大
腸菌株である。極めて好ましいのはｐＫＫ２３３−２の
誘導体である。

本発明の完全長アンクロッド様ＤＮＡ配列の発現により
天然アンクロッドとは異なるポリペプチドが産生される
ことは当業者にとって明らかであろう。動物細胞以外の
すべての宿主において、この相違はグリコシル化を欠く
（細曹宿主の場合）または天然クロツドとはグリコシル
化を異にする（真曹および植物宿主の場合）ポリベプチ
ドの産生に帰するであろう．更に、動物細胞宿主におけ
る本発明のＤＮＡ配列の発現により、蛇に由来する異物
を欠き、従って天然アンクロッドとは異なるポリペプチ
ドが産生されることとなる。

アンクロツド様ボリペ７チドの発現の確認は、当該技術
分野において周知の多くのアツセイのうちのいずれによ
り行ってもよい。これらのアツセイは、アンクロツド特
異的な構造的決定因子または生物活性に基づかせること
ができる。

例えば前者の群のアツセイにはＥＬＩＳＡ，ウエスター
ンプロット、免疫沈降および免疫拡散法が挙げられる。

これらの方法はすべてインタクトなアンクロツドまたは
その断片に対して生或させたモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体を用いる。生物活性アツセイは直接（す
なわち酵素活性）または間接（すなわち誘導された化合
物のアツセイ）であってよい。直接アツセイには、エス
テラーゼ活性、またはフイブリノゲンからの７イブリノ
ペプチドの分裂を検出するものが含まれる。間接アツセ
イの例は、患者に対し発現生戊物を投与した後にｔＰＡ
合戒の生体内誘導またはウロキナーゼ合成の生体内誘導
を測定するものである〔例えば、Ｔ．　Ｓｏｓｚｃｋａ
　ｅｔａｌ．，”Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｆｉｂｒｉｎｏ
ｇｅｎ−Ｃｌｏｔｔｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅｓｏｎ　Ｓｅ
ｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｃ
ｔｉｖａｔｏｒｓｆｒｏｎ＋　Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　Ｈｕ
ｍａｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓｌｌ，Ｆ
ｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．　２．　ｐｐ．４９＝５７　
（１９８８）参照〕。

本発明のＤＮＡ配列および組換えＤＮＡ分子で形質転換
された宿主の発現生戊物は血栓症を予防または治療する
ための薬学的に有効な組戊物および方法に用いることが
できる。本発明の組戊物は存在する血餅の溶解、および
患者における新血餅の形或を防止するのに有用である。

好ましい一態様によれば、これらの組虞物は、大手術後
の深部静脈血栓症の防止、糸球体血栓に伴う糸球体ネフ
ローゼの治療、全身性エリテマトーデスに伴う急速な臓
器劣化および凝固性冗進状態ノ反転、心肺バイパスなど
の心臓外科手術の際の合併症を伴う凝血の防止、安定お
よび不安定虚血性心疾患症候群の治療、ウ゛ロキナーゼ
またはストレプトキナーゼの前投与に伴う再閉塞の防止
、および血栓溶解の助長および血栓性発作患者における
神経学的劣化の防止に特に有利である。

本発明の薬学的に許容し得る組戊物は薬学的に有効量の
アンクロツド様ポリペプチドより或る。かかる量は当該
組成物を投与すべき患者の体重ｌｋｇあたり約０．００
１〜約１０００単位である。

より好ましくは組成物は体重１　ｋｅあたり約０．０５
〜約２０単位より或る。

更に本発明の組或物は天然組織プラスミノゲンアクチペ
ータ、組換え組織プラスミノゲンアクチベータ、アニソ
イル化プラスミノゲンストレントキナーゼアクチベータ
コンプレックス（ＡＰＳＡＣ）　、ストレプトキナーゼ
、ウロキナーゼまたはそれらの組合せを含んでいてもよ
い。これらの組成物は不安定虚血性心疾患症候群、例え
ば不安定狭心症、冠動脈中間型症候群および急性心筋梗
塞などの治療に特に有効である。

これらの組威物は前記付加的戊分を、モノテラビ−（ｍ
ｏｎｏＬｈｅｒａｐｙ）に現在用いられている量に等し
いまたはそれより少い量で含有することになる。例えば
、本発明の組戊物において、ｔＰＡは好ましくは約０．
１〜５０１１９／　ｋｇ（患者体重）の用量範囲で用い
られ：ストレプトキナーゼは好ましくは約１．０００〜
１．ＯＯＯ．０００単位／ｈ９（体重）の用量範囲で用
いられｉ　ＡＳＰＡＣは好ましくは約０．０１−１０単
位／ｋ９（体重）の用量範囲で用いられ；そしてウロキ
ナーゼは好ましくは約１．０００〜１，０００，０００
単位／ｋｇ（体重）の用量範囲で用いられる。当業者で
あればｔＰＡ，ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ
をボーラス注射（ｂｏｌｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で患
者に投与し得ないことは分かるであろう。従ってこれら
特定の化合物を含む本発明の組成物はある時間かけて患
者に静脈内投与する必要がある。

本発明の薬学的に許容し得る組成物は好ましくは少くと
も一つの薬学的に許容し得る担体を含む。そのほかに更
に本発明の薬学的に許容し得る組戊物は、中性ｐｎの薬
学的に許容し得る緩衝剤、好ましくは燐酸緩衝食塩水を
、等張圧調整用の薬学的に許容し得る化合物例えば塩化
ナトリウム、マンニトールまたはソルビトールなどと共
に含んでいてもよい。

かかる組成物は経口、非経口および局所投与に適合化さ
れるが非経口投与用組戒物が好ましくまた静脈内投与用
組成物がより好ましい。局所投与用に処方される組成物
は、例えば水性ゼリー、油性懸濁液または乳化軟膏の剤
形であってよい。非経口投与に対しては、本発明の組成
物または組合せおよび滅菌ビヒクルを含む液状単位剤形
を調製することができる。薬学的に許容し得る組成物中
に含まれるポリペフチドは、使用ビヒクルの性質に応じ
て、懸濁または溶解（好ましくは溶解）することができ
る。非経口投与用組或物は、通常、ポリペプチドを所望
により他の戊分と共にビヒクル中に溶解しそして炉過滅
菌してから適当なバイアルやアンプルに充填しシールす
ることにより調製される。好ましくは、アジュバント例
えば局所麻酔剤、保存剤および緩衝剤などをビヒクルに
溶解することもできる。次いでその組戊物をその安定性
を高めるために凍結し凍結乾燥してもよい。

非経口懸濁液は、ポリペプチドをビヒクルに溶解するよ
りはむしろ懸濁すること以外は実質的に同様に調製され
る。有利には、ポリベプチドおよびすべての他の任意或
分の均質分布を容易にするために薬学的に許容し得る表
面活性剤または湿潤化剤がｍ成物に配合される。

経口投与用の錠剤およびカプセルは慣用の賦形剤、例え
ば結合剤、充填剤、希釈剤、錠剤化剤、潤滑剤、崩壊剤
、着色剤、香味剤および湿潤化剤などを含むことができ
る。錠剤は周知の方法でコーティングしてもよい。

使用に適した充填剤には、セルロース、マンニトール、
ラクトースおよび他の同様の剤が含まれる。適当な崩壊
剤にはスターチ、ポリビニルビロリドンおよびスターチ
誘導体例えばナトリウムスターチグリコーレートなどが
含まれるがそれらに限定されるものではない。適当な潤
滑剤には例えばステアリン酸マグネシウムが包含される
。有用で適切な湿潤剤にはラウリル硫酸ナトリウムが包
含される。

経口投与用液状製剤は水性または油性の懸濁液、溶液、
乳濁液、シロップまたはエリキシルの剤型であってよく
、あるいは使用に先立ち水またはその他の適当なビヒク
ルで再構戊するための乾燥製品の形をとってもよい。か
かる液状製剤は慣用の添加剤を含有していてもよい。こ
れらには懸濁剤、例えばソルビトール、シロップ、メチ
ルセルロース、ゼラチン、とドロキシエチルセルロース
、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニ
ウムゲルまたは水素添加食用脂肪；レシチン、ソルビタ
ンモノオレエートまたはアカシアを含む乳化剤；非水性
ビヒクル、例えばアーモンド油、分画ココナツ油および
油性エステル；および保存剤例えばメチルまたはプロピ
ルｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビンなどが包
含される。

他の一態様によれば、本発明の組換えアンクロンド様ポ
リベプチドは侵入型装置（　ｉｎｖａｓｉｖｅｄｅｖｉ
ｃｅ）表面を被覆しかかる装置を受入れる患者における
血餅形或の危険を低くするための組戊物および方法に用
いることができる。本発明の方法および組成物によりコ
ートされ得る表面の例としては、人工器官、人工弁、血
管移植片、ステントおよびカテーテルなどが挙げられる
。

侵入型デバイスの表面にこれら組或物を付着させる方法
は当該技術分野において知られている。

これらには、アンクロツド様ポリペプチド組戊物のこれ
らデバイス表面への化学的架橋まＩ；は物理的吸着が包
含される。

本発明の理解をより十分なものとするために以下実施例
を記す。これら実施例は例示目的にすぎないこと、そし
ていかなる方法をもってしても本発明を限定するものと
してはならないことを理解すべきである。

実施例　ｌ アンクロツドの精製 まず２２０ｍｇのアグキストロドン・ロドストーマの凍
結乾燥毒（医学研究級品質毒（ＱｕａｌｉｔｙＶｅｎｏ
ｍｓ　ｆｏｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、
ロット番号ＡＲ１５５２　；プンタゴルダ（Ｐｕｎｔａ
　Ｇｏｒｄａ）　、７　ｏリダ州）を３０ｎ＋Ｍ　Ｎａ
Ｃα含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ，　ｐＨ８．０（
ローデイング用緩衝液）に溶解することにより精製した
。その溶液を次いで、Ｃ．　　Ｎｏｌａｎ　ｅｔａｔ．
，　”Ａｎｃｒｏｄ，　Ｔｈｅ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｎ
ｇ　Ｅｎｚｙｍｅ　ｆｒｏｍＭａｌａｙａｎ　Ｐｉｔ　
Ｖｉｐｅｒ　（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｒｈｏｄｏｓ
ｔｏｍａ）Ｖｅｎｏｍ　，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏ＋．，　ＸＬＶ．　ｐｐ．２０５〜１３（１
９７６）に従って調製された８ｒｎＱのＡｇｍａＬｉｎ
ｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ力ラムにかけた。この樹脂はこ
れらの初期緩衝液条件下ではアングロツドを結合する。

そのカラムを室温で１６０ｍｌ２のローデイング用緩衝
液を用いて洗浄し、次いで１５０ｍＭ塩酸グアニジンを
含有する同じ緩衝液でアンクロツドを溶出した。画分（
４ｍＯのエステラーゼ活性測定は、１両分の４０μαを
ｌ　ｍＱの５ＱｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ２、ｐＨ８、ｌ
ＩＩＩＭペンゾイノレーアノレギニンエチノレエステル
（ＢＡＥＥ　；　Ｓｉｇｍａ，　Ｂ−４５００）と共に
室温でインキユベートシ、モして２５３ｎｍにおける吸
光度変化ヲモニターすることにより行った。０．０３８
０Ｄ２ｓｓ／分の変化はｌＩＬｇのアンクロツドに等し
い。

活性画分をプールしそしてそれらを、予め５０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣα、ｐＨ８、中で平衡させた５ｍｆｆのＤ
ＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅ　１カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）に直接かけた。

これらの条件下ではアンクロツドはこの陰イオン交換樹
脂に結合しなかった。流過両分の活性測定を前述の如く
行った。活性画分（全量８　ｍＱ）をプールし、次いで
ＹＭ−１０膜を装着したＡｍｉｃｏｎ限外枦過セル（八
ａ＋ｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ．，ダンノ《−ス（Ｄａｎ−ｖ
ｅｒｓ）　、マサチュセツツ州）を用いて脱塩した。

限外枦液をｌＯ＋＋Ｍ　Ｔｒｔｓ−ＨＣＱ、ｐＨ７．５
、を用いて８ｒｓＱに希釈し、次いでそれを７．５＋ｘ
ｍＸ７５ｉｍ　ＴＳＫＤＥＡＥ　５ＰＷ　ＨＰＬＣカラ
ム（　Ｂｅｃｋｍａｎｓ　バークレーカリフォルニア州
）にかけた。アンクロツドを１０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ（２，　ｐＨ７．５、中の直線ＮａＣ４勾配（０．０
〜ｌ．ＯＭ’）を用いて２０分間かけて溶出した。それ
ら画分の活性を前述の如く測定した。プールされた活性
画分（これは出発材料の１重量％以上に相当）の純度点
検は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動お
よびそれに続く銀染色により行った。更にアンクロツド
を逆相Ｂｒｏｗｎ　ｌｅｅＡｑｕａｐｏｒｅ　Ｐｈｅｎ
ｙｌカラム（　２．ＬＸ　１００ｍ１１　；　Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓＬｅｍｓ，　７オスターシティ（Ｆ
ｏｓｔｅｒ　ＣｉＬｙ）、カリフォルニア州）で０．１
％トリプルオロ酢酸中の直線アセトニトリル勾配（０〜
１００％）を用いて３０分間かけて溶出した。

実施例　２ アングロツドのタンパク質配列決定 逆相ＨＰＬＣ精製アンクロツドを６ＭグアニジンーＨＣ
Ｑ，ｌ　Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ２ＳｐＨ８．６、ｌｏ
ｍｌＪ　ＥＤＴＡおよび２ＯｍＭ　ＤＴＴ中（３７”（
）で１時間室温でインキユベートすることにより還元し
た。得られた還元アンクロツドを、４−ビニルビリジン
を５０ｍＭの最終濃度となるように添加しそしてその溶
液を室温で３０分間インキユベートすることによりアル
キル化した。そのアルキル化ポリペプチドを逆相Ｂｒｏ
ｗｎｌｅｅ　Ａｑｕａｐｏｒｅ　Ｐｈｅｎｙｌカラム（
２．ｌＸ１００旧；　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ）で０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の直
線アセトニトリル勾配（Ｏ〜１００％）を用いて３０分
間かけて脱塩した。

そのアルキル化アングロツドに対し、三つの異なるタイ
プの消化を行いタンパク質配列決定用の断片を創製した
。エンドグロテアーゼＡｓｐ−Ｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇａ
ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍｑインディアナポリス、インディ
アナ州）による消化は、０　．　１　Ｍ　　Ｔ　ｒ　ｉ
　ｓ　−ＨＣ（２，　ｐＨ８．５中、ｌ：ｌｏＯの酵素
−ポリペプチド比を用いて行った。その消化は室温で１
５時間進行させた。得られたタンパク質加水分解断片を
Ａｑｕａｐｏｒａ　ＰｈｅｎｙｌカラムでＯ．ｌ％ＴＦ
Ａ中の直線アセトニトリル勾配（０〜４０％）を用いて
６０分間かけて分離した。

エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ−Ｍａｎｎｈａｉｍ，インディアナポリス、インデ
ィアナ州）消化は、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１２，　
ｐＨ８．５中で１：１００の酵素一ポリペプチド比を用
いて行った。この消化は室温で４０時間行った。得られ
た断片をＨｙｐｅｒｓｉｌ　　ＯＤＳ　　ＨＰＬＣ力ラ
ム（２．ｌＸ１５０ｍｍ；ＨｅｗｌｅｔＬ　Ｐａｃｋａ
ｒｄ，アポンデール（　Ａｖｏｎｄａｌｅ）ｓペンシル
バニア州）で０．１％ＴＦＡ中の直線アセトニトリル勾
配（Ｏ〜６０％）を用いて９０分間かけて分離した。

インタクトなアルキル化アンクロツドのＣＮＢｒ分解は
、１２μ９のアンクロツドを２５μ９のＣＮＢｒを含有
するｌＯ％ＴＦＡ中でインキユベートすることにより行
った。サンプルを暗所中室温でＮ，雰囲気下に２３時間
インキユベートした。得られたべプチド混合物を凍結乾
燥しそして６Ｍグアニジン−〇〇〇に再溶解した．次に
そのＣＮＢｒ断片をＨｙｐｅｒｓｉｌ　ＯＤＳ　ＨＰＬ
Ｃカラムで０．ｌ％ＴＦＡ中の直線アセトニトリル勾配
（０〜８０％）を用い６０分間かけて分離した。

前記三つの消化物から得られた各ペプチドをＡｐｐｌｉ
ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　４７７Ａ液相配列決定装
置（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓＬｅｍｓ）を用いて
配列決定した。

フエニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸はＡｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　　１２０Ａ　　ＰＴ
Ｈ　Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてオンラインで同定された
。アミノ酸配列はグリコシル化アミノ酸残基を同定解明
する直列（ｔａｎｄｅｍ）質量分析法により確認された
。

アングロツドの前記ペプチド断片の配列決定によりポリ
ペプチドの全配列を次のとおり決定し　ｔこ　　： ＶＩＧＧＤＥＣＮＩＮ　　ＥＨＲＦＬＶＡＶＹＥ　　Ｇ
ＴＮＷＴＦＩＣＧＧ　　ＶＬＩＨＰＥＷＶＩＴＡＥＨＣ
ＡＲＲＲＭＮ　　ＬＶＦＧＭＨＲＨＳＥ　　ＫＦＤＤＥ
ＱＥＲＹＰ　　ＫＫＲＹＦＩＲＣＮＫＴＲＴＳＷＤＥＤ
ＩＭ　　ＬＩＲＬＮＫＰＶＮＮ　　ＳＥＨＩＡＰＬＳＬ
Ｐ　　ＳＮＰＰＩＶＧＳＤＣＲＶＭＧＷＧＳＩＮＲ　　
ＲＩＤＶＬＳＤＥＰＲ　　ＣＡＮＩＮＬＨＮＦＴ　　Ｍ
ＣＨＧＬＦＲＫＭＰＫＫＧＲＶＬＣＡＧＤ　　ＬＲＧＲ
ＲＤＳＣＮＳ　　ＤＳＧＧＰＬＩＣＮＥ　　ＥＬＨＧＩ
ＶＡＲＧＰＮＰＣＡＱＰＮＫＰＡ　　ＬＹＴＳＩＹＮＹ
ＲＤ　　ＷＶＮＮＶＩＡＧＮＡ　　ＴＣＳＰ　．前記ポ
リペプチド配列および特許請求の範囲において、アミノ
酸は次のとおりの標準一文字コードにより表わされる： Ｐｈｅ：Ｆ　　Ｌｅｕ：Ｌ　　ｌｉｅ：Ｉ　　Ｍｅｔ：
Ｍ　　Ｖａｌ：ＶＳｅｒ　：　Ｓ　　Ｐｒｏ　：　Ｐ　
　Ｔｈｒ　：　Ｔ　　Ａｌａ　：　Ａ　　Ｔｙｒ　：　
ＹＨｉｓ　：　Ｈ　　Ｇｌｎ　：　Ｑ　　Ａｓｎ　：　
Ｎ　　Ｌｙｓ　：　Ｋ　　Ａｓｐ　：　ＤＧｌｕ二ＥＣ
ｙｓ：ＣＴｒｐ：ＷＡｒｇ：ＲＧｌｙ：Ｇアミノ酸７８
、９９、１４８および２２９位のアスパラギン残基は推
測されるＮ−グリコシル化部位である。しかしながら、
これらの部位に結合される糖残基の厳密な性質および数
は決定されていない。

実施例　３ アンクロンド様ポリペプチドをコードする合成遺伝子の
構築 アンクロツドのアミノ酸配列が決定されたところで、大
腸曹で最適に発現するためのアンクロンド遺伝子を設計
し合威した。この遺伝子を構築するために、一連の３９
６のオリゴヌクレオチドを合成した（第ｌ図）。その合
成アンクロツド遺伝子には大腸曹の好むコドンを用い、
そしてコーティング領域の５′末端にインーフユーズ（
ｉｎ−ｐｈａｓｅ）　ＡＴＧを含めた。またその遺伝子
には３′および５′末端にＥｃｏＲ　Ｉ部位そして３′
末端に内部旧ｎｄｌｌｌを含めて、該遺伝子の適切な発
現ベクターへのクローン化を容易にした。

詳細には、遺伝子は次のとおり合威した：合或遺伝子の
各領域について、オリゴヌクレオチド（　ｌ　Ａ　−　
１９Ａ　；第ｌ図）およびそれにマッチする相補オリゴ
ヌクレオチド（ＩＢ−１９Ｂ．第１図）を別々に合成し
た。ＩＡ（４１塩基）、ｌ９Ａ（４３塩基）、ＩＢ（３
１塩基）および１９Ｂ　（５３塩基）を除いてすべての
オリゴヌクレオチドは４０塩基長とした。各オリゴヌク
レオチドセットは３０塩基長にわたってアニールしｌＯ
塩基がどちらの端部にも突出部を形戊するように設計し
た。

相補対オリゴヌクレオチドの各メンバーを合成し、その
相補体にアニールしそしてホスホリル化した。相補対オ
リゴヌクレオチドを次のようなグループに分けて連結し
た：ＩＡおよびＢ〜５ＡおよびＢ，６ＡおよびＢ〜ＩＯ
ＡおよびＢ１１１Ａ８よびＢ〜１４ＡおよびＢ，１５Ａ
およびＢ〜１９Ａ　８よびＢ．得られた断片を６％非変
性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にかけて分離し
精製した（Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　ｓｕｐｒａ）　
６そのゲル中の断片を臭化エチジウム染色後に紫外光下
に可視化した．前記断片を含むゲルスライスを外科用メ
スで取り出した。それらゲルスライスを各各！５ｒｔｒ
Ｑスナップ・キャップ・チューブに移しそして滅菌ガラ
ス棒で破砕した。ＤＮＡ断片は、その破砕したゲルをｌ
ａｇの０．５Ｍ酢酸アンモニウム中に絶えず撹拌しなが
ら室温で懸濁することにより溶出した。次いでアクリル
アミドを遠心分離により除去し、そして得られた溶液を
ガラスウールを詰めたパスツールピペットに通した。

枦液の容量を０．５Ｍ酢酸アンモニウムを添加すること
によりｌ　ｒｓＱにもどし、次いでＩＮブタノールで抽
出することにより容量を０．２＋（ｌまで濃縮した。Ｄ
ＮＡ断片を含む水性相を２回エタノール沈殿させ、そし
て最後に１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，　　ｌ　ｔａＭＥＤＴＡ
，　Ｉ）Ｈ８．ｌ　（ＴＥ緩衝液）に再懸濁した。

四つの個別に精製された断片を次に連結しそしてＥｃｏ
Ｒ　ＩおよびＰｓｔＩで消化した。（すべての制限酵素
はＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓまたはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ
ｂｓから購入した。すべての消化は製造元の指示に従っ
て行われた。）得られた７５４塩基対断片を前述の如く
非変性ポ？アクリルアミドゲルを用いて精製した。精製
した断片を次にＥｃｏＲ　Ｉ　／　Ｐｓｔ　Ｉ切断ｐＵ
ｃｌ８（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ゲイサースバーグ（Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）中に連結した。次に
その断片をｐＵｃｌ８を動■Ｒｌ消化により取り出しそ
してそれを低融点アガロース（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）での電気泳
動により精製した。精製した駐旦Ｒｌ断片を次いでＤＮ
Ａ配列決定のためにＥｃｏＲ　Ｉ消化Ｍｌ３ｍｐｌ９中
に連結した。この合或遺伝子の配列はジデオキシ鎖停止
式配列決定法により決定したＣＦ．Ｓａｎｇｅｒなど−
“ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｖｉＬｈ　Ｃｈａｉ
ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　ＩｎｈｉｂｉＬｏｒｓ”
，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　Ｕ
ＳＡ．　７４，　ｐｐ．５４６３　〜６７　（１９７７
））　．最終構築物の配列（第２図）は、３３０、３３
９、３４２および３４５位において予測された配列と相
違していたが、これらの塩基変化は縮重であり、コード
されたアミノ酸を変えるものではなかった。これらの変
異はサブクローニングの過程で生じたものと思われる。

実施例　４ アンクロツド様ＤＮＡ配列含有ｃＤＮＡクローン゜の単
離 アグキストロドン・ロドストーマからの毒腺（Ｖｅｎｔ
ｏｘｉｎ　Ｌａｂｓ，１ｎｃ．，ｙレデリック（Ｆｒｅ
ｄｅｒ　ｉｃｋ）メリーランド州）を液体窒素中で凍結
し、そしてドライアイス・エタノール洛中で冷却状態に
保たれた乳鉢に入れた。その腺を外科用メスで小片に分
断し、そしてポリＡ＋ＲＮＡを、その破砕された組織か
ら“Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　ｉｓｏｌａｔｉ
ｏｎｋｉｔ”　（　ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，サンジエゴ
、カリフォルニア州）を製造元の指示に従って用いて単
離した。

次いで“ｃＤＮＡ　ｋｉｔ”（Ｐｈａｒ＋ｓａｃｉａ％
ＬＫＢ　Ｂｉｏｔａｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ，　Ｉｎｃ．，
ビスキャツタウエイ（　Ｐｉｓｃａｔａｗ−ａｙ）、ニ
ュージャージー州）を製造元の指示どおりに用いて、卓
離されたｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合威した。Ｅｃ
ｏＲ　Ｉ末端を含むアリコートの最終ｃＤＮＡ調製物を
ＥｃｏＲ　Ｉ消化され脱ホスホリル化されたラムダｇｔ
ｌｌアーム（Ｐｒｏ■ｅｇａ　；マジソン、ウィスコン
シン州）に連結した。連結されたＤＮＡを、標準的方法
に従って調製されたラムダバツケージングエキストラク
トを用いてパツケージング処理した（Ｔ．　　Ｍａｎｉ
ａｔｉｓなど＊　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：
　　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏ
ｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ．　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２））　ｓ未増幅の
全ライブラリは約７．５Ｘ　１０″グラーク形或単位（
ｐｆｕ）から或るものであった。８　Ｘ　１０”ｐｆｕ
を１０ｍの１００ｉ＋ｍＬＢシャーレの各々にプレート
した。それらプラークを二つの異なる８２Ｐ一末端標識
オリゴヌクレオチドグローブにより標準的ラムダライブ
ラリ検索法を用いて検索した（Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ
　ｅｔ　ａｌ．，　ｓｕｐｒａ）　ｏそれら二つのグロ
ーブは実施例２の如く決定された天然アンクロツドのア
ミノ酸配列に基づいて設計された．アミノ酸１−１２を
コードするヌクレオチドの逆相補体である第一のプロー
ブは次のヌクレオチド配列から虞るものであった： ５’−ＧＴＴＣＡＴＴＴＡＴＡＴＴＡＣＡＴＴＣＡＴＣ
ＡＣＣ丁ＣＣＡＡＴＧＡＣ−３’第二のオリゴヌクレオ
チドグローブは、アミ７１１１４７〜１５４ヲコードす
るヌクレオチド配列の逆相補体である。そのヌクレオチ
ド配列は次のとおりであった： ５　’　−ＣＣＧＴＧＡＣＡＣＡＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴ
ＧＴＧ−３　’これらオリゴヌクレオチドプローブはい
ずれも重複度の最も少いコドンを含むアンクロツドのア
ミノ酸配列のストレッチを選択することによって選んだ
。第一のグローブは１個のアミノ酸を除いてアンクロツ
ドの最初のｌ２個のアミノ酸にマツチする異なる蛇毒ブ
ロテアーゼの公表されたアミノ末端アミノ酸配列（Ｎ．
　　Ｉｔｏｈなど．″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓｏ
ｆ　　ｃＤＮＡ　　ｆｏｒ　　Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ，
　　ａ　　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｌｉｋｅＳｎａｋｅ　　
Ｖｅｎｏｍ　　Ｅｎｚｙ＋ａｅ，”　　Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｗ．．２６２＋ｐｐ．　　３１３２〜３５　（１
９’８７））に基づかせた。マツチするアミノ酸に対し
ては同じコドンを選び、そして異なるアミノ酸に対する
コドンは、バトロキンビン（ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ）ｃ
ＤＮＡ配列の当誼アミノ酸に最も高頻度に用いられてい
るコドンに従って選択した。第二のプローブはパトロキ
ンビン遺伝子の各アミノ酸に対するコドン用法を比較し
、そして我々のプローブにおける各アミノ酸に対し最も
高頻度に用いられているコドンを用いることにより設計
された。

それらオリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ
−ｓｙｓｔｅ＋ｓｓ　３８１Ａ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　（Ａｐｐ−１ｉｅｄ　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）で製造元の指示に従って別途合戊し
た。それらオリゴヌクレオチドを標準的方法を用いて０
Ｐで標識した。

前記検索方法により、各々単離および制限酵素分析の際
に、約１．５キロ塩基対のＥｃｏＲ　Ｉインサートを含
むことが示された２つのクローンが確認された。これら
陽性クローンの各々からのインサートを次いでＭ　１３
＋＊ｐｌ８配列測定用ベクター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にサブク
ローン化した．ジデオキシ鋼停止法を用いて一つのイン
サートの全ヌクレオチド配列を決定した。得られたこの
ｃＤＮＡクローンの配列を第３図に示す。

合威遺伝子およびｃＤＮＡによりコードされる推定アミ
ノ酸配列を比較した結果アミノ酸５８および２１７に相
違が認められた。合成遺伝子はこれらの位置においてそ
れぞれヒスチジンおよびアスパラギンをコードした。ｃ
ＤＮＡは５８および２１７位においてそれぞれアミノ酸
リジンおよびアスパラギン酸をコードした．合成遺伝子
のエラーは天然アンクロツド分子のアミノ酸配列測定上
のエラーによるものであった可能性が極めて高い。

従って天然アンクロツドの正しいアミノ酸配列は次のと
おりである： ＶＩＧＧＤＥＣＮＩＮ　　ＥＨＲＦＬＶＡＶＹＥ　　Ｇ
ＴＮＷＴＦＩＣＧＧＶＬＩＨＰＥＷＶＩＴ　　ＡＥＨＣ
ＡＲＲＲＭＮ　　ＬＶＦＧＭＨＲＫＳＥＫＦＤＤＥＱＥ
ＲＹＰ　　ＫＫＲＹＦＩＲＣＮＫ　　ＴＲＴＳＷＤＥＤ
ＩＭＬＩＲＬＮＫＰＶＮＮ　　ＳＥＨＩＡＰＬＳＬＰ　
　ＳＮＰＰＩＶＧＳＤＣＲＶＭＧＷＧＳＩＮＲ　　ＲＩ
ＤＶＬＳＤＥＰＲ　　ＣＡＮＩＮＬＨＮＦＴＭＣＨＧＬ
ＦＲＫＭＰ　　ＫＫＧＲＶＬＣＡＧＤ　　ＬＲＧＲＲＤ
ＳＣＮＳＤＳＧ（１；ＰＬＩＣＮＥ　　ＥＬＨＧＩＶＡ
ＲＧＰ　　ＮＰＣＡＱＰＮＫＰＡＬＹＴＳＩＹＤＹＲＤ
　　ＷＶＮＮＶＩＡＧＮＡ　　ＴＣＳＰｃＤＮＡにより
コードされるものと同一のポリベプチドをコードする合
虞遺伝子を得るために、前記合成遺伝子のこれら２つの
コドンを部位指向性（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突
然変異誘発ニヨり変えた（Ｐ．　Ｃａｒｔｅｒなど，”
Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　０１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏＬｉｄｅＳ
ｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　
Ｕｓｉｎｇ　Ｍｌ３　Ｖｅｃｔ−（１９８５））。突然
変異誘発後の遺伝子の配列およびコードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列を第４図に示す。

実施例　５ アンクロツド様ポリベプチドの発現 実施例３における如く製造されそして実施例４における
如く部位指向性突然変異誘発により修飾された合虞アン
クロツド様遺伝子を発現させるために、発現ベクターｐ
ＩＰ４９５を構築した。

このベクターはプラスミドｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒ
＋＋＋ａｃ　ｉａＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，　　ビスキャタウエイ、ニュージャージー州）をＥｃ
ｏＲ　ＩおよびＨｉｎｄｎｌで消化してｔｒｃプロモー
ターカセットを取出すことにより構築した．第二のベク
ター、ｐＭＬＢ１０３４　（Ｃ．Ｑｕｅｅｎ，　”Ａ　
Ｖｅｃｔｏｒ　ｔｈａｔ　Ｕｓｅｓ　Ｐｈａｇｅ　Ｓｉ
ｇｎａｌｓｆｏｒ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ”，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ａ　　．　
Ｇｅｎｅｔ，　２＋ｐｐ．ｌ−１０）をＥｃｏＲ　Ｉお
よびＢａｗｌ　Ｉで消化してラムダＰ１プロモーターお
よびＰえプロモーターのｃｌ８５７温度センシテイプリ
プレツサーの両方を含む９６０塩基対断片を取出した。

次に、実施例３に記載の如く既にｐＬｉｃ１９に挿入さ
れた合虞アンクロツド遺伝子をＥｃｏＲ　Ｉおよび旧ｎ
ｄｌ［［で消化することにより取出した。この消化によ
りポリペプチドコーディング領域の５′末端の４２塩基
を除いてすべてを含む断片が得られた。

次に、欠失している４２塩基の代りに次のオリゴヌクレ
オチドリン力一を合威した： ５’　ＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＴＴＡＴＴＧＧＴＧＧ
ＴＧＡＴＧＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＡ３’　Ｇ
ＧＴＡＣＣＴＡＧＧＧＣＡＡＴＡＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡ
ＣＴＴＡＣＡＴＴＧＴＡＧＴＴＧＣＴＡＣＡＴＣＧＴＴ
Ｔ　　　　　　３’ ＴＧＴＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＣＣ　５’前述のオリゴヌ
クレオチドリンカーは戒熟アンクロツドのコーディング
配列を完結するための４２塩基のほかに更に９塩基対を
５′末端に提供する。これら付加的塩基対は、イニシエ
ーターであるメチオニンから始まる３個の付加的アミノ
酸をコードし、モしてＢａｍＨ　Ｉ認識部位を提供する
。そのリンカーを下記の４ウエイ（ｆｏｕｒ−ｗａｙ）
連結に用いる前にＢａｍＨ　Ｉで消化した。

前記４個のＤＮＡ断片、すなわちＥｃｏＲ　Ｉ　／■■
■消化ｐＫＫ２３２−２、む仝Ｒｌおよび塾ｍＨＩ末端
を有する９６０塩基対ＰＩｌｌプロモーター、ＥｃｏＲ
　ＩＩおよびＨｉｎｄｌｎ末端を有する合虞部分的アン
クロツド遺伝子、およびＢａｍＨ　ＩおよびＥｃｏＲ　
ＩＩ末端を含むＢａｍＨ　Ｉ消化オリゴヌクレオチドを
四片連結式に組立てた。得られたプラスミド、ｐＩＰ４
９５、の構築が適正であることは制限マツビングにより
確認されＩ二。

次に、大腸ＷＸＬ−１細胞（ＳＬｒａｔｏｇｅｎｅ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ，ラホヤ（Ｌａ　Ｊｏｌｌ
ａ）　、カリフォルニア州）を標準的方法によりｐｌＰ
４９５で形質転換した。

陽性形質転換体はウエスターンプロットアツセイにおい
て天然アンクロツドに対する抗体と陽性に反応する分子
量２７．０００のタンパク質を発現した。発現されたタ
ンパク質はフイブリノゲンからフイブリノペプチドＡを
分裂させる。

本発明による微生物および組換えＤＮＡ分子はＩｎ　Ｖ
ｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　　Ｉｎｃ．
　　カルチャーコレクション（リンチカム（　Ｌｉｎｔ
ｈｉｃｕｍ）、メリーランド州）に１９８９午４月２０
日に寄託されそしてＩＶＩ−１０２０３：　Ｅ．　ｃｏ
ｌｉ　ＸＬ−１　（ｐｌＰ４９５）として同定される培
餐物により例示される。

その培養物には前掲の受託番号が付与された。

以上、本発明の多くの態様を示したが、本発明の基本的
構或を変えて本発明の方法および物を用いる他の態様を
提供することができることは明らかである。従って、本
発明の範囲が、以上において例示として示されてきた特
定の態様よりはむしろ特許請求の範囲により限定される
ベきことが理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図はアンクロツド様ポリペプチドをコードする合或
遺伝子の構築に用いられる３８個のオリゴヌクレオチド
のヌクレオチド配列を示す。 第２図はアンクロツド様ポリペプチドをコードする合戊
遺伝子のヌクレオチド配列およびその構築に用いられる
オリゴヌクレオチドの位置を示す。 第３図はアングロツド様ポリペプチドをコードするｃＤ
ＮＡのヌクレオチド配列を示す。 第４図はアンクロツド様ポリペプチドをコードする合或
遺伝子のヌクレオチド配列を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）（ａ）▲数式、化学式、表等があります▼：（ｂ）
   約４２℃〜約５８℃の温度で約０．１×ＳＳＣ〜約１×
   ＳＳＣの溶液中、（ａ）のＤＮＡ配列に対しハイプリダ
   イズし、そしてアンクロッド様ポ リペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列；および （ｃ）以上（ａ）および（ｂ）のＤＮＡ配列のいずれか
   により発現がコードされたアンクロッド様 ポリペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列より成る群
   より選ばれるアンクロッド様ポリペプチドの発現をコー
   ドするＤＮＡ配列。 ２）ＤＮＡ配列が ▲数式、化学式、表等があります▼ である請求項１記載のＤＮＡ配列。 ３）請求項１または２記載のＤＮＡ配列より成る組換え
   ＤＮＡ分子。 ４）アンクロッド様ポリペプチドの発現をコードするＤ
   ＮＡ配列が発現コントロール配列に作用的に連結される
   請求項３記載の組換えＤＮＡ分子。 ５）発現コントロール配列がｔａｃ、ｔｒｐ、ｌａｃＵ
   Ｖ５、ｔｒｃ、Ｐ＿Ｌ、Ｐ＿ＲまたはＴ＿ｒより成る群
   より選ばれる請求項４記載の組換えＤＮＡ分子。 ６）誘導コントロール配列がＰ＿Ｒであり、組換えＤＮ
   Ａ分子がｐＩＰ　４９５である請求項５記載の組換えＤ
   ＮＡ分子。 ７）請求項３〜６のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子
   で形質転換された、細菌、酵母および他の真菌、昆虫細
   胞、植物細胞および動物細胞より成る群より選択される
   宿主。 ８）宿主が大腸菌種である請求項７記載の形質転換され
   た宿主。 ９）宿主が大腸菌株ＸＬ−１である請求項８記載の形質
   転換された宿主。 １０）請求項７〜９のいずれかに記載の宿主を培養する
   工程より成るアンクロッド様ポリペプチドの製造方法。 １１）ポリペプチドが本質的に蛇由来の異物を含まない
   請求項１０記載の方法により生産されるアンクロッド様
   ポリペプチド。 １２）アミノ酸配列： ▲数式、化学式、表等があります▼ より成る非グリコシル化アンクロッド様ポリペプチド。 １３）薬学的有効量の請求項１１または１２記載のアン
   クロツド様ポリペプチドより成る、患者の既存の血餅を
   溶解する、および新しい血餅形成を防止するための薬学
   的に許容し得る組成物。 １４）薬学的有効量の、天然組織プラスミノゲンアクチ
   ペータ、組換え組織プラスミノゲンアクチペータ、ＡＳ
   ＰＡＣ、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼより成
   る群より選ばれる化合物を更に含んで成る請求項１３記
   載の薬学的に許容し得る組成物。 １５）請求項１１または１２記載のアンクロッド様ポリ
   ペプチドより成る、患者に挿入されるべき侵入型装置の
   表面をコーティングするための組成物。 １６）患者に挿入されるべき侵入型装置の表面を該患者
   に挿入する前に請求項１５記載の組成物に接触させる工
   程より成る該表面のコーティング方法。