JP2669510B2 - ヒルジンのアミノ酸配列に基づくトロンビン阻害剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、トロンビン阻害剤として有用なペプチド誘
導体に関する。これらのペプチドは、アミノ酸45−65を
含むヒルジンのセグメントの配列に基づき、対応する本
来のペプチドフラグメントより最高1000倍強化された結
合を与える適した修正がなされている。本発明のペプチ
ドはトロンビン分子の２種類の結合部位に結合するの
で、「二官能基性」トロンビン阻害剤と呼ばれる。

発明の背景 トロンビンは血液凝固カスケードの重要なセリンプロ
テイナーゼ成分である。フィブリノゲンの切断により血
液凝固を開始する他に、トロンビンは第Ｖ、VIII及びXI
II因子を含む他の血液凝固因子及び血液凝固阻止酵素蛋
白質Ｃを活性化する。トロンビンは又、生体内の組織プ
ラスミノゲンアクチベーターにより媒介される血栓溶解
を減じる有力な血小板アクチベーターである。従ってト
ロンビンの正のフィードバック調節は止血を拡大する作
用をするが、血管及び脳血管動脈の変調に対応して生命
を脅かす血栓を引き起こす。

この酵素の多様な機能を考えると、有力で特異的な化
合物によるその阻害は血栓に関連する疾患の処置に非常
に貴重な付加を与えた。これらには冠動脈疾患、脳血管
障害、末梢動脈閉塞症、深部静脈血栓及び肺塞栓が含ま
れる。

トロンビンの最も有力な周知の阻害剤は、ひる、ヒル
ド メジシナリス（Hirudo Medicinalis）の腺分泌物か
ら単離したイソプロテインの群であるヒルジンである。
ヒルジンの血液凝固阻止性はずっと以前から周知であっ
た。しかし腸及び皮膚呼吸の両方が非常に低く、血流中
の蛋白質を適した量とすることができなかったため、有
効で投与可能な形態のこの蛋白質の調剤は困難であると
思われ、これまでその治療的価値はほとんどなかった。

さらにひるの抽出物から単離されたヒルジンの臨床的
利用は、その量が限られ、高価であり、通常ヒルジンの
大きさの異種蛋白質の投与によって起こるアレルギー反
応がある理由で好ましくない。

Markwardtは、彼の“Pharmacology of selective thr
ombin inhibitors",（1988）,Nouv.Rev.Fr.Hematol.,3
0,p161−165において、天然及び合成トロンビン阻害剤
の両方につき行った薬理学的研究の結果に基づくヒルジ
ンに関する別の臨床的情報を提示した。

著者はヒルジンに関する一般的観察を行い、高度に酸
性のＣ−末端部分を含むペプチドがα−トロンビンに非
常に特異的であることを述べている。その後彼は、ヒル
ジンのＣ−末端部分は酵素のアニオン性結合部位領域に
結合しやすいが、密集したＮ−末端部分は酵素の活性部
位領域と結合すると思われると結論している。

本来の脱スルホヒルジン_45-65は、牛及びヒトα−ト
ロンビンの両方によるフィブリノゲン凝固を投薬量依存
的に阻害することが見いだされた。牛α−トロビンの場
合の940±200nMというIC₅₀値は、同一フラグメントに関
して報告されている血漿フィブリン血餅形成の値と良く
一致し、血液凝固阻止活性に必要な最小コアであるとさ
れたヒルジン_55-65より３倍低い。同ペプチドが牛α−
トロンビンよりヒトα−トロンビンに対して終始一貫し
てより有力であることも示された。

種々の先行文献も、ヒルジンのアミノ酸配列の活性フ
ラグメントがアミノ酸45−65を含むアミノ酸配列である
と思われることを示した。従ってこの配列中に存在する
アミノ酸のいくつかを置換することによりペプチドの阻
害活性を強化する試みが成されてきた。

Krstenansky et al.は、“Antithrombin properties
of C−terminus of hirudin using syntheic unsulfate
d Nα−acetyl−hirudin",（1987）,Febs Letters,Vol.
211,No.1,p10−16中で、Ｃ−末端フラグメント脱硫酸化
Ｎα−アセチル−ヒルジン_45-65の合成につき記載して
いる。著者らは以前の研究（Chang,J.−V.,FEBS Letter
s,164,307（1983））に言及し、このフラグメントは２
つの特異的結合ドメインを含み、ひとつがトロンビンの
触媒部位に結合し、他方がトロンビン上の別の認識部位
に結合する可能性があると述べている。これは、両方の
著者により事実でないと結論された。

さらに著者らは、ヒルジンの45−65配列が凝固活性な
らびにトロンビンによるフィブリノペプチドＡの放出を
阻害する能力を有することを示した。彼らは、合成基質
に対するトロンビンのアミド分解性が混乱しないので、
ヒルジン_45-65の同一配列がトロンビンの触媒部位との
結合に直接含まれる必要はないことも示唆した。

Krstenansky et al.,“Anticoagulant peptides;natu
re of the interaction of the C−terminal region of
hirudine with a noncatalytic site on thrombinF,
（1987）,J.Med.Chem.,30,p1689−1691において、著者
らはトロンビンの非接触的結合部位における最小活性配
列がヒルジン_56-64であることを報告している。この仮
定に基づき著者らは、ヒルジン_56-64及びトロンビンの
非接触的接合部位の間の相互作用の性質を確立する目的
で、数種類のＣ−末端ヒルジン_54-65類似体の合成及び
トロンビン−誘発フィブリン血餅形成を阻害するそれら
の能力につき報告している。

結論として著者らは、ヒルジンのＣ−末端がこれまで
に文献により提案された領域ではないトロンビン上のフ
ィブリノゲン結合の領域に結合することができると述べ
ている。

Dodt et al.（Interaction of sitespecific hirudin
variants with α−thrombin,（1988）,Febs Letters,
Vol.229,No.1,p87−90）、Degryse et al.（Point muta
tions modifying the thrombin inhibition kinetics a
nd antithrombotic activity in vivo of recombinant
hirudin,（1989）,Protein Engineering,Vol.2,No.6,p4
59−465）及びBraun et al.（Use of site−directed m
utagenesis to investigate the basis for the specif
icity of hirudin,（1988）,Biochemistry,27,p6517−6
522）による文献において、著者らはヒルジン遺伝子に
行った特定部位の突然変異誘発の結果を報告している。

これらの文献で著者らは、蛋白質全体に行われ、ヒル
ジンの45−65セグメントに限定されない突然変異を研究
した。さらに45−65セグメント上に行った修正を単一の
修正、通常位置47に限定し、この残基が活性部位と相互
作用をしないことを示したが、これらの文献では位置5
1、57、58、61及び62における変異も示している。

同様にしてDudt et al.による文献“Distinctbinding
sites of Ala⁴⁸−Hirudin^1-47 and Ala⁴⁸−Hirudin
^48-65 on α−thrombinF,（1990）,The Journal of Bio
logical Chemistry,Vol.265,No.2,p713−718は、配列中
の位置48におけるヒルジンの特定部位の突然変異誘発を
行うことを目的とした実験につき記載している。この場
合Dodt et al.により行われた研究は、彼らの実験に必
要な蛋白質の加水分解を容易にするためにこの位置にお
いてプロリンをアラニンに置換することに制限されたよ
うである。

最後にMaraganore et al.,in“Anticoagulant activi
ty of synthetic hirudin peptidesF,（1989）,The Jou
rnal of Biological Chemistry,Vol.264,No.15,p8692−
8698、Dennis et al.,in“Use of fragments of hirudi
n to investigate thrombin−hirudin interaction",
（1980）,Eur.J.Biochem.188,p61−66及びChang et a
l.,in“The structural elements of hirudin which bi
nd to the fibrinogen recognition sites of thrombin
are exclusively located within its acidic C−term
inal tail",（1990）,Febs.,Vol.261,No.2,p287−290
は、その配列が本来のヒルジンの種々のフラグメントに
基づいている多数のペプチドの合成及び血液凝固阻止性
につき記載している。

血液凝固阻止性を有する化合物は有用な治療薬であ
り、種々の病的状態の処置に用いることができる。血液
凝固阻止剤による処置が有用である最も重要な状況の中
に心筋梗塞、肺塞栓及び脳血管障害、深部静脈血栓なら
びに他の血栓性疾患の兆候を上げることができる。

現在使用できる血液凝固阻止剤は多くの点で不満足で
ある。例えばヘパリンがトロンビンの活性の阻害に、従
って静脈血栓及び血栓塞栓症などの状況の処置に使用さ
れてきた。しかしヘパリンは多様な望ましくない副作用
を起こし、毒性の程度がより好ましい血液凝固阻止剤の
必要を示している。

トロンビンに対するフィブリノゲン又はヒルジンの結
合の仕方と類似して、触媒中心から離れた、又は結合し
た補助結合遺伝子座を用いたトロンビンの低分子量及び
特異的阻害剤の設計が蛋白質の化学における挑戦となっ
ている。おそらくそのような多官能基性阻害剤は、適し
たスペーサーで隔てられた２個又はそれ以上の認識素子
から成り、多重同時相互作用に有利で効力及び特異性が
強化されている。低分子量の構造中への「異種」化学素
子の挿入は、蛋白質加水分解に対する抵抗性及び好まし
い生物有効性を与える。

発明の概略 本発明に従い、適したリンカーにより結合した嵩高い
疎水性部分及び高度に酸性の部分の２つの部分から成る
トロンビン阻害剤を提供する。その最も広い特徴におい
て本発明は、次式（Ｉ） ［式中、 Ｘは疎水性基であり、 Ｂは疎水性アミノ酸の残基であり、 Ｄは低級アルキルにより置換されていることができる
炭素数が２−４の直線状炭素鎖であるか、あるいはＤは
ｐ−フェニルメチル又はｐ−フェニルエチル基であり、 Ｙはカルボニル、ＤもしくはＬ型立体配置のヒドロキ
シメチル又は−CH₂−であり、 Ｚは鎖長が少なくとも10原子である二価の直鎖状リン
カー部分であり、Ｙがカルボニル又はヒドロキシメチル
の場合Ｙの炭素原子に隣接する原子は非置換であるか、
又はモノ−もしくはジ−フルオロ−置換であることがで
き、Ｚは１個又はそれ以上のＯ、Ｓ、NH、カルボニル、
エステル又はアミド基により中断された炭素鎖から成る
ことができ、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキ
ル、アリール及びアラルキル基から選ばれる１個又はそ
れ以上の置換基により置換れさていることができ、それ
ら自身がアミド、ヒドロキシ、イミダゾール、カルボキ
シ又はハロゲン基により置換されていることができ、鎖
の末端原子はＬ−α−アミノ酸Ｇとペプチド結合を形成
するカルボニル基の一部である炭素原子であり、Ｇ及び
Ｇ′は同一又は異なり、pk値が約５又はそれ以下のＬ−
α−アミノ酸であり、 Ｘ′は疎水性Ｌ−α−アミノ酸であり、 ＱはＬ−α−アミノ酸又は環状Ｌ−イミノ酸の残基で
あり、 ＷはＨ、又は分枝鎖状もしくは直鎖状アルキル、アリ
ール又はアラルキル基であり、 Ｒは１−５個のアミノ酸から成る疎水性基、あるいは
カルボキシル又はアミド官能基により置換されているこ
とができるアルキル、アリール又はアラルキル基である
か、あるいは Ｒは であり、ここで ＣはＨ、OH、 であり、フェニル環のパラ位で置換しているか、又は Ｒ及びＲ′は同一又は異なり次式 のアミノ酸又はアミン基であり、 ここでR₂及びR₃はそれぞれ独立して水素、低級アルキ
ル、アリール又はアルコキシアルキルであるか、又は結
合して５−６員の環を形成することができ、その環は場
合によってＯ、Ｓ及びNHから選ばれた別の複素原子を含
んでいても良いか、あるいは Ｒ′はLeuに結合してカルボキシル基を形成するヒド
ロキシル基である］ により表されるペプチド誘導体又は治療的に許容しうる
その塩に関する。

我々は、本来のヒルジンの残基45−65を含むフラグメ
ントがトロンビン上の２つの独立し、離れた部位と同時
に相互作用することができ、その部位のひとつがアニオ
ンエクソサイトと思われる部位であり、他が蛋白質の加
水分解に対応する触媒部位であることを見いだした。こ
の結合様式は、現在Ｎ−末端の３個の残基を経てトロン
ビンの活性部位と相互作用することが示されている本来
のヒルジン分子の機構をまねているが異なるものであ
る。従って残基45,46及び47は、本来の蛋白質において
結合の役割を果していないが、Ｎ−末端コアが不在の場
合に弱くはあるが特別に正しく相互作用するようになっ
ていると思われる。

この観察に基づき我々は分子の両阻害成分が修正さ
れ、いずれかの部分のみの場合の程度を越えた抗−トロ
ンビン活性を示す新規ペプチドを合成した。さらに新規
に形成された分裂しやすい結合を化学的に修正すること
により、トロンビンに対して蛋白質加水分解的に安定で
あるという利点を有するより活性な化合物を与える。ペ
プチドは血液凝固阻止剤及び血小板凝固の阻害剤として
有用であり、それによって動脈血栓及び他の関連する心
臓循環器疾患の症状におけるリスクファクターを減少さ
せるのに有用である。

従ってＮ−アセチル−ヒルジン_45-65のＮ−末端触媒
部位を好ましくは少なくとも１個のＤ型立体配置のアミ
ノ酸を含む嵩高い疎水性部分を含むように修正し、非−
プロテオゲン性偽ジペプチド（non−proteogenic pseud
odipeptide）、好ましくはアルギニルグリシンのイソス
ター（isostere）を位置47−48に挿入し、少なくとも本
来のヒルジンのアミノ酸55−60の親水性をＮ−アセチル
−ヒルジン_45-65のＣ−末端非−触媒部分に保つことに
より、ヒルジン_45-65の血液凝固阻止性が実質的に強化
されることが見いだされた。

従って本発明の化合物は残基45−65から成るヒルジン
のカルボキシルドメインに対応するがそれにより制限さ
れないペプチドから成る。

本発明は又、血栓性疾患の症状の処置のための組成物
に関する。この組成物は、製薬学上許容しうるキャリヤ
ーと混合した有効量の式Ｉのペプチド誘導体を含む。血
栓に関連する血管障害の処置又は予防の方法も本発明の
範囲内である。方法は、製薬学上許容しうるキャリヤー
と混合した式Ｉのペプチド誘導体を含む有効量の組成物
の患者への投与を含む。

本発明は又、血栓溶解薬で処置した患者における再懽
流時間の短縮又は再閉塞時間の延長法に関する。方法
は、製薬学上許容しうるキャリヤーと混合した式Ｉのペ
プチド誘導体及び血栓溶解薬を含む有効量の組成物の患
者への投与を含む。

図面の説明 図１はペプチドP53、P79、P102、P103及びｒ−ヒルジ
ン（HV−２）に関する正常なヒトの血漿の活性化部分ト
ロンボプラスチン時間及びプロトロンビン時間阻害曲線
を示す。

図２はペプチドP79によるトロンビン−活性化血小板
凝固の阻害を示す。

図３は血漿中の種々のポリペプチドの安定性を示す。

図４はペプチドP79、P184及びP185に関する正常なヒ
トの血漿のプロトロンビン時間阻害曲線を示す。

以下の記載により、本発明をより容易に例示すること
ができるであろう。

発明の詳細な説明 簡単のために本発明のペプチド誘導体を後文では単に
ペプチドと呼ぶ。

「残基」という用語は、α−アミノ酸に適用された場
合、α−アミノ酸からカルボキシル基のヒドロキシル及
び１個の水素を除去することにより対応するα−アミノ
酸から誘導される基を意味する。

各残基を示すために本文で用いる略字は、IUPAC−IUB
Commission on Biochemical Nomenclature［Biochemis
try,11,1726−1732（1972）］の勧告に基づく。本文で
使用する「アミノ酸」という用語は天然に依存するアミ
ノ酸、ならびに化学合成及びペプチド化学の熟練者によ
り通常用いられる非天然の類似体を含む。非天然アミノ
酸のリストは、D.C.Roberts and F.Vellaccioによる“T
he Pepstides",Vol.5,1983,Academic Press,Chapter 6
に記載されている。

本出願で用いる「プロテオゲン性又は非−プロテオゲ
ン性α−アミノ酸」という用語は、ペプチド化学の熟練
者により通常用いられるアミノ酸を含むものとし、天然
に存在するα−アミノ酸が含まれるがこれらに限られる
わけではない。天然に存在するアミノ酸はグリシン（Gl
y）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Le
u）、イソロイシン（Ile）、セリン（Ser）、メチオニ
ン（Met）、トレオニン（Thr）、フェニルアラニン（Ph
e）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）、シス
テイン（Cys）、プロリン（Pro）、ヒスチジン（Hi
s）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、
アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、アルギニン
（Arg）、オルニチン（Orn）及びリシン（Lys）であ
る。

疎水性アミノ酸は通常α−炭素原子に結合したアルキ
ル又はアリール基を有する酸を意味する。従ってα−炭
素原子にそのような基が結合していないグリシンは疎水
性アミノ酸ではない。アルキル又はアリール基はアミノ
酸に疎水性を与える。置換基が酸の全体的疎水性を減ず
ることがなければ、アルキル又はアリール基は置換され
ていることができる。OH、COOH及びNH₂などの水−可溶
化性置換基は避けるのが好ましい。疎水性アミノ酸の例
には、アラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシ
ン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンなど
の天然のアミノ酸残基、及びD.C.Roberts and F.Vellac
cioによる“The Peptides".Vol.5,1983,Academic Pres
s,Chapter 6に記載されているような非天然のアミノ酸
が含まれる。例えばβ−（２−及び３−チエニル）アラ
ニン、β−（２−及び３−フラニル）アラニン、β−
（２−及び３−及び４−ピリジル）アラニン、シクロヘ
キシルアラニンならびにSubPheを挙げることができる。
SubPheは芳香環に置換基を有するフェニルアラニン残基
を示す。アミノ酸の化学における熟練者により用いられ
る通常の置換基は、2,3又は４位のハロゲン（フルオリ
ド、ブロミド、クロリド）、電子吸引性基（NO₂）又は
低級アルキルもしくはアリール置換基である。他に指示
がなければ本発明の範囲内で用いるアミノ酸はＬ−型立
体配置のアミノ酸であることを注意しなければならな
い。

本分で用いる「アルキル」という用語は好ましくは炭
素数が１−６のアルキル基を意味し、例えばメチル、エ
チル、プロピル、ブチルが含まれる。他に指示がある場
合を除いて、３個又はそれ以上の炭素原子を含むアルキ
ル基は分枝鎖状もしくは直鎖状であることができる。

従って本発明はトロンビン阻害剤として有用なペプチ
ドに関する。本発明のペプチドは次式により表されるペ
フチド又は治療的に許容しうるその塩であり、 式中、 Ｘは疎水性基であり、 Ｂは疎水性アミノ酸の残基であり、 Ｄは低級アルキルにより置換されていることができる
炭素数が２−４の直線状炭素鎖であるか、あるいはＤは
ｐ−フェニルメチル又はｐ−フェニルエチル基であり、 Ｙはカルボニル、ＤもしくはＬ型立体配置のヒドロキ
シメチル又は−CH₂−であり、 Ｚは鎖長が少なくとも10原子である二価の直鎖状リン
カー部分であり、Ｙがカルボニル又はヒドロキシメチル
の場合Ｙの炭素原子に隣接する原子は非置換であるか、
又はモノ−もしくはジ−フルオロ−置換であることがで
き、Ｚは１個又はそれ以上のＯ、Ｓ、NH、カルボニル、
エステル又はアミド基により中断された炭素鎖から成る
ことができ、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキ
ル、アリール及びアラルキル基から選ばれる１個又はそ
れ以上の置換基により置換れさていることができ、それ
ら自身がアミド、ヒドロキシ、イミダゾール、カルボキ
シ又はハロゲン基により置換されていることができ、鎖
の末端原子はＬ−α−アミノ酸Ｇとペプチド結合を形成
するカルボニル基の一部である炭素原子である。

ある具体化の場合Ｚは少なくとも部分的に、通常のペ
プチド結合により結合したα−アミノ酸から成り、本来
のヒルジンの酸49−54であることができ、 Ｇ及びＧ′は同一又は異なり、pk値が約５又はそれ以
下のＬ−α−アミノ酸であり、 Ｘ′は疎水性Ｌ−α−アミノ酸であり、 ＱはＬ−α−アミノ酸又は環状Ｌ−イミノ酸の残基で
あり、 ＷはＨ、又は分枝鎖状もしくは直鎖状アルキル、アリ
ール又はアラルキル基であり、 Ｒは１−５個のアミノ酸から成る疎水性基、あるいは
カルボキシル又はアミド官能基により置換されているこ
とができるアルキル、アリール又はアラルキル基である
か、あるいは Ｒは であり、ここで ＣはＨ、OH、 であり、フェニル環のパラ位で置換しており、 Ｒ′はLeuに結合してカルボキシル基を形成するヒド
ロキシル基であるか、又は Ｒ′はアミノ酸又は次式 を有するアミン基であり、 ここでR₂及びR₃はそれぞれ独立して水素、低級アルキ
ル、アリール又はアルコキシアルキルであるか、又は結
合して５−６員の環を形成することができ、その環は場
合によってＯ、Ｓ及びNHから選ばれた別の複素原子を含
んでいても良い。

ペプチドの好ましい群は、以下の式Ｉにより表され
る。

ＸはＤ−立体配置の疎水性α−アミノ酸である。酸Ｘ
はペプチド結合によりα−アミノ酸Ｂに結合している。
別の場合Ｘは酸Ｂのα−アミノ基の窒素原子に結合する
別の大きな疎水性基、例えばアリールスルホニル基であ
り、 ＢはＬ−型立体配置の疎水性α−アミノ酸又は環状イ
ミノ酸の残基であり、それは環に結合した１個又はそれ
以上のアルキル置換基を有することができ、その置換基
は環状構造を形成する架橋であることができ、Ｄはｐ−
フェニルメチル、ｐ−フェニルエチルエチレン、ブチレ
ン又はプロピレンである。

次式 の部分の重要な特徴は、その長さ及びその塩基性度であ
る。式Ｉの化合物の合成においてＬ−アルギニンを使用
した場合、Ｄが1,3−プロピレンである所望の立体化学
を有する式Ｉの化合物が得られるであろう。Ｌ−ホモア
ルギニンを使用した場合、Ｄが1,4−ブチレンである化
合物が得られるであろう。Ｌ−ノルアルギニンを使用す
ると、Ｄが1,2−エチレンである化合物が得られる。４
−グアニジル−Ｌ−フェニルアラニンを用いると、Ｄが
ｐ−フェニルメチル基である化合物を得る。４−グアニ
ジル−Ｌ−ホモフェニルアラニンを用いると、Ｄがｐ−
フェニルエチル基である化合物が得られる。

Ｙはカルボニルであり、 Ｚの鎖長は12−40、好ましくは20原子の範囲であり、 Ｇ及びＧ′はAsp、Glu、 であり、 ここでｎは１又は２であり、 Ｘ′はＬ−Phe、Ｌ−4FPhe又はＬ−4ClPheであり、 Ｑはプロリン、ピペコリン酸、サルコシン又はGluで
あり、 ＷはＨであるか、あるいはピペリジン又はピロリジン
環の3,4又は５位上の低級アルキル、アリール又はアラ
ルキル置換基であり、 Ｒは またはLeu−Ｒ′,wherein であり、ここで ＣはＨ、パラ位に置換された であり、 Ｒ′はヒドロキシル基又は であり、 ここでR₂及びR₃は炭素数が１−６の直鎖状もしくは分
枝鎖状アルキル鎖であり、結合して５−６員環を形成す
ることができる。

ペプチドのより好ましい群は、以下の式Ｉにより表さ
れる。

ＸはＤ−Phe、Ｄ−FPhe又はＤ−4ClPheであり、ここ
でα−アミノ基はアセチル化又はベンゾイル化により中
和されているか、あるいは Ｘはナフタレンスルホニル、ベンゼンスルホニル、ト
ルエンスルホニルであり、 ＢはVal、ピペコリン酸又はProであり、 Ｗは水素であるか、又はＢがProあるいはピペコリン
酸の場合環の3,4又は５位上の低級アルキル、アリール
もしくはアラルキル置換基であり、 Ｄはプロピレン又はフェニルメチルであり、 Ｙはカルボニルであり、 Ｚはｎが１−４の範囲の整数である次式 本来のヒルジン^48-54配列又は一般式 の合成スパナーであり、 ここで ｎは１−４の範囲の整数であり、 Ｌはヘキサペプチド、あるいはヘキサペプチドの18原
子又はそれ以下に対応する飽和もしくは不飽和アルキル
鎖である。

リンカーＺは次式であることが好ましく、 ここで ｎ及びｍは１−４の範囲整数であり、 A₁、A₂はそれぞれ独立してＨ又はシスもしくはトラン
ス立体配置のdesHであり、但しｍが１の場合ｎは３ある
いは４であり、 A₁、A₂がdesHの場合Ｚは であり、ここで ｎ及びｐは１−４の範囲の整数である。本発明の範囲
内で使用するリンカーは、式Ｉのペプチドがトロンビン
表面上で互いに決定的距離（約15Å）で離れている２種
類の独立した結合部位と相互作用するのに十分な長さを
有する必要がある。従ってＺは、単位を構成する原子の
累積数がヒルジン^49-54のアミノ酸配列に相当する原子
の数と等しいかそれ以下のリンカーであり、 ＲはGlu−Glu−Tyr−Leu−Gln−OH、Leu−OH又はGlu
−Glu−Tyr−Leu−Ｒ′であり、ここでＲ′はヒドロキ
シル基又は次式 を有する基であり、ここで R₂は−CH₃又はフェネチルであり、 R₃はＨ又は−CH₃であるか、あるいはR₂及びR₃が共に
結合して−CH₂−CH₂−CH₂−CH₂−、−CH₂−CH₂−CH₂−C
H₂−CH₂−CH₂−又は−CH₂−CH₂−Ｏ−CH₂−CH₂−を形成
することができる。

さらに好ましい式Ｉの化合物の群は、 ＸがＤ−Pheであり、 Ｂがプロリンであり、 Ｄがプロピレンであり、 Ｙがカルボニルであり、 ＧがAspであり、 Ｇ′がGluであり、 Ｘ′がPheであり、 ＱがGlu又はProであり、 Ｚが であり、 ＷがＨ、ｎ−ブチル又はメチルであり、 ＲがGlu−Glu−Tyr−Leu−Gln−OH又は−Leu−OHであ
る化合物の群である。

比較的短鎖のペプチド、例えば本来のヒルジンのアミ
ノ酸Glu⁶¹、Glu⁶²、Tyr⁶³及びGln⁶⁵の欠如した「不完
全」（truncated）ペプチドが興味深い生物学的性質を
示すことが見いだされた。短鎖の分子は免疫反応を起こ
しにくく、蛋白質加水分解しにくいので、「不完全」ペ
プチドはより優れた生物有効性を示す。又、低分子量の
短鎖ペプチドの投与は容易であり、通常長鎖ペプチドよ
り吸収が良い。合成リンカーの使用が蛋白質加水分解に
よるペプチドの分解をさらに防ぐことにも注意しなけれ
ばならない。

本発明のペプチド誘導体の合成 本発明のペプチドは、同業者に公知の多数の方法を用
いて合成することができる。例えば“Solid phase pept
ide synthesis",Freeman ＆ Co.,San Francisco,1969に
おいてStewart et al.により記載された固相法により、
適したペプチド合成機上でペプチドを合成することがで
きる。

しかしある場合には、本発明のペプチドの領域
（ｉ）、（ii）又は（iii）は合成部分であることがで
き、その場合には従来の固相合成によりこの部分を他の
アミノ酸と結合して所望のペプチドを得る前に、化学合
成が必要である。明細書中の実施例１−６は、領域
（ｉ）の好ましい具体化のひとつを合成するのに必要な
種類の化学合成を示し、実施例７は領域（iii）で使用
する合成リンカーの合成を記述している。同業者には、
熟練した有機化学者が本発明のペプチドの領域（ｉ）、
（ii）及び（iii）に必要な化学的部分を容易に製造す
ることができることがわかるであろう。

本発明のペプチドのいくつかは、Applied Biosystems
430Aペプチド合成機上で特別に合成した。固相担体と
してBOC−GlnPAM樹脂（Applied Biosystems;0.64ミリモ
ル／グラム）を用いた。アミノ酸カップリングは、ジシ
クロヘキシルカーボジイミド/N−ヒドロキシベンゾール
トリアゾールにより媒介し、脱プロトン化は、メチレン
クロリド中の50％三フッ化酢酸（TFA）を用いて３分
間、及び続いて追加の30分サイクルで行った。側鎖保護
基は以下である:Asp（Chx）、Glu（Bzl）、His（Bo
m）、Arg（Tos）、Tyr（２−BrZ）、Ser（Bzl）。十分
に保護したペプチド樹脂をその後−５℃にてアニソール
及びジメチルスルフィド（10体積％）を含む液体フッ化
水素で60分間処理した。窒素流下で過剰のHFを除去し、
残留固体をエーテルで抽出し、濾過した。樹脂を氷酢酸
及び水で３回抽出し、凍結乾燥した。

合成ペプチドの精製及び分析 得られた凍結乾燥粗ペプチドを、一般に受け入れられ
ているペプチド精製法を用いて精製し、均質にすること
ができる。適した方法のひとつは、溶媒系Ａ、500ml500
mlの0.1％TFA/H₂O及びＢ、1Lの60％アセトニトリル/0.1
％のTFAを含むH₂Oの直線状勾配を用いた、Vydacオクタ
デシルシリカガラスカラム（15Å,1.5X30cm,40psi）上
の逆相クロマトグラフィーである。留分をVydac C₁₈分
析カラム及び215nm検出を用いたVarian LC上の逆相HPLC
により分析する。純度99％以上に相当する留分をプール
し、凍結乾燥することができる。ペプチド含有率は、Be
ckmanのモデル6300アミノ酸分析器上のアミノ酸分析に
より決定する。その後試料をWaters Pico−Tag Work St
ation中で乾燥する。１％のフェノールを含み、一定に
沸騰するHCl（200μｌ）をバイアルに加え、（乾燥窒素
を用いて）交互にパージし、３回のパージの後排気し
た。最後に試料を含むバイアルを真空下で150℃に１時
間加熱する。イオン噴射源をそなえたSCIEX API IIIス
ペクトロメータ上で質量スペクトル分析を行った。

このようにして、本発明の範囲内で合成したペプチド
の構造及び配列を、正しいアミノ酸組成及び分子量の計
算値との一致を示すための質量スペクトルにより確認す
ることができる。

本発明をさらに例示するために以下の実施例を示す
が、本発明の範囲を制限するものではない。

実施例中で用いる略字にはBOC:tert−ブトキシカルボ
ニル;Tos:p−トルエンスルホニル;CH₂Cl₂:メチレンクロ
リド;TEA:トリエチルアミン;BOP:ベンゾトリアゾリル
Ｎ−オキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフ
ルオロホスフェート;DMF:ジメチルホルムアミド;EtOAc:
酢酸エチル:DCC:N,N′−ジシクロヘキシルカーボジイミ
ド;DPPA:ジフェニル−ホスホリルアジド;THF:テトラヒ
ドロフラン;HF:フッ化水素;CBZ:ベンジルオキシカルボ
ニルが含まれる。

実施例１ （2S）−２−（BOC）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−５
−トシルグアナジノペンタナミドの合成 氷浴中０℃にて、TEA（0.4ml、３ミリモル）及びN,O
−ジメチルヒドロキシアミンヒドロクロリド（146mg,1.
5ミリモル）を含む30mlのDMF中のＮα−BOC−N^G−トシ
ルアルギニン（428mg,1ミリモル）の溶液に、BOP試薬
（500mg,1.1ミリモル）を加えた（B.Castro,J.R.Dormo
y,G.Elvin,C.Selve,Tetrahedron Letters ＃14,pp.121
9−1222,1975）。反応混合物を４℃にて15時間撹拌し、
その後溶媒を高真空下で蒸発させた。残留物を50mlのEt
OAc中に溶解し、H₂Oで洗浄した。有機相をさらに５％Na
HCO₃（３回）、1NのHCl（３回）で抽出し、Na₂SO₄上で
乾燥した。溶媒をセライト上で濾過し、真空中で濃縮し
た。濃縮液に少量のヘキサンを加えると標題化合物に相
当する白色固体（500mg）が沈澱した。質量スペクトル
分析:M/Z＝472（Ｍ＋Ｈ）^＋ 実施例２ ６−BOC−９−トシルグアニジノ−１−ノネン−５−オ
ンの合成 25mlのTHF中の実施例１からの生成物（600g、1.3ミリ
モル）の溶液に、４−ブロモ−１−ブテンから調製した
10当量のグリニヤル試薬（調製時の注意:50mlの無水エ
ーテル中の312mgのマグネシウムリボン（13ミリモル）
に1.75gの４−ブロモ−１ブテンを滴下し、穏やかな還
流を保つ）を加え、金属が全部消費された後、アルゴン
下でシリンジによりグリニヤル溶液をTHF混合物に移し
た。TLCにより出発材料の消失が示された後、THF混合物
全体をNH₄Cl水溶液でクエンチした（TLCは、Kieselgel
60F 254,Merck,ガラス板上で行った）。相を分離し、有
機相をさらに1NのHCl及びH₂Oで洗浄し、乾燥し（NA₂S
O₄）、真空下で蒸発させた。シリカゲル上のクロマトグ
ラフィー（4:1EtOAc/ヘキサンを用いて溶離）により、
標題化合物に相当する透明の油を得た。質量スペクトル
分析M/Z＝469（Ｍ＋Ｈ）^＋ 実施例３ ５−BOC−４−オキソ−８−トシルグアニジノオクタン
酸の合成 実施例２からの生成物（2.5g、5.3ミリモル）を50ml
のアセトニトリルに溶解し、その後50mlの水に溶解した
過ヨウ素酸ナトリウム（8g、37.5ミリモル）を加えた。
混合物全体を100mgの塩化ルテニウムで処理した。室温
で１時間激しく撹拌した後、TLCにより出発材料は観察
されなかった。混合物を100mlのH₂O及び100mlのエーテ
ルで希釈した。相を分離し、水相をさらにエーテルで抽
出した。合わせた有機抽出物をH₂Oで洗浄し、乾燥し（N
A₂SO₄）、蒸発乾固して1.5gの標題化合物に相当する泡
を得た。M/Z＝485（Ｍ＋Ｈ）^＋ 実施例４ ６−BOC−５−オキソ−９−トシルグルアニジノノナン
酸の合成 実施例１−３に類似の方法でこの実施例の標題化合物
を合成した。簡単に言うと、実施例１からの生成物をマ
グネシウム及び５−ブロモ−１−ペンテンから調製した
グリニヤル試薬で処理した。実施例３と類似の油として
単離した得られた付加物をその後、過ヨウ素酸ナトリウ
ム及び塩化ルテニウムの組み合わせで処理し、この実施
例の標題類似体を得た。M/Z＝499（Ｍ＋Ｈ）^＋。

実施例５ ７−BOC−６−オキソ−10−トシルグアニジノデカン酸
の合成 この実施例の標題化合物を実施例１−４に類似の方法
で製造した。この実施例の場合、実施例１からの生成物
をマグネシウム及び６−ブロモ−１−ヘキセンから調製
したグリニヤル試薬で処理した。付加物を実施例２に記
載の通りシリカゲルクロマトグラフィーにより単離した
後、付加物を過ヨウ素酸ナトリウム及び塩化ルテニウム
と反応させた。生成物を単離し、標題化合物を油として
得た。M/Z＝513（Ｍ＋Ｈ）^＋。

実施例６ 4N−ｔ−BOC−３−オキソ−７−トシルグアニジンチオ
ヘプタン酸エチル（混合無水物法） 混合無水物の形成:15mlの無水テトラヒドロフラン中
の1g（2.4ミリモル）の（Ｌ）−Ｎα−BOC−Arg（N^W）T
OS）OH及び0.66ml（0.48ミリモル）のトリエチルアミン
の溶液に−20℃にて0.40ml（0.3ミリモル）のイソブチ
ルクロロホルメートを15分かけて滴下した。１時間後、
混合物を15mlのエーテルで希釈し、沈澱した固体を濾過
した。混合無水物を含む濾液を０℃で保存した。

一方で25mlの無水エーテル中のジイソプロピルアミン
（3.4ml、24ミリモル）の撹拌溶液に、アルゴン下０℃
にてTHF中の１当量のＮ−But Liを30分で滴下した。そ
の後反応混合物を−60℃に冷却し、2.5mlのエチルチオ
アセテートで処理した。−60℃で30分間撹拌した後、混
合物を6gのMgBr₂エーテレートで処理し、さらに30分撹
拌した。最後にこの混合物を予備形成した混合無水物で
処理し、HPLCにより反応が完了するまで５時間撹拌を続
けた。

反応混合物に6MのNH₄Clを滴下し、相を分離した。有
機相を50mlのEtOAcで希釈し、1NのHCl（3x）、H₂O（3
x）で抽出し、Na₂SO₄で乾燥し、高真空下で蒸発させ、
標題化合物を油状で得た。M/Z＝515（Ｍ＋Ｈ）^＋ 実施例７ 実施例６からのチオエステルの、α−アミノ酸エステ
ル及び脱保護アミノアシルポリスチレン樹脂へのカップ
リング 実施例６からの保護アルギニル生成物（２当量）をCH
₂Cl₂に溶解し、α−アミノ酸エステル（１当量）又は成
長しつつあるポリペプチドを含むポリスチレン樹脂の混
合物に加えた。この混合物にヨウ化第１銅（２当量）及
びトリエチルアミン（２当量）を加えた。反応を、アミ
ノ酸エステルの場合にはHPLCにより、又はポリスチレン
結合ペプチドの場合には従来のニンヒドリン試薬により
監視する。

実施例８ 次式を有するペプチドの合成 実施例３からのアミノ酸（200mg、0.4ミリモル）を10
mlのEtOAcに溶解し、ジアゾメタンのエーテル性溶液で
気体の発生が止むまで処理した。このようにして生成し
たメチルエステルを蒸発により単離し、０℃にて10mlの
50％TFA/CH₂Cl₂で１時間処理した。溶媒を高真空下で蒸
発させ、200mgの粘性の油を得、これは結晶化しにく
く、直接使用した。得られた油（200mg、0.33ミリモ
ル）を氷浴中で冷却した20mlのDMFにて溶解し、158mg
（0.4ミリモル）のCbz−（Ｄ）−Phe−Pro−OH、0.14ml
（１ミリモル）のTEA及び110mg（0.4ミリモル）のDPPA
で処理した。溶液全体を４℃にて15時間放置し、高真空
下で蒸発させた。残留物を水及びEtOAcに分配し、相を
分離した。有機相をさらに実施例３に記載のように処理
し、溶媒の蒸発後、残留物を得、それをシリカゲルクロ
マトグラフィー（150mg）により精製した。

ペプチドを０℃にて液体フッ化水素で１時間処理する
ことにより保護基を除去した。過剰のHFの蒸発に続き残
留物を50mlの10％AcOHに溶解し、エーテルで抽出した
（３回）。水相を凍結乾燥し、この実施例の標題化合物
に相当する粉末を得た。M/Z＝489.2（Ｍ＋Ｈ）^＋ 実施例９ 式IIの合成スペーサーのサブユニットの製造 合成は、（Cox M.T.,Heston D.W.and Horbury J.,J.C
hem.Soc.Chem.Comm.,1980,799−800）をモデルとし、大
きな修正をして行った。完全な方法を下記に概述する。

ａ）トランス−β−ヒドロムコン酸ジメチルエステルの
合成 22g（153ミリモル）のトランス−β−ヒドロムコン酸
を、500mgのｐ−トルエンスルホン酸及び100mlのメタノ
ールを含む200mlのベンゼンに溶解した。溶液を６時間
還流下に保ち、100mlの水で処理した。相を分離し、有
機相をさらに５％NaHCO₃及びH₂Oで抽出した。乾燥（Na₂
SO₄）後、溶媒を真空下で蒸発させ、残留物を蒸留し（8
3−85℃）0.5mmHg）、19gの標題化合物を得た。

ｂ）トランス−β−ヒドロムコン酸モノメチルエステル
の合成 5g（27.5ミリモル）の段階ａ）からの生成物を、100m
lの0.1M KH₂PO₄の溶液中に懸濁し、続いて20mgの豚肝臓
エステラーゼを加えた。1MのNaOHの溶液を滴下すること
により溶液のpHを７に保った。ジエステルの１モル当量
に相当する1M NaOHの添加の後、溶液を木炭で処理し、
５分間撹拌し、セライト上で濾過した。濾液をエーテル
で抽出し、合わせた有機抽出物を捨てた。3NのHClを用
いて水相を酸性とし、エーテルで再抽出した。合わせた
エーテル性抽出物を乾燥し（Na₂SO₄）真空中で蒸発させ
た。残留物を減圧下で蒸留し（105−110℃、0.5mmH
g）、4gの標題化合物に相当する油が残った。

ｃ）４−メトキシカルボニル−２−デヒドロブチルイソ
シアナートの合成 1.22g（7.3ミリモル）の段階ｂ）からのモノエステル
を25mlのベンゼンに溶解した。0.76ml（8.7ミリモル）
のオキザリルクロリドを15分で滴下し、溶液を３時間激
しく撹拌した。溶液を真空下で蒸発させた。10mlのアセ
トンに溶解した残留物を20mlの50％水／アセトン中の1g
のナトリウムアジドの予備冷却溶液（０℃）に加えた。
30分後混合物を水（50ml）で希釈し、20mlづつのベンゼ
ンで３回抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥し（Na₂S
O₄）、濾過した。濾液を油浴中で、窒素の発生が観察さ
れなくなるまで80℃に加熱した。溶媒を真空下で蒸発さ
せ、残留物を減圧下（80−85℃、0.5mmHg）で蒸留し、7
00mgの標題化合物を得た。

ｄ）４−Ｎ−ブチルオキシカルボニル−３−ペンテン酸
の合成 890mg（12.2ミリモル）のtert−ブタノールを、25ml
のベンゼン中に段階ｃ）からの生成物（1g、6.1ミリモ
ル）を含む溶液に加えた。溶液全体を10時間還流し、そ
の後真空下で蒸発させた。残留物を段階ｂ）に記載の通
りに豚肝臓エステラーゼで処理し、その段階に記載の通
りに仕上げ、700mgの標題化合物を得た。

その後段階ｄ）からの生成物を合成スペーサーIIの製
造の単位として用いる。同業者に公知の方法を用いてこ
れらの単位を組み立て、スペーサーIIを形成する。

実施例10 種々のペプチドの合成 下表Ｉに示すペプチドP24、P51、P53、P73、P52及びP
54を、「ペプチドの合成」の題で前に記載した標準的方
法を用いて合成した。式Ｉにおいて、 ＸがＤ−Pheであり、Ｚが であり、Ｄがプロピルであり、Ｙが−COであり、ＷがＨ
であり、Ｒが−Glu−Gly−Tyr−Leu−Gln−OHである合
成ペプチドに相当するペプチドP79も、最初に実施例３
に記載のように５−BOC−４−オキソ−８−トシルグア
ニジノオクタン酸を化学的に合成し、その後「ペプチド
の合成」の題で記載の方法を用いた適したペプチド組み
立てを行うことにより製造した。

実施例11 1gのtert−ブチルオキシカルボニル−Glnフェニルア
セトアミドメチル樹脂（Applied Biosystems;0.64ミリ
モル/g）を用いて、ｎα−側鎖脱保護（CH₂Cl₂中50％TF
A）及び2.5ミリ当量の保護アミノ酸/DCC及びＮ−ヒドロ
キシベンゾトリアゾールを用いたカップリングを含む合
成を16サイクル行った。標準的アミノ酸の側鎖保護基
は、以下のものであった:Asp（シクロヘキシル）、Glu
（ベンジル）、His（ベンジルオキシメチル）、Tyr（ブ
ロモベンジル）、Ser（ベンジル）。

実施例３からの合成保護アミノ酸を、やはりDCC/N−
ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いてGln⁴⁹にカップ
リングさせた。最適の結果を得るために、個別のアミノ
酸の代わりに単一の単位としてＮ−BOC−（Ｄ）−Phe−
Pro−OHを加えることができる。

完全に保護されたペプチド樹脂（500mg）を、−５℃
にてアニソール及びジメチルスルフィド（10体積％）を
含むテフロン容器中でフッ化水素で60分間処理した。N₂
流下で過剰のHFを除去し、残留塊をエーテルで抽出し、
濾過した。樹脂を氷酢酸及び水で３回抽出し、凍結乾燥
した。

凍結乾燥した粗ペプチドを、（ａ）500mlの0.1％TFA/
H₂₀及び（Ｂ）１リットルの0.1％TFAを含む60％アセト
ニトリルH₂Oから成る溶媒系の直線状勾配を用いたオク
タデシルシリカ（15Å、Vydac）ガラスカラム（1.5x30c
m）、40psi上の逆相クロマトグラフィーにより精製し、
均質とした。純度98％かそれ以上に相当する留分をプー
ルし、凍結乾燥した。

アミノ酸分析は、Asp（３）、Ser（１）、Glu
（６）、Gly（１）、Ile（１）、Leu（１）、Tyr
（１）、Phe（２）、His（１）、Pro（２）を示した。

得られたペプチドは、2548.6に対応する偽分子イオン
を示した。

実施例12 アミノ酸分析は、Asp（3.20）、Ser（0.86）、Glu
（6.60）、Gly（0.8）、Ile（1.00）、Leu（1.06）、Ty
r（0.86）、Phe（1.84）、His（0.88）、Pro（2.10）を
示した。

偽分子イオン:2562.4 実施例13 アミノ酸分析は、Asp（3.15）、Ser（0.84）、Glu
（6.84）、Gly（1.00）、Ile（1.04）、Leu（1.26）、T
yr（0.99）、Phe（2.12）、His（1.00）、Pro（1.55）
を示した。

偽分子イオン:2576.8 実施例14 小さな修正を行って基本的にP79及びその類似体の場
合に記載した通りに、この実施例の標題化合物を合成
し、精製した。例えば固相合成は、tert−ブチルオキシ
カルボニル−Leuフェニルアセトアミドメチルポリスチ
レン樹脂（Applied Biosystems,0.64ミリモル/g）を用
いて始めた。Asp残基に続くｔ−BOC基の脱保護の場合、
10％エチルメチルスルフィドを含むCH₂Cl₂中の50％TFA
を用いた。この方法で、標題ペプチドの収率を最適化
し、HPLC（215nmにおけるUV吸収）により60％以上とし
た。

アミノ酸分析は、Asp（1.00）、Glu（1.07）、Ile
（0.94）、Leu（１）、Phe（1.82）、Pro（3.29）を示
した。

偽分子イオン、1455。

実施例15 アミノ酸分析は、Asp（1.00）、Glu（1.08）、Ile
（0.96）、Leu（1.01）、Phe（1.91）、Pro（3.48）を
示した。

偽分子イオン、1553。

実施例16 アミノ酸分析は、Asp（1.00）、Glu（1.06）、Ile
（0.93）、Leu（0.98）、Phe（1.88）、Pro（3.6）を示
した。

偽分子イオン、1647。

トロンビン活性のアミド分解分析 Tos−Gly−Pro−Arg−pNAのトロンビン−触媒加水分
解を、1mLの最終容積中2.5、3.5、５及び10μＭの基質
濃度を用い、Varian Cary 2000複光束分光光度計におい
て405nmにて監視した。加水分解反応は、0.1MのNaCl及
び0.1％のPEG6000を含む0.1Mトリス−HCl緩衝液、pH7.8
中、25℃で行った。反応は、0.1Mのトリス−HCl緩衝
液、pH7.8中に溶解した基質を、同一緩衝液に溶解した
酵素（0.4又は0.04μＭ）及び濃度を変化させた阻害剤
の予備インキュベーション溶液に加えることにより開始
した。初期速度を記録し、競争的阻害の場合にはディク
ソンプロットの重量直線回帰（weighted linear regres
sion）により、又は双曲線形阻害の場合にはBaiciの方
法（Baici,1981）によりグラフからK_i値を決定した。同
一条件及びレイショ（λ_ex＝383nm、λ_em＝455nm）の蛍
光モードで操作する上記の装置を用い、蛍光助剤を用い
た分析（fluorogenic assays）を行った。蛍光強度は、
既知の濃度の７−アミノ−４−メチルクマリン溶液を用
いてキャリブレートした。本発明の合成ペプチドのヒト
α−トロンビンに対する特異性も、トロンビン活性のア
ミド分解分析で得られたK₁値の比較により両ヒトα−ト
ロンビン及び牛α−トロンビンならびにトリプシンに対
する相対的阻害活性を比較することにより決定すること
ができる。

本発明の合成ペプチドのトロンビンに対する阻害活性
は、Coag−Ａ−Mate2001装置（General Diagnostics In
c.,Morris Planes,New Jersey）又は他の適した分光光
度計を用い、プールして再構成した正常なヒト血漿のプ
ロトロンビン時間（PT、外的経路）又は活性化部分トロ
ンボプラスチン時間（APTT、内的経路）を決定すること
によっても分析することができる。

従ってプロトロンビン時間の決定の場合、50μｌの再
構成クエン酸化正常ヒト血漿（Sigma,St−Louis,MO.）
を50μｌのトロンボプラスチン溶液と、400μｌの浅い
容器中37℃で混合する。その後混合物を200μｌのトリ
ス−HCl緩衝液pH7.8（0.1MのNaCl、0.1％のPEG6000を含
む）、又は同一緩衝液中で濃度を変化させた阻害剤で処
理する。100μｌの25mM CaCl₂を用いた再石灰化の後、
凝固時間を記録する。阻害剤の不在下の凝固時間は、19
−22秒であった。

活性化部分トロンボプラスチン時間の決定の場合は、
最構成血漿をセファリン（Sigma,St−Louis,MO.）で３
分間活性化する以外は同様の方法を用いる。

典型的APTT及びPT阻害曲線を図１及び４に示す。

本発明のペプチドのいくつかのトロンビンに対する阻
害活性は、図２に示す通りトロンビン−媒介血小板凝固
の阻害能力に反映している。濃度を変化させたP79を含
む血小板の豊富な血漿をトロンビンで処理した。血小板
の凝固は、Bio Data PAP−４アグリゴメーターで測定す
る光透過の増加に反映する。

フィブリノゲン凝固分析 フィブリノゲン血餅形成の阻害を、37℃でVarian DMS
90上、405nmにて分光光度分析的に測定した。0.1MのNa
Cl、0.1％のPEG600を含む0.1Mのトリス−HCl、pH7.8中
の0.1％フィブリノゲン（Sigma）300μＬ及び同緩衝液
中で濃度を変化させた阻害剤をポリスチレンの浅い容器
中で混合し、全体積1mL中に酵素（ヒト又は牛α−トロ
ンビン0.4nM）を加えることにより反応を開始した。混
合してから血餅形成による屈折までの時間を種々の阻害
剤濃度に関して記録し、ログプロビット分析によりIC₅₀
値を算出した。分析における阻害剤の濃度は、ペプチド
含有量に基づく。

本発明のペプチドの凝固阻止活性の決定に、種々の他
の分析を用いることができる。このように本発明の合成
ペプチドのトロンビンに対する阻害活性を、活性化部分
トロンボプラスチン時間（APTT内部経路）又はプロトロ
ンビン時間（PT外部経路）の阻害により分析することも
できる。従ってプールされた正常なヒト血漿のAPTTをCo
ag−Ａ−Mate 2001装置（General Diagnostics Inc.,Mo
rris Planes,New Jersey）を用いて分析することにより
凝固阻止活性を決定することができる。

さらに本発明の合成ペプチドを、トリペプチジル ｐ
−ニトロアニリド基質、トシル−Gly−Pro−Arg−Ｐ−
ニトロアニリド（Chromozym TH,Boehringr−Mannheim,I
ndianapolis,In.）のトロンビン−触媒加水分解の阻害
に関して、Cary 219 複光束分光光度計上で420nmにお
ける分光光度測定により調べることができる。反応液
は、トロンビン溶液をトリス−HCl、pH7.4、NaCl緩衝液
と混合することにより調製することができる。

本発明の合成ペプチドのいくつかを用いて行ったこれ
らの分析は、これらのペプチドがトロンビンの二官能基
性阻害剤として作用することを示した。実際に、適した
スペーサーによって隔てられた２個のペプチドの決定的
領域の挿入により、強力なトロンビン阻害剤が得られ
た。結果を表Ｉに示す。

従って向上した酵素親和性及び試験管内凝固阻止効果
は、共働的分子内結合機構に直接帰することができる。
例えば式Ｉの化合物の置換基ＸがＤ−Pheである場合、
領域（ｉ）をトロンビンの活性部位の長い疎水性領域と
結合するのに適したものとするだろう。トロンビンの非
−接触部位に結合するための領域（ii）に関する要求
は、領域（ｉ）の場合とは異なる。

これらの２領域を１個の分子内に適したリンカーによ
って隔てて挿入することが、実質的にトロンビンに対す
る分子の親和性を向上させることは明らかである。実際
に２個の独立した領域の別々のIC₅₀投薬量を組み合わせ
ると凝固時間が正確に２倍になるが、２領域をリンカー
により結合するとより高い活性が得られる。従って本発
明の二官能基性阻害剤がトロンビンと接触すると、その
２元共働的結合が起こると思われる。リンカーは補助部
位（領域（ii））及び触媒部位（領域（ｉ））ならびに
触媒部位に隣接する非極性結合部位の架橋のための適し
たスペーサーとして働く。

又、種々の実験によりＤ−Phe−Pro−Arg−Pro−OH及
びＮα−アセチルデスルホヒルジン^55-65が独立に牛α
−トロンビンによるフィブリン血餅形成をそれぞれ250
μＭ及び3.5μＭのIC₅₀値で阻害するが、ヒルジン残基4
9−54に対応するスペーサーによって隔ててそれらを１
個の分子中に挿入すると、IC₅₀＝70±20nM（牛α−トロ
ンビン）及び４±0.8nM（ヒトα−トロンビン）の阻害
剤となることが示された。ヒルジン^45-65及びＤ−Phe−
Pro−Arg−Pro−OHの別々の投薬量を組み合わせた効果
は、単にフィブリノゲン凝固時間が２倍になるだけであ
るが、スペーサーの寄与は無視できなかった。凝固分析
におけるP53の場合に観察された相乗効果は、蛍光助剤
を用いた分析の結果により確証され、この場合この類似
体がP51と比較して純粋な競争的阻害剤として発生し、K
_i値がP51よりほとんど50倍低い。ペプチドP79、P102、P
103ならびに「不完全」ペプチドP184及びP185の場合に
興味深いトロンビン阻害活性が得られた。

動静脈短絡モデルにおける抗血栓活性 実験法 ウレタンで麻酔したラットを、温度制御加熱板上に背
臥位で固定する。右頚動脈及び左頚静脈に短いポリエチ
レンカテーテル（Portex、PE 50）でカテーテル法を施
す。カテーテルに生理的食塩水を満たし、クランプで締
める。カテーテルの２つの末端を血栓発生表面として作
用する２−cmのガラス毛細管（内径1.0mm）と連結し、
試験物質又はその溶媒（標準）の静脈内投与の５分後に
動静脈短絡を閉じているクランプを開く。短絡を流れる
血液によりガラス毛細管の温度が室温から体温に急速に
上昇する。毛細管の温度は、短絡の解放性の指標とな
る。温度をNiCrNi−熱電対を用いて測定する。

結果 ラットの動静脈短絡モデルにおける、静脈内投与５分
後のP79の抗血栓効果を組み替えヒルジンと比較した
（ｎ＝使用した動物の数）。結果を下表IIに示す。

血漿中のポリペプチドの安定性 本発明のペプチドを、蛋白質加水分解に対する試験管
内血漿安定性に関して評価した。添付する図における結
果は、P53及びP79（他の場合ヒルトニンIIと記す）の比
較安定性の例を示す。

600μｇのペプチドを250μｌの再構成正常ヒト血漿、
250μｌのトロンボプラスチン、600μｇの塩化カルシウ
ム及び50mMのNaHPO₄緩衝液pH7.8と混合して最終容積900
μｌとした。混合物を37℃でインキュベートし、100μ
ｌのアリコートを指示された時間間隔で取り出した。各
アリコートに20μｌの10％三塩化酢酸を加え、12XKにて
10分間遠心した。上澄み液をC₁₈分析カラムに注入し、
標準的溶離法（すなわちCH₃CN中60％の0.1％TFA/H₂Oか
ら0.1TFAまで）によりクロマトグラフィーにかけた。

図３に示される比較結果は、P53が30分後に50％以上
分解するがP79（ヒルトニンII）は、最小か又は全く蛋
白質加水分解を示さないことを例証している。

薬剤組成物 本発明のペプチドは、治療的に許容しうる塩の形態で
得ることができる。本発明のペプチドは、酸及び／又は
塩基として機能する両残基を有するので、有機酸（例え
ば酢酸、乳酸、コハク酸又はリンゴ酸）あるいは塩基
（例えばナトリウム、カリウム又はカルシウム）の塩を
誘導することができる。式Ｉのペプチドのこれらの塩
は、十分に生物学的に活性である。治療的に許容しうる
塩は、R.A.Boissonas et al.,Helv.Chim.Acta.43,1849
（1960）により記載の方法により適したイオン交換樹脂
を用いることによりある塩の形態から他の塩の形態に変
換することができる。

本発明のペプチド又は治療的に許容しうるその塩は、
単独であるいは組み合わせて血栓による血管障害の処置
又は予防に使用することができる。これらは、例えばヒ
ト、馬又は犬などの温血動物に製薬学上許容しうるキャ
リヤーと共に全身的に投与され、その組成物の割合は溶
解度及びえらばれた投与経路に依存する。本発明のペプ
チドは、製薬学上許容しうるキャリヤーと共に静脈内、
皮下又は筋肉内注射により投与される。適したキャリヤ
ーの例は標準的製薬学のテキスト、例えば“Remington'
s Pharmaceutical Sciences",16th edition,Mack Publi
shing Company,Waston,Penn.,1980に記載されている。

ペプチドの投薬量は投与の形態及び特定の化合物に依
存して変わるであろう。注射の場合ペプチドの治療的有
効量は約0.05mg/kg−10mg/kg体重の投薬量の範囲であ
る。活性成分の他に組成物は通常適したpHを保つための
適した緩衝液、例えばリン酸塩緩衝液及び溶液を等張と
するための塩化ナトリウム、グルコース又はマンニトー
ルを含む。

本発明のペプチドは単独で、又は他の薬剤と組み合わ
せて投与することができる。例えばペプチドは冠動脈の
再閉塞を防ぐための組織プラスミノゲンアクチベーター
と組み合わせて投与することができる。別の場合本発明
のペプチドはヘパリン又は低分子量ヘパリンと共に投与
することができ、組み合わせによりヘパリン又は低分子
量ヘパリンの投薬量を少なくすることができて有利であ
る。

次式IIを有する化合物の製造法は、本発明の範囲内で
ある。

式中、 ｎは１−４の範囲の整数であり、Ｋ及びＫ′は同一又
は異なり適した保護基、例えばBoc及びTosである。

方法は、次式 ［式中、 ｎは１−４の範囲の整数であり、Ｋ及びＫ′は同一又
は異なり適した保護基、例えばBoc及びTosである］ を有する化合物を、２重結合を酸化することができる酸
化剤で酸化し、所望の生成物を回収する段階を含む。

式IIの化合物も本発明の範囲内である。

本発明はさらに次式IIIを有する化合物の製造法も含
む。

方法は次式 を有する化合物を、メチル基を１個除去する能力を有す
る酵素で処理し、所望の生成物を回収する段階を含む。
式II及びIIIの化合物は、本発明のペプチド誘導体など
のペプチド誘導体製造の中間体として有用である。

本出願は、米国特許出願番号07/538,322の一部継続出
願であり、それをここに参照として挿入する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ニ，フエング カナダ国エイチ９ジエイ ３エル１・ケ ベツク・ピエール フオンズ・アパート メントナンバー１・ブールバードピエー ルフオンズ17715 (72)発明者 コニシ，ヤスオ カナダ国エイチ４アール １エヌ１・ケ ベツク・サン―ローラン・ブールゴワン 2525 (56)参考文献 特開 平４−507253（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−500870（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−6647（ＪＰ，Ａ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記式 ［式中、 Ｘは疎水性アミノ酸又はアリールスルホニル基であり； Ｂは疎水性アミノ酸又は環に結合した１個もしくはそれ
   以上のアルキル置換基を有することができ、その置換基
   が架橋して環構造を形成していてもよい環状イミノ酸の
   残基であり； Ｄは低級アルキルにより置換されていることができる炭
   素数が２〜４の線状炭素鎖であるか、あるいはＤはｐ−
   フェニルメチル又はｐ−フェニルエチル基であり； Ｙはカルボニル、ＤもしくはＬ型立体配置のヒドロキシ
   メチル又は−CH₂−であり； Ｚは であり、ここでｎ及びｍは１〜４の範囲内の整数であ
   り、そしてA₁及びA₂はそれぞれ独立してＨ又はシスもし
   くはトランス立体配置のdesHであり、但しｍが１である
   場合にはｎは３又は４であるか、あるいはＺは であり、ここでｎは１〜４であり； Ｇ及びＧ′は同一もしくは相異なり、pk値が約５もしく
   はそれ以下のＬ−α−アミノ酸であり； Ｘ′は疎水性Ｌ−α−アミノ酸であり； ＱはＬ−α−アミノ酸又は環状Ｌ−イミノ酸の残基であ
   り； ＷはＨ、あるいは直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキル、
   アリール又はアラルキル基であり； Ｒは１〜５個のアミノ酸からなる疎水性基又はカルボキ
   シルもしくはアミド官能基によって置換されていること
   ができるアルキル、アリールもしくはアラルキル基であ
   るか、あるいはＲは であり、ここでＪはフエニル環のパラ位に置換したＨ、
   OH、 であるか、あるいはＲ及びＲ′は同一もしくは相異な
   り、アミノ酸又は下記式 のアミン基であり、ここでR₂及びR₃はそれぞれ独立して
   水素、低級アルキル、アリールもしくはアルコキシアル
   キルであり、又は一緒になって環が場合によりＯ、Ｓ及
   びNHから選ばれる別のヘテロ原子を含んでいてもよい５
   〜６員の環を形成してもよく、あるいはＲ′はLeuに結
   合してカルボキシル基を形成するヒドロキシル基であ
   る］ で示されるペプチド誘導体又はその製薬学的に許容しう
   る塩。
2. 【請求項２】Ｘが置換基Ｂにペプチド結合により結合し
   たＤ−型立体配置の疎水性−アミノ酸、又は置換基Ｂの
   窒素原子に結合した疎水性基であり； Ｄがｐ−フェニルメチル、ｐ−フェニルエチル、エチレ
   ン、ブチレン又はプロピレンであり； Ｙがカルボニルであり； Ｇ及びＧ′が同一もしくは相異なり、Asp、Glu、 であり、ここでｎは１又は２であり； Ｘ′がＬ−Phe、Ｌ−4FPhe又はＬ−4ClPheであり； Ｑがプロリン、ピペコリン酸、サルコシン又はGluであ
   り； ＷがＨ、あるいはピペリジン又はピロリジン環の3,4又
   は５位上の低級アルキル、アリール又はアラルキル置換
   基であり； Ｒが 又はLeu−Ｒ′であり、ここでＪはフェニル環のパラ位
   に置換したＨ、OH、 であり； Ｒ′がヒドロキシル基又は であり、ここでR₂及びR₃は炭素数１〜６の直鎖状もしく
   は分枝鎖状のアルキル鎖であるか、又は一緒になって５
   〜６員の環を形成していてもよい 請求の範囲第１項に記載のペプチド。
3. 【請求項３】ＸがＤ−Phe、Ｄ−4FPhe又はＤ−4ClPheで
   あり、ここでα−アミノ基はアセチル化又はベンゾイル
   化により中和されているか、あるいはＸがナフタレンス
   ルホニル、ベンゼンスルホニル、トルエンスルホニルで
   あり； ＢがVal、ピペコリン酸又はProであり； Ｗが水素、又は3,4もしくは５位上の低級アルキル、ア
   リールもしくはアラルキル置換基であり； ＤがＢがPro又はペコリン酸である場合にプロピレンで
   あるか又はｐ−フェニルメチルであり； Ｙがカルボニルであり； ＲがGlu−Glu−Tyr−Leu−Gln−OH、Leu−OH又はGlu−G
   lu−Tyr−Leu−Ｒ′であり、ここでＲ′はヒドロキシル
   基又は下記式 を有する基であり、ここでR₂は−CH₃又はフェニルエチ
   ルであり、R₃はＨ又は−CH₃であるか、あるいはR₂及びR
   ₃は一緒になって−CH₂−CH₂−CH₂−CH₂−、−CH₂−CH₂
   −CH₂−CH₂−CH₂−又は−CH₂−CH₂−Ｏ−CH₂−CH₂−を
   形成してもよい請求の範囲第１項に記載のペプチド。
4. 【請求項４】Ｚが であり、ここでｐは１〜４の範囲内の整数である 請求の範囲第１項に記載のペプチド。
5. 【請求項５】ＸがＤ−Pheであり； Ｂがプロリンであり； Ｄがプロピレンであり； Ｙがカルボニルであり； ＧがAspであり； Ｇ′がGluであり； Ｘ′がPheであり； ＱがGlu又はProであり； Ｚが−（CH₂）_２（CO）−Gln−Ser−His−Asn−Asp−Gl
   y−、 −（CH₂）_３（CO）−Gln−Ser−His−Asn−Asp−Gly
   −、 −（CH₂）_４（CO）−Gln−Ser−His−Asn−Asp−Gly
   −、 −（CH₂）_４（CO）NH−CH₂−CH＝CH−CH₂−（CO）
   、 −（CH₂）_４（CO）NH−CH₂−CH＝CH−CH₂−（CO）
   _２又は −（CH₂）_４（CO）NH−CH₂−CH＝CH−CH₂−（CO）
   _３ であり； ＷがＨ、ｎ−ブチル又はメチルであり； Ｒ′がGlu−Glu−Tyr−Leu−OH又は−Leu−OHである 請求の範囲第１項に記載のペプチド。
6. 【請求項６】［Ｄ−Phe⁴⁵,Arg⁴⁷］ヒルジン^45-65、［Ｄ
   −Phe⁴⁵,Arg⁴⁷,D−Pro⁴⁸］ヒルジン^45-65、［Thr⁴⁵,Arg
   ⁴⁷,D−Pro⁴⁸］ヒルジン^45-65、［Ｄ−Phe⁴⁵,Arg⁴⁷,ψ
   （COCH₂）CO⁴⁷］ヒルジン^45-65、［Ｄ−Phe⁴⁵,Arg⁴⁷,ψ
   （COCH₂）CH₂CH₂CO⁴⁷］ヒルジン^45-65、［Ｄ−Phe⁴⁵,Ar
   g⁴⁷,ψ（COCH₂）CH₂CH₂CH₂CH₂CO⁴⁷］ヒルジン^45-65、
   ［Ｄ−Phe⁴⁵,Arg⁴⁷,ψ（COCH₂）（CH₂）₃CO⁴⁷−（NHCH₂
   CH＝CHCH₂CO）₁,Pro⁵⁸,Leu⁶¹］ヒルジン^45-61、［Ｄ−P
   he⁴⁵,Arg⁴⁷,ψ（COCH₂）（CH₂）₃CO⁴⁷−（NHCH₂CH＝CHC
   H₂CO）₂,Pro⁵⁸,Leu⁶¹］ヒルジン^45-61及び［Ｄ−Phe⁴⁵,
   Arg⁴⁷,ψ（COCH₂）（CH₂）₃CO⁴⁷−（NHCH₂CH＝CHCH₂C
   O）₃,Pro⁵⁸,Leu⁶¹］ヒルジン^45-61からなる群より選ば
   れる請求の範囲第１項に記載のペプチド。
7. 【請求項７】請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の
   ペプチド誘導体又はその製薬学的に許容しうる塩を有効
   成分として含有することを特徴とする血栓性疾患の予防
   又は処置剤。