DE602004009710T2

DE602004009710T2 - Verfahren zur peptidsynthese unter verwendung einer reduzierten menge an entschützungsmittel

Info

Publication number: DE602004009710T2
Application number: DE602004009710T
Authority: DE
Inventors: Martin R. Golden GUINN; Lewis M. Longmont Hodges; David A. Louisville JOHNSTON; Hendrick Westminster MOORLAG; Mark A. Boulder SCHWINDT
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2003-12-31
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2024-12-23
Also published as: ATE376556T1; US20050165217A1; EP1701969B1; WO2005063791A2; EP1701969A2; DE602004009710D1; WO2005063791B1; WO2005063791A3; US7439222B2; ES2295961T3

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Synthese von Enfuvirtid. Spezieller bezieht sich die Erfindung auf die Schritte der Entschützung und Aminosäureverknüpfung während der Synthese von Enfuvirtid.
Hintergrund der Erfindung
Viele Verfahren zur Peptidsynthese sind in der Literatur beschrieben (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 6,015,881 ; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4005–4008; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4009–4012; Kamber et al. (Hrsg.), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525–526; Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49: 9307–9320; Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49: 11065–11133; und Andersson et al. (2000) Biopolymers 55: 227–250; Bray, Brian L., Nature Reviews 2: 587–593 (2003)). Die verschiedenen Verfahren zur Synthese unterscheiden sich durch den physikalischen Zustand der Phase, in der die Synthese stattfindet, nämlich flüssige Phase oder feste Phase.
Flüssigphasenverfahren (oftmals als Lösungsphasenverfahren bezeichnet) der Synthese führen alle Reaktionen in einer homogenen Phase durch. Aufeinanderfolgende Aminosäuren werden in Lösung verknüpft, bis das gewünschte Peptidmaterial gebildet ist. Während der Synthese werden aufeinanderfolgende intermediäre Peptide durch Ausfüllung und/oder Waschungen gereinigt.
Bei der Festphasenpeptidsynthese (SPPS) wird eine erste Aminosäure oder Peptidgruppe an einen unlöslichen Träger wie ein Harz gebunden. Aufeinanderfolgende Aminosäuren oder Peptidgruppen werden an die erste Aminosäure oder Peptidgruppe addiert, bis das Peptidmaterial von Interesse gebildet ist. Das Produkt der Festphasensynthese ist daher ein Peptid, das an einen unlöslichen Träger gebunden ist. Peptide, die über SPPS-Techniken synthetisiert werden, werden dann von dem Harz gespalten, und das gespaltene Peptid wird isoliert.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Festphasen- und SPPS-Techniken kann ein Hybridansatz genutzt werden. Die Hybridsynthese wird typischerweise verwendet, um komplexe Sequenzen herzustellen. Beispielsweise können in einem repräsentativen Hybridschema komplexe Sequenzen durch die Festphasesynthese von geschützten Peptidzwischenprodukten hergestellt werden, die anschließend entweder durch Lösungsphasen- oder SPPS-Verfahren zusammengebaut werden, um ein längeres Peptidprodukt herzustellen. Daher wird beispielsweise als ein Schritt bei der Synthese eine intermediäre Verbindung hergestellt, die jeden der Aminosäurereste umfaßt, die in ihrer gewünschten Sequenz in der Peptidkette lokalisiert sind, wobei verschiedene von diesen Resten Seitenkettenschutzgruppen aufweisen. Die geschützten Peptidzwischenprodukte werden dann in Lösung verknüpft, um ein längeres Peptid zu bilden. Siehe beispielsweise WO 99/48513 .
Peptide und Aminosäuren, aus denen Peptide synthetisiert werden, weisen gewöhnlich reaktive Seitengruppen sowie reaktive terminale Enden auf. Wenn ein Peptid synthetisiert wird, ist es wichtig, daß die Aminogruppe an einem Peptid mit der Carboxylgruppe an einem anderen Peptid reagiert. Unerwünschte Reaktionen an Seitengruppen oder an dem falschen terminalen Ende eines Reaktanten erzeugen unerwünschte Nebenprodukte, manchmal in signifikanten Mengen. Diese können die Ausbeute ernsthaft beeinträchtigen oder sogar das Produkt, das aus einer praktischen Perspektive synthetisiert wird, ruinieren. Um die Nebenreaktionen zu verringern, ist es die günstige Praxis, reaktive Seitengruppen und terminale Enden von Recktanten entsprechend zu maskieren, um sicherzustellen, daß die gewünschte Reaktion stattfindet.
Beispielsweise umfaßt ein typisches Festphasensyntheseschema das Anlagern einer ersten Aminosäure oder Peptidgruppe an ein Trägerharz über die Carboxylkomponente des Peptids oder der Aminosäure. Dies macht die Aminogruppe des harzgebundenen Materials zur Verknüpfung mit zusätzlichen Aminosäuren oder Peptidmaterial verfügbar. Daher reagiert die Carboxylkomponente der zusätzlichen Aminosäure oder Peptidmaterials wünschenswerterweise mit der freien Aminogruppe des harzgebundenen Materials. Um Nebenreaktionen zu vermeiden, die die Amingruppe der zusätzlichen Aminosäure oder des Peptids involvieren, wird diese Amingruppe mit einer Schutzgruppe während der Verknüpfungsreaktion maskiert. Zwei allgemein bekannte Aminschutzgruppen sind die BOC-Gruppe und die FMOC-Gruppe. Viele andere wurden in der Literatur beschrieben. Nach der Verknüpfung kann die Schutz gruppe an dem N-Terminus des harzgebundenen Peptids entfernt werden, wodurch zusätzliche Aminosäuren oder Peptidmaterial an die wachsende Kette in einer ähnlichen Weise addiert werden können. In der Zwischenzeit bleiben reaktive Seitenkettengruppen der Aminosäure und Peptidreaktanten, einschließlich dem harzgebundenen Peptidmaterial sowie dem zusätzlichen Material, das zu der wachsenden Kette hinzugefügt werden soll, typischerweise mit Seitenkettenschutzgruppen während der Synthese maskiert. Diese selben Konzepte (ohne ein Trägerharz für die anfängliche Aminosäure) können auf Flüssigphasensynthesetechniken angewandt werden.
Der Schritt zum Entfernen der Schutzgruppen von einem Peptid wird üblicherweise als Entschützung bezeichnet. Wenn alle Schutzgruppen (einschließlich terminalen Schutzgruppen und Seitenkettenschutzgruppen) entfernt werden, wird dies als globale Entschützung bezeichnet.
In einigen Fällen wird nur die N-terminale Schutzgruppe entfernt. Die Reagenzien, die bei der N-terminalen Entschützung verwende werden, lassen die Seitenkettenschutzgruppen intakt. In einem exemplarischen N-terminalen Entschützungsschema wird die Entfernung der N-terminalen Schutzgruppe (beispielsweise einer Fmoc-Gruppe) typischerweise durch die Behandlung mit einem Reagens, das 20 bis 50% (auf Gewichtsbasis) Piperidin in einem Lösungsmittel, wie N-Methylpyrrolidon (NMP) oder Dimethylformamid (DMF) umfaßt, erreicht werden. Nach der Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe werden typischerweise mehrere Waschungen durchgeführt, um restliches Piperidin und Fmoc-Nebenprodukte (wie Dibenzofulven und sein Piperidinaddukt) zu entfernen. Konventionelle Synthesetechniken haben die Wichtigkeit der Entfernung von restlichem Piperidin, um unerwünschte Reaktionen zu verringern, wie die vorzeitige Entfernung von Fmoc-Schutzgruppen an anschließenden Aminosäuren, die an die Peptidkette addiert werden sollen, hervorgehoben. Mit anderen Worten, es wurde erkannt, daß die Fmoc-Gruppe an Aminosäuren verbleiben sollten, bis die spezielle Aminosäure in ein wachsendes Peptidmaterial eingeführt wurde, und zur Aktivierung für die Verknüpfung mit einer anschließenden Aminosäure bereit ist.
Mehrere Tests wurden entwickelt, um zu bestimmen, ob die Entfernung von Fmoc-Nebenprodukten und restlichem Piperidin aus einer Reaktionslösung beendet ist. Der üblichste dieser Tests ist der Chloranil-Test, der eine gesättigte Lösung aus Chloranil und Toluol in Ace ton nutzt. Farbe wird verwendet, um die Gegenwart von sekundärem Amin zu bestimmen (wodurch angezeigt wird, daß Fmoc-Nebenprodukte und/oder restliches Piperidin noch vorliegen). Andere Tests umfassen die Überwachung des pH der Reaktionslösung, um die Gegenwart von Piperidin zu bestimmen (beispielsweise unter Verwendung von pH-Papier). Noch weitere Tests umfassen den Einschluß eines Farbstoffs mit dem Entschützungsreagens und die visuelle Überwachung der Farbe der Reaktionslösung, um zu bestimmen, ob der Farbstoff (und daher das Entschützungsreagens) aus der Reaktionslösung entfernt wurde. Wenn die Fmoc-Schutzgruppe einmal entfernt ist, kann ein zusätzlicher aktivierter Aminosäurerest an das Peptidfragment addiert und der Zyklus für anschließende Aminosäurereste wiederholt werden, bis das gewünschte Peptid vollständig ist.
Für die Großproduktion von Peptiden können Punkte, die sich auf den Reagensverbrauch beziehen, sowie Zyklus- und Verfahrenszeit stark die Durchführbarkeit des Peptidsyntheseschemas beeinträchtigen. Daher besteht ein anhaltender Bedarf an Peptidsyntheseverfahren, die Peptidmaterialien von kommerziellem Interesse in großen Mengen herstellen können. Die Entschützung von Aminosäureresten an dem N-Terminus, um die Verknüpfung einer zusätzlichen Aminosäure, beispielsweise durch die Behandlung mit einer Base, zu ermöglichen, ist ein Aspekt der Synthese, in der die Verbesserung benötigt wird. Konventionelle Methodologien können Reagenzien bei Gehalten nutzen, die höher als wünschenswert sind und zusätzliche Verfahrensschritte, die nicht notwendig sind, umfassen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Synthese von Enfuvirtid und seinen Zwischenprodukten, insbesondere Verfahren, umfassend die Synthese von Peptidmaterial mit verringerter Reagenziennutzung, Reaktionsgemischvolumen und Zyklus- und Verfahrenszeit. Im allgemeinen sind die erfindungsgemäßen Verfahren auf die Entschützungs- und Verknüpfungsschritte von Enfuvirtid anwendbar. Spezieller bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung und Gegenwart des Entschützungsreagens während der Entschützungs- und Verknüpfungsschritte der Synthese.
In einem Aspekt der Erfindung wurde überraschend entdeckt, daß signifikant höhere Gehalte an Entschützungsreagens in den anschließenden Verfahrensschritten der Enfuvirtidsynthese toleriert werden können. Beispielsweise wurde entdeckt, daß mehr restliche Base in Reaktio nen im Anschluß an die Entschützung toleriert werden können, wobei Peptidmaterial an die C-terminale Stelle eines Peptidfragments addiert wird, ohne daß die Base die N-terminale Schätzung des Peptidmaterials, das addiert wird, schwächt. In diesem Aspekt stellt die Erfindung Peptidsyntheseverfahren bereit, die Verknüpfungsreaktionen mit neuen Eigenschaften umfassen. Beispielsweise ist in einer Ausführungsform das Verknüpfungsreaktionsgemisch in bezug auf den pH basisch. Wie hierin beschrieben, umfassen die Synthesereaktionen, auf die die erfindungsgemäßen Verfahren besonders anwendbar sind, eine Base (wie Piperidin) als Entschützungsreagens. Die Gegenwart von höheren Mengen an Entschützungsreagens in der Zusammensetzung während der Verknüpfungsreaktionen wird daher eine basischere Zusammensetzung bereitstellen. In anderen Ausführungsformen umfaßt das Verknüpfungsreaktionsgemisch einen Restbasengehalt von mehr als 100 ppm (Gewichtsbasis), der signifikant höher ist, als es konventionelle Synthesetechniken erlauben. Beispielsweise erfordern konventionelle Synthesetechniken die Entfernung von restlichem Piperidin und Fmoc-Nebenprodukten (Dibenzofulven und sein Piperidinaddukt) vor der Verknüpfung einer nachfolgenden Aminosäure. Zu diesem Zweck wird der Test durchgeführt, um sicherzustellen, daß kein restliches Piperidin in dem Reaktionsgemisch verbleibt, bevor die nachfolgende Aminosäure zu dem Reaktionssystem zugegeben wird. Wie hierin beschrieben, können konventionelle Tests, die entwickelt wurden, um die Entfernung von Piperidin zu überwachen: (a) die Gegenwart von sekundären Aminen in dem Reaktionsgemisch (beispielsweise ein Chloranil-Test); (b) einen neutralen pH des Reaktionsgemisches (beispielsweise unter Verwendung von pH-Papier oder einem anderen pH-Monitor) und/oder (c) die Gegenwart von Farbstoffen, die in dem Entschützungsreagens enthalten sind (beispielsweise verknüpft mit dem Entschützungsreagens) identifizieren. In noch weiteren Ausführungsformen der Erfindung wird die Verknüpfungsreaktion in einem Reaktionsgemisch durchgeführt, das einen positiven Test bereitstellen würde, wenn es einem Chloranil-Test unterzogen wird.
Gemäß einigen Aspekten der Erfindung sind Reagenzien in geringeren Mengen erforderlich, um das Entschützungsreagens zu entfernen, bevor der Verknüpfungsschritt durchgeführt wird. Bevorzugt beseitigen die erfindungsgemäßen Verfahren Verfahrensschritte durch Verringern der Anzahl an Waschschritten, die zur Entfernung des Entschützungsreagens erforderlich sind. Die Beseitigung der Waschschritte kann wesentlich die Gesamtverfahrenszeit und Zykluszeit verringern, was die Gesamtsynthesekapazität erhöhen kann. Die erfindungsgemäßen Verfahren können die Menge an erforderlichem Waschlösungsmittel um bis zu 50% verringern. Dies kann zu signifikanten Einsparungen in den Rohmaterialkosten pro Kilogramm hergestelltem Peptidprodukt führen.
In einem Aspekt nutzen die erfindungsgemäßen Verfahren signifikant weniger Entschützungsreagens zur Entfernung von N-terminalen Schutzgruppen während des Entschützungsschrittes. Beispielsweise können konventionelle Synthesetechniken eine Lösung, enthaltend 20 bis 50% Piperidin (auf Gewichtsbasis) in einem Lösungsmittel, wie NMP oder DMF, nutzen. Für die Festphasensynthese kann die Konzentration von Piperidin in dem unteren Teil dieses Konzentrationsbereiches liegen (beispielsweise 20 bis 30% Piperidin in Lösungsmittel), während bei der Flüssigphasensynthese die Konzentration in dem oberen Teil dieses Konzentrationsbereiches liegen kann (beispielsweise 30% oder mehr Piperidin in Lösungsmittel). Im Gegensatz dazu können einige Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren ein Entschützungsreagens nutzen, das Piperidin in einer Menge von weniger als 20% oder weniger als 10% oder etwa 5% (auf Gewichtsbasis) umfaßt. In bevorzugten Ausführungsformen nutzen die erfindungsgemäßen Verfahren ein Entschützungsreagens, das Piperidin in einer Menge in dem Bereich von etwa 5% bis etwa 10% (auf Gewichtsbasis) umfaßt.
Gemäß dieser Aspekte der Erfindung ermöglichen die erfindungsgemäßen Verfahren die signifikante Reduktion der Reagenziennutzung während der Synthese, und diese verringerte Reagenziennutzung kann signifikante Vorteile bei der Peptidsynthese im großen Umfang bereitstellen. Im wesentlichen kann weniger Ausgangsmaterial in Form von Entschützungsreagens verwendet werden, was zu wesentlichen Kosteneinsparungen führen kann. Wiederum wird weniger des Entschützungsreagens in dem Reaktionsgemisch vorliegen, nachdem die Entschützung beendet ist und bevor die Verknüpfung durchgeführt werden kann. Die erfindungsgemäßen Verfahren erfordern daher weniger Waschungen zur Entfernung des Entschützungsreagens nach der Spaltung der N-terminalen Schutzgruppe. Verringerte Waschungen können sich in geringerer Reagenziennutzung und verringerten Zyklus- und Verfahrenszeiten in der Gesamtsynthese widerspiegeln.
Wie aus dem Überblick der vorliegenden Beschreibung offensichtlich sein wird, können Ausführungsformen der Erfindung die Durchführung von Enfuvirtidsynthesereaktionen im Anschluß an die Entschützung in Reaktionsgemischen, die höhere Entschützungsmittelgehalte aufweisen, die Nutzung von weniger Entschützungsmittel in Peptidsynthesereaktionen oder eine Kombination von diesen Aspekten umfassen. In jeder der hierin beschriebenen Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Verfahren überraschenderweise vergleichbare Ausbeute und Fragmentreinheit wie konventionelle Verfahren bereitstellen.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Synthetisieren von Enfuvirtid bereit, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Zusammensetzung, umfassend ein Peptidfragment, wobei das Peptidfragment mindestens einen Aminosäurerest umfaßt und eine basenempfindliche, N-terminale Schutzgruppe umfaßt; (b) Entfernen der basenempfindlichen, N-terminalen Schutzgruppe aus dem Peptidfragment unter Verwendung eines Entschützungsreagens, umfassend eine Base, wobei eine N-terminale Funktionalität an dem Peptidfragment entschützt wird; (c) Entfernen der Base aus der Zusammensetzung zur Bereitstellung eines Restbasengehalts von mehr als 100 ppm; (d) Bewirken, daß ein reaktives Peptidfragment, das einen reaktiven C-Terminus und eine basenempfindliche, N-terminale Schutzgruppe aufweist, mit der entschützten N-terminalen Funktionalität des Peptidfragments unter solchen Bedingungen reagiert, daß das reaktive Peptidfragment an das Peptidfragment addiert wird; und (e) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (b) bis (d), bis das gewünschte Peptid erhalten wird.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Synthetisieren von Enfuvirtid bereit, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Zusammensetzung, umfassend ein Peptidfragment, wobei das Peptidfragment mindestens einen Aminosäurerest umfaßt und eine basenempfindliche, N-terminale Schutzgruppe umfaßt; (b) Entfernen der basenempfindlichen, N-terminalen Schutzgruppe aus dem Peptidfragment unter Verwendung eines Entschützungsreagens, umfassend eine Base, wobei eine N-terminale Funktionalität an dem Peptidfragment entschützt wird; (c) Entfernen der Base aus der Zusammensetzung bis zu einem Punkt, bei dem die Zusammensetzung ein positives Testergebnis bereitstellen würde, wenn sie einem Chloranil-Test unterzogen wird; (d) Bewirken, daß ein reaktives Peptidfragment, das einen reaktiven C-Terminus und eine basenempfindliche, N-terminale Schutzgruppe aufweist, mit der entschützten N-terminalen Funktionalität des Peptidfragments unter solchen Bedingungen reagiert, daß das reaktive Peptidfragment an das Peptidfragment addiert wird; und (e) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (b) bis (d), bis das gewünschte Peptid erhalten wird.
In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Synthetisieren von Enfuvirtid bereit, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Zusammensetzung, umfassend ein Peptidfragment, wobei das Peptidfragment mindestens einen Aminosäurerest umfaßt und eine basenempfindliche, N-terminale Schutzgruppe umfaßt; (b) Entfernen der basenempfindlichen, N-terminalen Schutzgruppe aus dem Aminosäurerest unter Verwendung eines Entschützungsreagens, umfassend eine Base, wobei eine N-terminale Funktionalität an dem Peptidfragment entschützt wird; (c) Bewirken, daß ein reaktives Peptidfragment, das einen reaktiven C-Terminus und eine basenempfindliche, N-terminale Schutzgruppe aufweist, mit der entschützten N-terminalen Funktionalität des Peptidfragments unter solchen Bedingungen reagiert, daß das reaktive Peptidfragment an das Peptidfragment addiert wird, wobei die Zusammensetzung einen basischen pH während der Reaktion des reaktiven Peptidfragments und des Peptidfragments aufweist; und (d) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (b) und (c), bis das gewünschte Peptid erhalten wird.
Ausführliche Beschreibung
Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren zum effektiven Synthetisieren von Enfuvirtid und seinen Zwischenprodukten und insbesondere zum effektiven Entfernen basenempfindlicher, N-terminaler Schutzgruppen, um dadurch eine N-terminale entschützte Aminosäure zu bilden (eine N-alpha-Aminogruppe), und anschließendes Verknüpfen einer Aminosäure mit der N-alpha-Aminogruppe gerichtet.
Die hierin beschriebenen Verfahren sind zum Verbessern der Aspekte der maßstäblich vergrößerten Synthese von Enfuvirtid besonders geeignet. In bevorzugten Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Verfahren diese Verbesserungen als Verringerung der Verfahrens- und Zykluszeit sowie Verringerung der Menge an Reagenzien und erforderlichen Ausgangsmaterialien bereitstellen.
Es wird selbstverständlich sein, daß die Peptide der Erfindung durch in der Technik allgemein bekannte Techniken synthetisiert oder hergestellt werden können. Siehe beispielsweise Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, sowie zusätzliche hierin zitierte Referenzen. Reste von einem oder mehreren anderen monomeren, oligomeren und/oder polymeren Bestandteilen können gegebenenfalls in ein Peptid eingeführt werden.
Wie hierin verwendet, ist unter dem Ausdruck „Monomer" ein Material mit relativ niedrigem Molekulargewicht (d. h., im allgemeinen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 500 Dalton) mit einer oder mehreren polymerisierbaren Gruppen zu verstehen. Unter „Oligomer" ist ein Molekül mit einer relativen Zwischengröße zu verstehen, das zwei oder mehr Monomere enthält und im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 500 bis zu etwa 10.000 Dalton aufweist. Unter „Polymer" ist ein relativ großes Material zu verstehen, das eine Substruktur umfaßt, die aus zwei oder mehr monomeren, oligomeren und/oder polymeren Bestandteilen gebildet ist und im allgemeinen ein Molekulargewicht von mehr als etwa 10.000 Dalton aufweist.
Die Aminosäuren, aus denen die Peptide abgeleitet sind, können natürlich vorkommende Aminosäurereste, nicht-natürliche Aminosäurereste oder Kombinationen davon sein. Die zwanzig üblichen natürlich vorkommenden Aminosäurereste sind folgende: A (Ala, Alanin), R (Arg, Arginin); N (Asn, Asparagin); D (Asp, Asparaginsäure); C (Cys, Cystein); Q (Gln, Glutamin), E (Glu, Glutaminsäure); G (Gly, Glycin); H (His, Histidin); I (Ile, Isoleucin); L (Leu, Leucin); K (Lys, Lysin); M (Met, Methionin); F (Phe, Phenylalanin); P (Pro, Prolin); S (Ser, Serin); T (Thr, Threonin); W (Trp, Tryptophan); Y (Tyr, Tyrosin) und V (Val, Valin). Natürlich vorkommende seltene Aminosäuren werden ebenso berücksichtigt und umfassen beispielsweise Selenocystein und Pyrrolysin.
Nicht-natürliche Aminosäuren umfassen organische Verbindungen mit einer ähnlichen Struktur und Reaktivität zu der von natürlich vorkommenden Aminosäuren und umfassen beispielsweise D-Aminosäuren, beta-Aminosäuren, omega-Aminosäuren (wie 3-Aminopropionsäure, 2,3-Diaminopropionsäure, 4-Aminobuttersäure und dergleichen), gamma-Aminosäuren, cyclische Aminosäureanaloga, Proparglycinderivate, 2-Amino-4-cyanobuttersäurederivate, Weinreb-Amide von Aminosäuren und Aminoalkohole.
Die vorliegende Erfindung berücksichtigt, daß das synthetisierte Peptidmaterial als Zwischenprodukte bei der Synthese von anderen Peptiden von Interesse durch Modifikation des resultierenden Peptids, durch Verknüpfung des Peptids mit anderen Materialien, wie anderen Peptiden, oder dergleichen fungieren kann. Beispielsweise würde die vorliegende Erfindung für die Synthese von Peptidfragmentzwischenprodukten nützlich sein, die bei der Synthese von Enfuvirtid (ebenso bekannt als das T-20-Peptid) oder alternativ DP-178 nützlich sind. Diese Peptidfragmente der Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die mit Aminosäuresequenzen, wie in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben: TABELLE
Enfuvirtid ist ein Peptid, daß den Aminosäureresten 638 bis 673 des Transmembranproteins gp41 aus HIV-1.sub.LAI-Isolat entspricht und die 36-Aminosäuresequenz aufweist (gelesen von Amino, NH₂ bis Carboxy, COOH, Terminus):
NH₂-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH (SEQ ID Nr.:1)
Der chemische Name von Enfuvirtid ist N-Acetyl-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-CONH₂. Es ist selbstverständlich, daß die Prinzipien der vorlie genden Erfindung ebenso in bevorzugten Ausführungsformen auf die Gewinnung von Peptiden, die alles oder einen Teil von T-20-artigen Peptidfragmenten zusätzlich zu T-20-Peptidfragmenten bilden, angewandt werden kann. Der Ausdruck „T-20-artig", wie hierin verwendet, umfaßt jedes HIV- oder Nicht-HIV-Peptid, aufgelistet in US-Pat. Nr. 5,464,933 ; 5,656,480 , 6,015,881 , 6,281,331 oder PCT-Veröffentlichung Nr. WO 96/19495 . Die Synthese von Peptiden mit T-20-Aktivität und Peptidzwischenprodukten, die verwendet werden, um Peptide mit T-20-Aktivität herzustellen, werden in US-Pat. Nr. 5,464,933 ; 5,656,480 , 6,015,881 , 6,281,331 und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 96/19495 beschrieben.
Die Erfindung zieht die Synthese von Peptiden, die chemisch verändert wurden, damit sie eine oder mehrere andere chemische Gruppen als Aminosäurereste enthalten, manchmal als modifizierte Peptide bezeichnet, in Betracht. Diese chemischen Gruppen können an den Aminoenden der Peptide, den Carboxyenden und/oder an einem oder mehreren Aminosäureresten entlang der Länge des Peptids enthalten sein. In noch weiteren Ausführungsformen kann das Peptid zusätzliche chemische Gruppen, die an ihren Amino- und/oder Carboxyenden vorliegen, umfassen, so daß beispielsweise die Stabilität, Reaktivität und/oder Löslichkeit der Peptide verbessert werden. Beispielsweise können hydrophobe Gruppen wie Carbobenzoxyl-, Dansyl- oder Acetylgruppen an die Aminoenden der Peptide addiert werden. Ebenso kann eine para-Nitrobenzylestergruppe an den Carboxyenden der Peptide plaziert werden. Techniken zum Einführen dieser Modifikationen sind in der Technik allgemein bekannt.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung Verfahren zum Synthetisieren von Peptiden bereit, die eine oder mehrere Schutzgruppen umfassen können. Die Beschaffenheit und Verwendung von Schutzgruppen ist in der Technik allgemein bekannt. Im allgemeinen ist eine geeignete Schutzgruppe irgendeine Sorte von Gruppen, die dafür sorgen kann, daß das Atom, an das sie gebunden sind, typischerweise Sauerstoff oder Stickstoff, nicht an unerwünschten Reaktionen während der Verarbeitung und Synthese beteiligt sind. Schutzgruppen umfassen Seitenkettenschutzgruppen und Amino- oder N-terminale Schutzgruppen. Schutzgruppen können ebenso die Reaktion oder Bindung von Carbonsäuren, Thiolen und dergleichen verhindern.
Eine Seitenkettenschutzgruppe bezieht sich auf eine chemische Komponente, die mit der Seitenkette (R-Gruppe in der allgemeinen Aminosäureformel H₂N-C(R)(H)-COOH) einer Aminosäure verknüpft ist, die dafür sorgt, daß ein Teil der Seitenkette nicht mit Chemikalien, die in Schritten der Peptidsynthese, Verarbeitung und dergleichen verwendet werden, reagiert. Die Wahl einer Seitenkettenschutzgruppe kann von verschiedenen Faktoren abhängen, beispielsweise dem Typ der durchgeführten Synthese, Verarbeitung, der das Peptid unterzogen werden soll, und dem gewünschten Zwischenprodukt oder Endprodukt. Die Seitenkettenschutzgruppe hängt ebenso von der Beschaffenheit der Aminosäure selbst ab. Im allgemeinen wird eine Seitenkettenschutzgruppe gewählt, die während der Entschützung der Aminogruppen während der Synthese entfernt wird. Deshalb sind die Aminoschutzgruppe und die Seitenkettenschutzgruppe typischerweise nicht dieselben.
In einigen Fällen und in Abhängigkeit des Typs der Reagenzien, die in der Festphasensynthese und anderen Peptidverarbeitung verwendet werden, muß eine Aminosäure nicht die Gegenwart einer Seitenkettenschutzgruppe erfordern. Diese Aminosäuren umfassen typischerweise keinen reaktiven Sauerstoff oder Stickstoff in der Seitenkette.
Beispiele von Seitenkettenschutzgruppen umfassen Acetyl (Ac), Benzoyl (Bz), tert-Butyl, Triphenylmethyl (Trityl), Tetrahydropyranyl, Benzylether (Bzl), 2,6-Dichlorbenzyl (DCB), t-Butoxycarbonyl (BOC), Nitro, p-Toluolsulfonyl (Tos), Adamantyloxycarbonyl, Xanthyl (Xan), Benzyl-, Methyl-, Ethyl- und t-Butylester, Benzyloxycarbonyl (Z), 2-Chlorbenzyloxycarbonyl (2-Cl-Z), t-Amyloxycarbonyl (Aoc) und aromatische oder aliphatische Schutzgruppen vom Urethantyp, photolabile Gruppen, wie Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC), und fluoridlabile Gruppen, wie Trimethylsilyloxycarbonyl (TEOC).
Beispielsweise kann irgendeine oder mehrere der Seitenketten der Aminosäurereste von Peptidfragmenten, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, mit Standardschutzgruppen, wie t-Butyl (t-Bu), Trityl (trt) und t-Butyloxycarbonyl (Boc) geschützt werden. Bevorzugte Seitenkettenschutzgruppen umfassen die t-Bu-Gruppe für Tyrosin-, Threonin-, Serin- und Asparaginsäure-Aminosäurereste; die trt-Gruppe für Histidin-, Glutamin- und Asparagin-Aminosäurereste; und die Boc-Gruppe für Lysin- und Tryptophan-Aminosäurereste.
Während der Synthese der Fragmente von Tabelle 1, die Histidin umfassen, wird die Seitenkette des Histidinrests wünschenswerterweise bevorzugt mit einer Tritylschutzgruppe (trt-Schutzgruppe) geschützt. Wenn der Histidinrest nicht geschützt ist, konnten die Reagenzien, die in der Synthese und Verarbeitung von Peptiden verwendet werden (beispielsweise die Säure, die verwendet wird, um das Peptidfragment von dem Harz in der Festphasensynthese abzuspalten) auf schädliche Weise mit dem Histidinrest reagieren, was den Abbau des Peptidfragments bewirkt.
Bevorzugt werden die Glutaminreste der Peptidfragmente der Erfindung mit Tritylgruppen (trt-Gruppen) geschützt. Jedoch ist es bevorzugt, den Glutaminrest an dem Carboxy-terminalen Ende der Fragmente 1–16 und 9–16 nicht zu schützen. Es wurde herausgefunden, daß die Abwesenheit einer Schutzgruppe an dem Glutaminrest an dem Carboxy-terminalen Ende des 1-16-Fragments die Reaktion des 1-16-Fragments mit dem 17-36-Fragment erleichtert, was die Verknüpfung der Fragmente mit nur etwa 2% Racemisierung ermöglicht. Außerdem können, wenn geringere Löslichkeit von irgendeinem der Peptidfragmente der Erfindung in organischen Lösungsmitteln gewünscht ist, die Tritylschutzgruppen von irgendeinem oder mehreren der anderen Glutaminreste der Fragmente beseitigt werden.
Bevorzugt werden alle Asparaginreste von jedem Peptidfragment der Erfindung geschützt. Außerdem ist es bevorzugt, daß der Tryptophanrest mit einer Boc-Gruppe geschützt wird.
Eine aminoterminale Schutzgruppe (ebenso als eine N-terminale Schutzgruppe bezeichnet) umfaßt eine chemische Komponente, die mit der alpha-Aminogruppe einer Aminosäure verknüpft ist. Typischerweise wird die aminoterminale Schutzgruppe in einer Entschützungsreaktion vor der Addition der nächsten Aminosäure, die an die wachsende Peptidkette addiert werden soll, entfernt, aber kann gehalten werden, wenn das Peptid von dem Träger während der Festphasensynthese abgespalten wird. Die aminoterminale Gruppe kann gehalten werden, wenn das Peptid ebenso gewaschen oder anderweitig verarbeitet wird. Die Wahl einer aminoterminalen Schutzgruppe kann von verschiedenen Faktoren abhängen, beispielsweise dem Typ der durchgeführten Synthese und dem gewünschten Zwischenprodukt oder erhaltenen Endprodukt.
Beispiele von aminoterminalen Schutzgruppen (ebenso hierin als N-terminale Schutzgruppen bezeichnet) umfassen: (1) Schutzgruppen vom Acyltyp, wie Formyl, Acrylyl (Acr), Benzoyl (Bz) und Acetyl (Ac); (2) aromatische Schutzgruppen vom Urethantyp, wie Benzyloxycarbonyl (Z) und substituiertes Z, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl; (3) aliphatische Urethanschutz gruppen, wie t-Butyloxycarbonyl (BOC), Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl; (4) Cycloalkylschutzgruppen vom Urethantyp, wie 9-Fluorenyl-methyloxycarbonyl (Fmoc), Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; und (5) Schutzgruppen vom Thiourethantyp, wie Phenylthiocarbonyl. Bevorzugte Schutzgruppen umfassen 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), 2-(4-Biphenylyl)-propyl(2)oxycarbonyl (Bpoc), 2-Phenylpropyl(2)-oxycarbonyl (Poc) und t-Butyloxycarbonyl (Boc). Eine bevorzugte aminoterminale Schutzgruppe ist Fmoc.
Gemäß der Erfindung umfassen bevorzugte Schutzgruppen Boc und Fmoc.
In einem anfänglichen Schritt der Erfindung wird eine Zusammensetzung, umfassend ein Peptidfragment, bereitgestellt, wobei das Peptidfragment mindestens einen Aminosäurerest umfaßt und eine basenempfindliche, N-terminale Schutzgruppe umfaßt. Wie hierin verwendet, bezieht sich eine basenempfindliche, N-terminale Schutzgruppe auf eine Schutzgruppe, die von der Aminosäure durch eine Base entkoppelt werden kann. Die basenempfindliche N-terminale Schutzgruppe hilft der Sicherstellung einer Aminosäureverknüpfung an der richtigen Stelle und in der richtigen Richtung. Die Wahl der geeigneten basenempfindlichen Schutzgruppe für den N-Terminus ist nicht besonders eingeschränkt, vorausgesetzt, daß die Schutzgruppe mit den Reagenzien verträglich ist, die in der Synthese verwendet werden, einschließlich Ausgangsmaterialien und Lösungsmitteln. Bevorzugte N-terminale, basenempfindliche Schutzgruppen umfassen Cycloalkylschutzgruppen vom Urethantyp, wie 9-Fluorenyl-methyloxycarbonyl (Fmoc), Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl.
Während der Bereitstellung der Peptidfragmentzusammensetzung können gegebenenfalls eine oder mehrere Seitenkettenschutzgruppen und/oder C-terminale Schutzgruppen an dem Peptidfragment bereitgestellt werden. Wie hierin beschrieben, sind jedoch diese Seitenketten- und/oder C-terminalen Schutzgruppen nur optional und nicht erforderlich.
Die Erfindung umfaßt die Entfernung der basenempfindlichen, N-terminalen Schutzgruppe von dem Peptidfragment unter Verwendung eines Entschützungsreagens, das eine Base umfaßt. Geeignete Basen umfassen sekundäre Amine und/oder Reagenzien, die zur Hydrogenolyse fähig sind. Exemplarische Basen umfassen Piperidin, Diethylamin, Piperazin.
Typischerweise wird das Entschützungsreagens in einem Lösungsmittel wie NMP, DMF, und CH₂Cl₂ bereitgestellt.
Wenn die basenempfindliche N-terminale Schutzgruppe einmal durch ein entsprechendes Entschützungsreagens entfernt wurde, wird die N-alpha-Aminogruppe der entschützten Aminosäuren zur Bildung einer Peptidbindung mit einem geeigneten reaktiven Peptidfragment verfügbar. Das geschützte Peptidfragment wird daher für die anschließende Reaktion und Amidbindungsbildung hergestellt.
Gemäß der Erfindung wird die Base von der Peptidzusammensetzung entfernt, um ein Reaktionsgemisch bereitzustellen, das zur anschließenden Verarbeitung geeignet ist (wie Verknüpfung). Die betreffenden Erfinder entdeckten überraschenderweise, daß nicht die gesamte restliche Base aus der Zusammensetzung vor der anschließenden Verarbeitung entfernt werden muß. Nach der Entschützung kann das Reaktionsgemisch in bezug auf den pH für die anschließende Verknüpfung oder andere Verarbeitung basisch sein. Weitgehend können die basischen Merkmale des Reaktionsgemisches über mehrere Wege analysiert werden. Beispielsweise kann die Menge der Base, die in dem Reaktionsgemisch vorliegt, auf Gewichtsbasis bestimmt werden (Teile pro Million, ppm). Ein Qualitätstest, wie der Chloranil-Test, kann durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob restliche Base in dem Reaktionsgemisch vorliegt. Der pH des Reaktionsgemisches kann bestimmt werden, um die basischen Merkmale des Reaktionsgemisches zu analysieren.
Gemäß der Erfindung kann die Verknüpfungsreaktion in Reaktionsgemischen durchgeführt werden, die neue Merkmale zeigen. Beispielsweise umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren Verknüpfungsreaktionen, die einen Restbasengehalt von mehr als etwa 100 ppm, oder bevorzugt in dem Bereich von etwa 100 ppm bis etwa 10.000 ppm, oder stärker bevorzugt in dem Bereich von etwa 500 ppm bis etwa 7.000 ppm (Gewichtsbasis) umfassen. Wie hierin beschrieben, ist der Restbasengehalt der erfindungsgemäßen Verfahren signifikant höher als vor den Peptidsyntheseverfahren. Die Menge der Restbase, die in der Verknüpfungsreaktion vorliegt, kann überwacht werden, beispielsweise durch in der Technik bekannte Standardtechniken.
In einer anderen Ausführungsform kann die Verknüpfungsreaktion einen Restbasengehalt umfassen, so daß die Verknüpfungsreaktion ein positives Testergebnis bereitstellen würde, wenn sie einem Chloranil-Test unterzogen wird. Daher wird die Verknüpfungsreaktion in Gegenwart der sekundären Amine durchgeführt (als ein Ergebnis der Restbase und/oder Nebenprodukte). In noch weiteren Ausführungsformen wird die Verknüpfungsreaktion bei relativ basischen Bedingungen, bevorzugt bei Bedingungen von mäßig basischem pH, durchgeführt. In einigen Ausführungsformen ist der pH des Reaktionsgemisches während der Verknüpfungsreaktion größer als 7, oder in dem Bereich von 7,2 bis 8,5, oder in dem Bereich von 7,2 bis 8. Wie hierin beschrieben, sind viele übliche Verfahren zum Messen des pH einer Zusammensetzung verfügbar, und jedes Verfahren kann in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden.
Gemäß der Erfindung wird die N-terminale Funktionalität eines Peptidfragments entschützt, wodurch der N-Terminus des Peptidfragments mit einem reaktiven Peptidfragment reagieren kann. Wie hierin verwendet, umfassen reaktive Peptidfragmente eine basenempfindliche, N-terminale Schutzgruppe, einen reaktiven C-Terminus und gegebenenfalls eine Seitenkettenschutzgruppe. Der reaktive C-Terminus ist daher verfügbar, um eine Peptidbindung mit einer entschützten N-alpha-Aminogruppe eines zusätzlichen Peptidfragments zu bilden.
Die Peptidbindungsbildung umfaßt die Aktivierung der Carboxylgruppe des reaktiven C-Terminus. Es gibt vier Hauptverknüpfungstechniken, die üblicherweise verwendet werden. Die erste Verknüpfungstechnik umfaßt in-situ-Verknüpfungsreagenzien, wie Carbodiimidvermittelte Verknüpfung, BOP, o-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und HATU, Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), wasserlösliches Carbodiimid (WSCDI) und Uroniumreagenzien (beispielsweise o-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborat (TBTU)). Eine zweite Verknüpfungstechnik nutt vorgeformte aktive Ester, wie Hydroxysuccinimid-(HOSu) und p-Nitrophenol-(HONp)-Ester. Eine dritte Verknüpfungstechnik umfaßt vorgeformte symmetrische Anhydride, wie N-Carboxyanhydride (NCAs). Eine andere Technik nutzt Säurehalogenide wie Acylfluorid sowie Acylchlorid. Die vorgeformten Aminosäurederivate können die zusätzlichen Vorteile der Nichterzeugung von Nebenprodukten aus dem Aktivierungsmittel und ebenso der Kompatibilität mit einem ungeschützten C-terminalen Aminosäurerest in der Aminokomponente aufweisen. Für die Carbodiimid- und TBTU-Verfahren ist jedoch der C-terminale Schutz bevorzugt.
Lösungsmittel, die für die Verknüpfungsreaktion geeignet sind, umfassen Dichlormethan (DCM), Dichlorethan (DCE), Dimethylformamid (DMF), Methylenchlorid und dergleichen, sowie Gemische aus diesen Reagenzien. Andere nützliche Lösungsmittel umfassen DMSO, Pyridin, Chloroform, Dioxan, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, N-Methylpyrrolidon und Gemische davon.
Das reaktive Peptidfragment kann einen Aminosäurerest oder ein Peptid, das mehr als einen Aminosäurerest enthält, wie gewünscht, umfassen. In einigen Ausführungsformen werden Peptide, die mehr als einen Aminosäurerest umfassen, verknüpft. Wenn Peptide verknüpft werden, erhöht sich das Risiko der Racemisierung aufgrund der Möglichkeit der Oxazolonbildung. Jedoch sind mehrere Techniken verfügbar, um die Racemisierung durch die Bereitstellung eines Schutzreagens zu verhindern. Eine der bekanntesten umfaßt Carbodiimid (beispielsweise DCC oder WSCDI) mit einem zusätzlichen Hilfsnucleophil (beispielsweise 1-Hydroxy-benzotriazol (HOBt), 1-Hydroxy-azabenzotriazol (HOAt) oder HOSu). Ein anderes Reagens, das verwendet werden kann, ist TBTU. Das Mischanhydridverfahren unter Verwendung von Isobutylchlorformiat, mit oder ohne zusätzliches Hilfsnucleophil, wird ebenso verwendet wie das Azidverfahren aufgrund der geringen Racemisierung, die damit verbunden ist. Diese Typen von Verbindungen können ebenso die Rate der Carbodiimidvermittelten Verknüpfungen erhöhen sowie Dehydratisierung von Asn- und Gln-Resten verhindern. Andere Verbindungen, die die Reaktionsrate erhöhen und die Rate der Nebenreaktionen verringern können, umfassen Phosphonium- und Uroniumsalze, die in Gegenwart einer tertiären Base geschützte Aminosäuren in aktivierte Spezies umwandeln können (beispielsweise BOP, PyBOPO, HBTU und TBTU, alle erzeugen HOBt-Ester).
Gemäß der Erfindung wird das reaktive Peptidfragment aktiviert, wodurch ein reaktiver Carboxyterminus bereitgestellt wird. In einem exemplarischen Aktivierungsverfahren werden eine Fmoc-geschützte Aminosäure, HOBT und DIEA in einem inerten Lösungsmittel (wie NMP) bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wird dann auf ungefäbr 0°C bis 5°C abgekühlt, und dann wird HBTU zugegeben, und die Reaktionslösung wird für eine entsprechende Zeit gerührt, um das HBTU zu lösen. Es wurde herausgefunden, daß die Aktivierung und Racemisie rung durch Zugeben des HBTU als letztes zu der kalten Lösung kontrolliert wird. Das Peptidfragment ist mm bereit für die Verknüpfung mit einem anderen Peptidfragment, das eine entschützte N-terminale Funktionalität umfaßt.
Das reaktive Peptidfragment wird zu einem Verknüpfungsgemisch zugegeben, das das entschützte Peptidfragment umfaßt. Die Verknüpfungsreaktion nutzt typischerweise einen stöchiometrischen Überschuß von Aminosäuren, beispielsweise 1,3 oder mehr, 2 oder mehr, oder 2,5 oder mehr, oder 3,0 oder mehr molaren Überschuß von Aminosäuren. Die Verwendung eines stöchiometrischen Überschusses von Aminosäuren sorgt dafür, daß die Verknüpfungsreaktion beendet wird, und die Reaktion überschüssige Base aus dem Entschützungsreagens toleriert.
Das Verknüpfungsende kann mit einem qualitativen Ninhydrintest, wie hierin beschrieben, überwacht werden. Nachdem festgestellt wurde, daß die Verknüpfung beendet ist, wird das Verknüpfungsreaktionsgemisch mit einem Lösungsmittel gewaschen, und der Verknüpfungszyklus wird für jeden der nachfolgenden Aminosäurereste des Peptidmaterials wiederholt. Nach dem Endverknüpfungszyklus wird das Harz mit einem Lösungsmittel wie NMP gewaschen und dann mit einem inerten zweiten Lösungsmittel wie DCM gewaschen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können mit Festphasen- oder Flüssigphasensyntheseverfahren, wenn gewünscht, genutzt werden. Wenn in Verbindung mit Festphasensynthese verwendet, kann jeder Typ an Träger, der in der Praxis von SPPS geeignet ist, gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt der Träger ein Harz, das aus einem oder mehreren Polymeren, Copolymeren oder Kombinationen von Polymeren wie Polyamid, Polysulfamid, substituierten Polyethylenen, Polyethylenglycol, phenolischen Harzen, Polysacchariden oder Polystyrol hergestellt werden kann. Der Polymerträger kann ebenso jeder Feststoff sein, der ausreichend unlöslich und für Lösungsmittel inert ist, die in der Peptidsynthese verwendet werden. Der Feststoffträger umfaßt typischerweise eine Verknüpfungskomponente, an die das wachsende Peptid während der Synthese gebunden wird, und die unter gewünschten Bedingungen gespalten werden kann, um das Peptid von dem Träger zu lösen. Geeignete Feststoffträger können Linker umfassen, die photospaltbar, TFA-spaltbar, HF-spaltbar, Fluoridionen-spaltbar, reduktiv-spaltbar, Pd(0)-spaltbar, nucleophil-spaltbar oder radikal-spaltbar sind. Bevorzugte Verknüpfungskomponenten sind un ter derartigen Bedingungen spaltbar, daß das gespaltene Peptid noch im wesentlichen durch Seitenkettenschutzgruppen geschützt ist.
Bevorzugte Feststoffträger umfassen säureempfindliche Feststoffträger, beispielsweise Hydroxymethyl-Polystyrol-Divinylbenzol-Polymerharz („Wang”-Harz, siehe Wang, S. S. 1973, J. Am. Chem. Soc., 95: 1328–33), 2-Chlortritylchloridharz (siehe Barlos et al. (1989) Tetrahedron Letters 30 (30): 3943–3946) und 4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxybuttersäureharz (siehe Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters 35 (27): 4705–4706), sowie funktionalisierte, vernetzte Poly-N-acryloylpyrrolidonharze und Chlormethylpolystyroldivinylbenzolpolymerharze. Diese Typen von Feststoffträgern sind kommerziell erhältlich von beispielsweise Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA.
Allgemeine Verfahrensweisen zur Herstellung und Beladung von Harzen, die in SPPS verwendet werden können, werden in „Principles and Practice of Solid Phase Peptide Synthesis" (herausgegeben von Greagory A. Grant, 1992, W. H. Freeman and Company) und den Referenzen darin beschrieben, und sind dem Fachmann allgemein bekannt. Spezifische Verfahrensweisen zum Beladen von Wang-Harzen werden beispielsweise in Sieber (1987) Tet. Lett. 28: 6147–50 und Granadas et al. (1989), Int. J. Pept. Protein Res. 33: 386–90 beschrieben.
Wenn das reaktive Peptidfragment einmal mit der entschützten N-terminalen Funktionalität des Peptidfragments reagiert, wird ein längeres N-terminal geschütztes Peptidfragment gebildet. Wenn die gewünschte Peptidlänge erreicht ist, kann die Synthese an diesem Punkt gestoppt werden, und das längere Peptidfragment kann durch jedes geeignete Verfahren gewonnen werden. Alternativ können, wenn ein längeres Peptidfragment gewünscht ist, die folgenden Schritte in Zyklen wiederholt werden: (i) Entfernen der basenempfindlichen, N-terminalen Schutzgruppe aus dem Peptidfragment unter Verwendung eines Entschützungsreagens, das eine Base umfaßt; Entfernen der Base aus der Zusammensetzung zur Bereitstellung eines gewünschten Restbasengehalts; und (iii) Bewirken, daß ein reaktives Peptidfragment, das einen reaktiven C-Terminus und eine basenempfindliche, N-terminale Schutzgruppe aufweist, mit der entschützten N-terminalen Funktionalität des Peptidfragments unter solchen Bedingungen reagiert, daß das reaktive Peptidfragment an das Peptidfragment addiert wird, wobei diese Schritte in Abhängigkeit des Peptids, das synthetisiert werden soll, mehrmals wieder holt werden können. Die Zahl an Zyklen der Schritte (i) bis (iii) kann nach Bedarf wiederholt werden, um das gewünschte Peptidprodukt zu erreichen.
Die Erfindung wird nun in bezug auf die folgenden nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel
Für das folgende Beispiel wurden die folgenden Standardreagenzien und Nomenklatur angenommen:
Chloranil-Test: Die Chloranil-Testlösung wurde durch Zugeben eines Tropfens einer gesättigten Lösung aus Chloranil in Toluol zu etwa 1 ml Aceton hergestellt. Die NMP-Waschungen wurden durch Zugeben eines Tropfens der Waschung zu der Chloranil-Testlösung getestet. Eine blaue oder violette Farbe ist ein positives Anzeichen für die Gegenwart von sekundärem Amin, was zeigt, daß Fmoc-Nebenprodukte und/oder Restpiperidin noch vorliegen.
Ninhydrin-Test: In dem qualitativen Ninhydrin-Test wurde eine Probe von 2 bis 20 mg des Harzes abgezogen und mit NMP und anschließend DCM oder Methanol gewaschen. Drei Tropfen einer 76%igen Lösung aus Phenol in Ethanol, sechs Tropfen einer 0,2-mM-KCN-Lösung in Pyridin und drei Tropfen einer 0,28-M-Lösung von Ninhydrin in Ethanol wurden zu der Probe zugegeben, und die Probe wurde in einem Heizblock bei etwa 100°C für etwa 5 Minuten plaziert. Die Probe wurde entfernt und direkt mit einer Ethanol/Wasser-Lösung (9:1) verdünnt. Eine blaue oder violette Farbe ist ein positives Anzeichen der Gegenwart von freien Aminen, was zeigt, daß die Reaktion noch nicht beendet ist. Wenn ein positiver Ninhydrin-Test nach einer Stunde der Verknüpfungsreaktion beobachtet wurde, wurde die Verknüpfungsreaktion für eine weitere Stunde fortgesetzt. Wenn ein positiver Ninhydrin-Test nach 3 Stunden der Verknüpfungsreaktion auftrat, wurde der Behälter entleert, und die Verknüpfung wurde unter Verwendung von etwa einem Äquivalent aktivierter Aminosäure und Reagenzien wiederholt.
Beispiel 1: Verringertes Ausgangsmaterial
Dieses Beispiel veranschaulicht die Synthese von Peptid unter Verwendung einer verringerten Menge an Entschützungsreagens (5% Piperidin).
Festphasensynthese wurde verwendet, um das folgende Peptidzwischenprodukt herzustellen:
Ac-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-OH (SEQ ID Nr: 17)
Mit L-Trp (Boc) beladenes Harz (10 g) wurde mit 100 ml CH₂Cl₂ und 100 ml NMP gewaschen.
Inzwischen wurde eine Lösung aus aktivierter Aminosäure hergestellt. Fmoc-L-AsnTrt(OH) (1,5 Äquivalente), HOBt (1,5 Äquivalente) und DIEA (1,7 Äquivalente) wurden in NMP (40 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf etwa 0°C abgekühlt, und eine Lösung aus HBTU (1,5 Äquivalente) in NMP (24 ml) und CH₂Cl₂ (18 ml) wurde zugegeben, um die aktivierte Aminosäurereagenslösung zu bilden.
Die aktivierte Aminosäurereagenslösung wurde dann zu dem Harz zugegeben, und die Suspension wurde auf 25°C bis 30°C erhitzt. Die Suspension wurde für 1 bis 3 h gerührt, bis die Reaktion beendet war (festgestellt unter Verwendung des Ninhydrin-Tests). Das Harz wurde mit NMP (2 × 100 ml) gewaschen.
Das Harz wurde dann mit 50 ml einer Lösung aus 5% Piperidin in NMP behandelt. Nach dem Rühren für 30 Minuten wurde das Harz abgezogen und erneut mit 50 ml einer Lösung aus 5% Piperidin in NMP für 30 Minuten behandelt. Die HPLC-Analyse zeigte vollständige Entschützung. Die Analyse zeigte, daß nach der ersten 30minütigen Aussetzung zu 5% Piperidin/NMP die Entschützung zu mehr als 99,5% beendet war.
Das Harz wurde mit NMP (7 × 70 ml) gewaschen, bis ein negativer Chloranil-Test beobachtet wurde. Die obige Sequenz der Aminosäureaktivierung und Entschützung wurde dann für jede Aminosäure in der Sequenz wiederholt (Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Leu-(OH), Fmoc-L-Ser(tBu)-OH, Fmoc, L-Ala-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Lys(Boc)-OH, Fmoc-L-Asp(OtBu)OH).
Das Peptid wurde von dem Harz unter Verwendung von TFA abgespalten und unter Verwendung von Standardtechniken isoliert. Die Peptidausbeute betrug 73%, und die Produktreinheit (gemessen durch HPLC) betrug 91,8%.
Andere Ausführungsformen dieser Erfindung werden dem Fachmann bei der Betrachtung dieser Beschreibung oder aus der Praxis der hierin offenbarten Erfindung offensichtlicht werden. Verschiedene Auslassungen, Modifikationen und Veränderungen an den Prinzipien und Ausführungsformen, die hierin beschrieben sind, können durch den Fachmann vorgenommen werden, ohne vom wahren Umfang und Geist der Erfindung, der durch die folgenden Ansprüche angegeben wird, abzuweichen. Alle hierin zitierten Patente, Patentdokumente und Veröffentlichungen werden hiermit durch Verweis aufgenommen, als wenn sie einzeln aufgenommen würden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Synthetisieren von Enfuvirtid oder Peptidfragmenten davon, umfassend die Schritte: a. Bereitstellen einer Zusammensetzung, umfassend ein Peptidfragment, wobei das Peptidfragment mindestens einen Aminosäurerest umfaßt und eine basenempfindliche, N-terminale Schutzgruppe umfaßt; b. Entfernen der basenempfindlichen, N-terminalen Schutzgruppe aus dem Peptidfragment unter Verwendung einer Base als Entschützungsreagens; c. Entfernen einer Base aus der Zusammensetzung zur Bereitstellung eines Restbasengehalts von mehr als 100 ppm; d. Bewirken, daß ein reaktives Peptidfragment, das einen reaktiven C-Terminus und eine basenempfindliche, N-terminale Schutzgruppe aufweist, mit der entschützten N-terminalen Funktionalität des Peptidfragments unter solchen Bedingungen reagiert, daß das reaktive Peptidfragment an das Peptidfragment addiert wird; und e. gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (b) bis (d), bis das gewünschte Peptid erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die basenempfindliche, N-terminale Schutzgruppe eine Fmoc-Schutzgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Base Piperidin ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei Piperidin in einem Lösungsmittel in einer Menge im Bereich von 5% bis 10% auf Gewichtsbasis gelöst wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Lösungsmittel NMP ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Restbasengehalt in der Zusammensetzung im Bereich von 100 ppm bis 10.000 ppm liegt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei ein Peptid, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 11 oder aus SEQ ID Nr. 17, synthetisiert wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, wobei für die Peptidsynthese Festphasen- oder Flüssigphasensyntheseverfahren angewendet werden.