CN102336813B - 一种固相多肽合成蛋白溶菌素的制备方法 - Google Patents

一种固相多肽合成蛋白溶菌素的制备方法 Download PDF

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CN102336813B CN201110183315.0A CN201110183315A CN102336813B CN 102336813 B CN102336813 B CN 102336813B CN 201110183315 A CN201110183315 A CN 201110183315A CN 102336813 B CN102336813 B CN 102336813B
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Abstract

本发明公开了一种固相多肽合成蛋白溶菌素的制备方法，本发明的技术方案包括以下步骤：以Rink？Amide？MBHA树脂为起始原料，HBTU/HOBt为缩合剂，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，最后一个氨基酸使用Boc-Arg-OH·HCl，获得保护的十七肽树脂，然后加入切肽试剂进行切肽，加入乙醚沉淀，获得还原型粗品。5-位和14-位Cys的-SH基用Trt保护，并在pH为8.5～10.0的条件下用双氧水氧化；7-位和12-位Cys的-SH基用Acm保护，并在甲醇溶液中用碘氧化，获得双二硫键Cys5-14？Cys7-12粗品，最后采用C8高效液相柱进行分离纯化，获得目标产物，纯度为99.21％，总收率为：23.68%。本发明的方法，生产成本低，工艺简单，环境污染低，产率高，便于工业化实施。

Description

一种固相多肽合成蛋白溶菌素的制备方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白溶菌素的制备方法，具体涉及蛋白溶菌素的固相多肽合成制备方法。
背景技术
中文名：蛋白溶菌素
英文名：Protegrin，Iseganan
结构式：
分子式：C78H126N30O18S4·HCl
分子量：1900.32 + 36.46
CAS号：256475-21-5
蛋白溶菌素在哺乳动物体内天然存在，分布于细菌和真菌入侵的第一线，具有广谱抗微生物的活性，能最大程度的减少微生物产生耐药的可能性。Intra Biotics制药公司在美国的Ⅰ期临床试验认为它是一个治疗囊性纤维化(CF)有希望的新药，设计试验剂型为口服抗菌素溶液。目前该药物处于临床Ⅲ期试验阶段，适应症确定为预防与治疗头部或颈部癌症放射性治疗后引起的感染或囊肿。
蛋白溶菌素是由十七个氨基酸组成的多肽类化合物，其特点是含有四个半胱氨酸和两对二硫键。目前，还没有关于含有两对二硫键多肽产品的工业化生产技术的报导，因此，此项技术具有很大的实际意义。
发明内容
本发明的目的是公开一种固相多肽合成蛋白溶菌素的制备方法，本发明提出了一条较适当的路线，使用固相法合成蛋白溶菌素，且收率较高。
本发明的技术方案包括以下步骤：
以Rink Amide MBHA树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以23%六氢吡啶为脱帽试剂，HBTU/HOBt为接肽缩合剂，依次逐个接上氨基酸，最后一个氨基酸采用Boc-Arg-OH·HCl，然后加入切肽试剂进行切肽反应，加入乙醚沉淀，获得还原型粗品，5-位和14-位Cys的-SH基用Trt保护，并在pH为8.5-10.0的条件下用双氧水氧化；7-位和12-位Cys的-SH基用Acm保护，并在甲醇溶液中用碘氧化，获得双二硫键Cys5-14 Cys7-12粗品。最后采用HPLC（C8柱）进行分离纯化，获得蛋白溶菌素精品。
按照本发明的方案，以Rink Amide MBHA树脂为起始原料，依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，获得保护的十七肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团的方法，包括如下步骤：
（1）Fmoc-Arg(Pbf)-树脂的制备
Rink Amide MBHA树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干，加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。加入溶于DMF的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的Rink Amide MBHA树脂取代量为：0.3-0.6mmol/g；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（2）Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（3）Fmoc-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Val-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（4）Fmoc-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Cys(Trt)-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（5）Fmoc-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Val-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（6）Fmoc-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Cys(Acm)-OH、HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（7）Fmoc-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Phe-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（8）Fmoc-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（9）Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（10）Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物进行接肽22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（11）Fmoc-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly -Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Cys(Acm)-OH、HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（12）Fmoc-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly -Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Tyr(tBu)-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（13）Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val- Cys(Trt) -Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Cys(Trt)-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（14）Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys (Acm)-Val- Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Leu-OH、HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（15）Fmoc-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val -Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（16）Fmoc-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm) -Val -Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃进行接肽反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（17）Boc-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf) -Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Boc-Arg-OH·HCl·H2O，DIC，HOBT，将混合物20-22℃进行接肽反应12小时。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
再用无水甲醇洗涤三次；抽干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得保护17肽树脂；
所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（18）H-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys(H)-Tyr-Cys(Acm)-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(H)-Val -Gly-Arg-NH2的制备
保护的十七肽树脂转移到切肽瓶中，冷却下，边搅拌边加入切肽试剂，15-18℃继续搅拌进行切肽反应4小时。过滤，抽干，滤液加无水乙醚沉淀，得到还原型十七肽粗品；
（19）
-NH2单二硫键Cys5-14粗品的制备
将还原型十七肽粗品溶于纯化水中，在搅拌下缓慢加入1mol/L氨水，调节pH至8.5～10.0，加双氧水50ml搅拌30分钟（HPLC跟踪反应进程），加醋酸到pH=5～6，过滤除去不溶物；
粗品溶于纯化水中浓度为：1.5-2.5mg/ml；
用氨水调节pH范围为：8.5～10.0；
（20）双二硫键Cys5-14 Cys7-12粗品的制备
在单二硫键Cys5-14粗品的水溶液中，在搅拌下缓慢加入碘的甲醇溶液，搅拌约60分钟，HPLC跟踪反应进程，滴加10％硫代硫酸钠溶液终止反应。减压除去甲醇后，用四氯化碳提取回收碘4次，用0.4μm膜过滤；
碘的甲醇溶液浓度为：126g碘溶于1000ml甲醇；
按照本发明优选的技术方案，分离纯化包括如下步骤：
滤液经C8填料柱分离纯化，流动相为：磷酸三乙胺/乙腈；流速为：500-600ml/min；检测波长为：260-280nm；用HPLC跟踪收集所需要的流出液，将符合要求的流出液合并、浓缩、去盐，用0.1mol/L盐酸调节至pH=3.0，然后浓缩、冻干，获得蛋白溶菌素精品。
由上述公开的技术方案可见，本发明采用Rink Amide MBHA树脂为起始原料，HBTU/HOBt为缩合剂，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，最后一个氨基酸使用Boc-Arg-OH·HCl，获得保护的十七肽树脂，然后加入切肽试剂进行切肽，加入乙醚沉淀，获得还原型粗品。5-位和14-位Cys的-SH基用Trt保护，并在pH为8.5～10.0的条件下用双氧水氧化；7-位和12-位Cys的-SH基用Acm保护，并在甲醇溶液中用碘氧化，获得双二硫键Cys5-14 Cys7-12粗品，最后采用HPLC（C8柱）进行分离纯化，获得目标产物，纯度为99.21％，总收率为23.68%。本发明的方法，生产成本低，工艺简单，环境污染低，产率高。本发明的方法便于工业化实施，具有较大的产业化前景。
具体实施方式
实施例和前述过程中所采用的原料列表如下：
No 品 名 生产厂商
1 Fmoc-Arg(Pbf)-OH（MW：648.8） 四川三高生化股份有限公司
2 Fmoc-Gly-OH（MW:297.3） 四川三高生化股份有限公司
3 Fmoc-Leu-OH（MW:353.4） 四川三高生化股份有限公司
4 Fmoc-Cys(Trt)-OH（MW:585.7） 四川三高生化股份有限公司
5 Fmoc-Cys(Acm)-OH(MW:414.5) 四川三高生化股份有限公司
6 Fmoc-Tyr(tBu)-OH（MW:459.5） 四川三高生化股份有限公司
7 Fmoc-Phe-OH（MW:387.4） 四川三高生化股份有限公司
8 Fmoc-Val-OH（MW:339.4） 四川三高生化股份有限公司
9 Boc-Arg·HCl·H2O 四川三高生化股份有限公司
10 Rink Amide MBHA树脂 天津和成科技有限公司
11 1-羟基苯并三氮唑(HOBt) 四川三高生化股份有限公司
12 TBTU（O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐） 四川三高生化股份有限公司
13 DIC (N,N-二异丙基碳二亚胺) 苏州永拓医药科技有限公司
14 三氟乙酸(TFA) 上海金锦乐实业有限公司
15 三异丙基硅烷(TIS) 上海邦成化工有限公司
16 乙二硫醇(EDT) 上海嘉辰化工有限公司
17 N-甲基吗啡啉(NMM) 上海科帆化工有限公司
18 二甲基甲酰胺(DMF) 上海金锦乐实业有限公司
19 无水甲醇(MeOH) 上海振兴化工一厂
20 六氢吡啶(PIP) 上海金锦乐实业有限公司
实施例1
（1）Fmoc-Arg(Pbf)-树脂的制备
称取 Rink Amide MBHA树脂200克(200目，0.50mmol/g，100mmol)，用2000mlDMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干。加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Arg(Pbf)-OH (MW：648.8，200mmol)130g，HBTU (MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（2）Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，200mmol)59.5g，HBTU(MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（3）Fmoc-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Val-OH(MW:339.4，200mmol)67.9g，HBTU(MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（4）Fmoc-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW:585.7，200mmol)117.1g，HBTU (MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（5）Fmoc-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Val-OH(MW: 339.4，200mmol)67.9g，HBTU(MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（6）Fmoc-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Cys(Acm)-OH(414.5，200mmol) 82.9g、HBTU(MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（7）Fmoc-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Phe-OH(387.4，200mmol) 77.5g、HBTU(MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（8）Fmoc-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(MW：648.8，200mmol)130g，HBTU (MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（9）Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，200mmol)59.5g，HBTU(MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（10）Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Arg(Pbf)-OH（MW：648.8，200mmol)130g，HBTU (MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（11）Fmoc-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Cys(Acm)-OH(414.5，200mmol) 82.9g、HBTU(MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（12）Fmoc-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly -Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Tyr(tBu)-OH(459.5，200mmol) 91.9g、HBTU(MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（13）Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val- Cys(Trt) -Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW:585.7，200mmol)117.1g，HBTU (MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应1小时。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（14）Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys (Acm)-Val-Cys(Trt) -Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Leu-OH(353.4，200mmol) 70.7g、HBTU(MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（15）Fmoc-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val- Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，200mmol)59.5g，HBTU(MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（16）Fmoc-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm) -Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，200mmol)59.5g，HBTU(MW:321，200mmol) 64.2g，HOBT (MW:153.1，200mmol)30.6g，NMM 50ml (MW=101.2)，将混合物22-24℃反应70分钟。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
（17）Boc-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm) -Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入1600毫升23%六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟。抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
加入溶于1600ml DMF的Boc-Arg-OH·HCl·H2O（MW：328.8，300mmol)98.6g，DIC (MW:126.2，300mmol) 37.9g，HOBT(MW:153.1，300mmol)45.9g，将混合物20-22℃反应12小时。抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干。
再用无水甲醇洗涤三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得保护17肽树脂540g。收率为：98.26%〔(540-200)/3460.19保护 17 肽分子量/100mmol树脂投料量=98.26%〕。
（18）H-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys(H)-Tyr-Cys(Acm)-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(H)-Val -Gly -Arg-NH2的制备
保护的17肽树脂转移到切肽瓶中，冷却下，边搅拌边加入切肽试剂：（TFA/TIS/EDT/H2O＝3600ml/160ml/100ml/40ml），15-18℃继续搅拌进行切肽反应4.0小时。过滤，抽干，滤液加无水乙醚沉淀。得还原型17肽195g粗品，收率为：95.28％（195 / 2046.5117 肽分子量 / 100mmol树脂投料量=95.28％）。
（19)
-NH2单二硫键Cys5-14粗品的制备
将还原型17肽粗品溶于纯化水中（浓度为2mg/ml），在搅拌下缓慢加入1mol/L氨水，调节PH至8.5～10.0，加双氧水50ml搅拌30分钟，用HPLC跟踪反应进程，加醋酸到pH=5～6，过滤除去不溶物。
（20）
双二硫键Cys5-14 Cys7-12粗品的制备
在单二硫键Cys5-14粗品的水溶液中，在搅拌下缓慢加入碘的甲醇溶液（126g溶于1000甲醇），搅拌约60分钟（HPLC跟踪反应进程），滴加10％硫代硫酸钠溶液终止反应。减压除去甲醇后，用四氯化碳提取回收碘4次。再用0.4μm膜过滤。
（21）分离纯化
滤液经C8柱（10μ，200Å，15×25cm）分离纯化，流动相：0.16M磷酸三乙胺：乙腈(75～85.5：25～14.5)；流速为：600ml/min；检测波长为：280nm；用HPLC跟踪收集所需要的流出液，将符合要求的流出液合并、浓缩、去盐，用0.1mol/L盐酸调节至pH=3.0，然后浓缩、冻干，获得45g蛋白溶菌素精品，纯度为99.21％，总收率为：23.68%（45g / 1900.32蛋白溶菌素分子量/100mmol树脂投料量=23.68％）。
<110> 上海苏豪逸明制药有限公司,周逸明,崔颀
<120> 一种固相多肽合成蛋白溶菌素的制备方法
<140> 201110183315.0
<160> 1
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 合成肽
<400> 1
Arg Gly Gly Leu Cys Tyr Cys Arg Gly Arg Phe Cys Val Cys Val Gly Arg
1 5 10 15

Claims (3)

1.一种固相多肽合成蛋白溶菌素的制备方法，包括如下步骤：
以Rink Amide MBHA树脂为起始原料，HBTU/HOBt为缩合剂，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，最后一个氨基酸使用Boc-Arg-OH·HCl，获得保护的十七肽树脂，然后加入切肽试剂进行切肽，加入乙醚沉淀，获得还原型粗品；5-位和14-位Cys的-SH基用Trt保护，并在pH为8.5～10.0的条件下用双氧水氧化；7-位和12-位Cys的-SH基用Acm保护，并在甲醇溶液中用碘氧化，获得双二硫键Cys5-14 Cys7-12粗品，最后采用高效液相C8柱进行分离纯化，获得目标产物；
所说的依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，获得保护十七肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团的方法，包括如下步骤：
（1）Fmoc-Arg(Pbf)-树脂的制备
Rink Amide MBHA树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干，加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的Rink Amide MBHA树脂取代量为：0.3-0.6mmol/g；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（2）Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（3）Fmoc-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Val-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（4）Fmoc-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Cys(Trt)-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（5）Fmoc-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Val-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃反应接肽70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（6）Fmoc-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Cys(Acm)-OH、HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（7）Fmoc-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Phe-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（8）Fmoc-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（9）Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（10）Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（11）Fmoc-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly -Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Cys(Acm)-OH、HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（12）Fmoc-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly- Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Tyr(tBu)-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（13）Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt) -Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Cys(Trt)-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应1小时；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（14）Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys (Acm)-Val- Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Leu-OH、HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（15）Fmoc-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val -Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（16）Fmoc-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm) -Val -Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU，HOBT，NMM，将混合物22-24℃接肽反应70分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（17）Boc-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm) -Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24℃反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
加入溶于DMF的Boc-Arg-OH·HCl·H2O，DIC，HOBT，将混合物20-22℃接肽反应11小时；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；
再用无水甲醇洗涤三次；抽干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得保护17肽树脂；
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为：22-24%；
六氢吡啶的反应温度为22-24℃；
（18）H-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys(H)-Tyr-Cys(Acm)-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(H)-Val -Gly -Arg-NH2的制备
保护的十七肽树脂转移到切肽瓶中，冷却下，边搅拌边加入切肽试剂，15-18℃搅拌下进行切肽反应3.5-4.5小时；过滤，抽干，滤液加无水乙醚沉淀，得到还原型十七肽粗品；
（19） -NH2单二硫键Cys5-14粗品的制备
将还原型十七肽粗品溶于纯化水中，在搅拌下缓慢加入1mol/L氨水，调节pH至8.5～10.0，加双氧水50ml搅拌30分钟，HPLC跟踪反应进程，加醋酸到pH=5～6，过滤除去不溶物；
粗品溶于纯化水中浓度为：1.5-2.5mg/ml；
用氨水调节pH范围为：8.5～10.0；
（20）双二硫键Cys5-14 Cys7-12粗品的制备
在单二硫键Cys5-14粗品的水溶液中，在搅拌下缓慢加入碘的甲醇溶液，搅拌约60分钟，HPLC跟踪反应进程，滴加10％硫代硫酸钠溶液终止反应；减压除去甲醇后，用四氯化碳提取回收碘4次，用0.4μm膜过滤；
碘的甲醇溶液浓度为：126g碘溶于1000ml甲醇；
（21）分离纯化
滤液经C8填料柱分离纯化，流动相为：磷酸三乙胺/乙腈；流速为：500-600ml/min；检测波长为：260-280nm；用HPLC跟踪收集所需要的流出液，将符合要求的流出液合并、浓缩、去盐，用0.1mol/L盐酸调节至pH=3.0，然后浓缩、冻干，获得蛋白溶菌素精品，所述蛋白溶菌素的英文名为Iseganan。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（18）中，所说的切肽试剂为：TFA/TIS/EDT/H2O＝3600ml/160ml/100ml/40ml；反应温度为：15～18℃；反应搅拌时间为：3.5～4.5小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（21）中，所说的流动相中：磷酸三乙胺水溶液的浓度为：0.08～0.25mol/L；磷酸三乙胺水溶液在乙腈中所占比例为：14.5～25.0；检测波长为：260-280nm；C8填料为：10μ，200Å。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Title
Development of Protegrins for the Treatment and Prevention of Oral Mucositis: Structure–Activity Relationships of Synthetic Protegrin Analogues;Chen J.等;《Biopolymers》;20001231;第55卷;第96页右栏倒数第1段到第97页左栏 *

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