2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所说的依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸,获得保护十七肽树脂,其间依次脱去Fmoc-保护基团的方法,包括如下步骤:
(1)Fmoc-Arg(Pbf)-树脂的制备
Rink Amide MBHA树脂用DMF浸泡,使树脂充分溶胀,抽干,加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Arg(Pbf)-OH,HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的Rink Amide MBHA树脂取代量为:0.3-0.6mmol/g;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(2)Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH,HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(3)Fmoc-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Val-OH,HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(4)Fmoc-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Cys(Trt)-OH,HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(5)Fmoc-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Val-OH,HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃反应接肽70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(6)Fmoc-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Cys(Acm)-OH、HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(7)Fmoc-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Phe-OH,HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(8)Fmoc-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Arg(Pbf)-OH,HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(9)Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH,HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(10)Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Arg(Pbf)-OH,HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(11)Fmoc-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly
-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Cys(Acm)-OH、HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(12)Fmoc-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-
Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Tyr(tBu)-OH,HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(13)Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)
-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Cys(Trt)-OH,HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应1小时;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(14)Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys
(Acm)-Val- Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Leu-OH、HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(15)Fmoc-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val
-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH,HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(16)Fmoc-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)
-Val -Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH,HBTU,HOBT,NMM,将混合物22-24℃接肽反应70分钟;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(17)Boc-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)
-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备
加入六氢吡啶的DMF溶液,22-24℃反应30分钟;
抽干,分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
加入溶于DMF的Boc-Arg-OH·HCl·H2O,DIC,HOBT,将混合物20-22℃接肽反应11小时;
抽干,DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次,抽干;
再用无水甲醇洗涤三次;抽干后,放入真空干燥器中干燥,称重,得保护17肽树脂;
所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为:22-24%;
六氢吡啶的反应温度为22-24℃;
(18)H-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys(H)-Tyr-Cys(Acm)-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(H)-Val
-Gly -Arg-NH2的制备
保护的十七肽树脂转移到切肽瓶中,冷却下,边搅拌边加入切肽试剂,15-18℃搅拌下进行切肽反应3.5-4.5小时;
过滤,抽干,滤液加无水乙醚沉淀,得到还原型十七肽粗品;
-Val-Gly -Arg -NH2单二硫键Cys5-14粗品的制备
将还原型十七肽粗品溶于纯化水中,在搅拌下缓慢加入1mol/L氨水,调节pH至8.5~10.0,加双氧水50ml搅拌30分钟(HPLC跟踪反应进程),加醋酸到pH=5~6,过滤除去不溶物;
粗品溶于纯化水中浓度为:1.5-2.5mg/ml;
用氨水调节pH范围为:8.5~10.0;
(20)
双二硫键Cys
5-14 Cys
7-12粗品的制备
在单二硫键Cys5-14粗品的水溶液中,在搅拌下缓慢加入碘的甲醇溶液,搅拌约60分钟,HPLC跟踪反应进程,滴加10%硫代硫酸钠溶液终止反应;减压除去甲醇后,用四氯化碳提取回收碘4次,用0.4μm膜过滤;
碘的甲醇溶液浓度为:126g碘溶于1000ml甲醇;
(21)分离纯化
滤液经C8填料柱分离纯化,流动相为:磷酸三乙胺/乙腈;流速为:500-600ml/min;检测波长为:260-280nm;用HPLC跟踪收集所需要的流出液,将符合要求的流出液合并、浓缩、去盐,用0.1mol/L盐酸调节至pH=3.0,然后浓缩、冻干,获得蛋白溶菌素精品。