CN108341883B

CN108341883B - 多肽的制备方法

Info

Publication number: CN108341883B
Application number: CN201810133794.7A
Authority: CN
Inventors: 刘河; 郭晓春; 杨惠仁; 麻建杰; 郭二明; 王兴辉
Original assignee: Aitaipu Co ltd
Current assignee: Aitaipu Co ltd
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2038-02-09
Also published as: CN108341883A

Abstract

本发明涉及一种制备多肽或其药学上可接受的盐的方法包括以下步骤：1)在固相载体上合成全保护的肽序列，得到肽树脂；2)用裂解液裂解肽树脂，得到粗肽；3)采用碘氧化法对粗肽直接进行二硫键环化反应。所述制备方法适用于大规模制备所述多肽，制备规模可达百克到千克级。

Description

多肽的制备方法

技术领域

本发明涉及多肽的制备方法，特别是一种抗肿瘤多肽ATAP-M8的大规模制备方法。

背景技术

ATAP-M8是从Bfl-1(氨基酸147-175)衍生的一个新型的双亲尾锚多肽，和在很多肿瘤细胞表面高表达的整合素受体(Integrin)高结合的iRGD结构序列融合，经结构修饰得到的融合多肽。它可有效的识别癌细胞与正常细胞，定向将多肽带入到肿瘤细胞区域，特异性杀死肿瘤细胞而降低对正常细胞的损伤。ATAP-M8是一个全新的多肽类抗癌药物，能特异性识别细胞线粒体膜，经特殊的双亲螺旋结构定位在线粒体膜上打孔，物理性破坏线粒体结构，诱导细胞凋亡。

ATAP-M8含有38个氨基酸残基，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其C末端的氨基酸(Cys)羧基为酰胺化结构，N末端的氨基酸(Lys)氨基为乙酰化结构，第30和38位的半胱氨酸巯基间生成分子内二硫键。

多肽的化学合成分为液相和固相两种方法，其中液相法适合小肽的合成，对于长肽，固相法是目前普遍采用的多肽合成方法。固相肽合成反应的原理是，将多肽序列C端的第一个氨基酸的羧基，通过缩合反应固定在不容性的载体(树脂)上，然后脱除氨基保护基，再与过量的活化后的第二个氨基酸的羧基反应，形成肽键。重复脱保护，缩合，洗涤过程，将肽链按顺序延长，最后获得所需长度的多肽序列。固相合成完成后，通过三氟乙酸将肽链从树脂上裂解下来，并同时脱除所有的侧链保护基团，再经高效液相色谱纯化，即得所需多肽。固相合成的优点是合成中最费时费力的纯化步骤，均以简单的洗涤和过滤完成，大大减轻纯化难度，具有方便快捷，操作简便和易于实现自动化的优势。

ATAP-M8由于其较长的氨基酸序列，以及活性构象α-螺旋和分子内二硫键的存在，常规的固相合成方法不能实现对其大规模的合成。

发明内容

本发明涉及ATAP-M8的大规模制备方法。该方法可制备百克级和千克级批次的ATAP-M8纯肽。应用该方法制备的ATAP-M8多肽，纯度>98.5％，可作为抗肿瘤药物临床研究的原料药。

本发明涉及一种制备SEQ ID NO.1所示多肽或其药学上可接受的盐的方法，

其中：C末端的半胱氨酸(C)羧基为酰胺化结构，N末端的赖氨酸(K)氨基为乙酰化结构，在氨基酸序列位置30和38的两个Cys(C)残基之间形成分子内二硫键，

包括以下步骤：

1)在固相载体上合成全保护的肽序列，得到肽树脂；

2)用裂解液裂解肽树脂，得到粗肽；

3)采用碘氧化法对粗肽直接进行二硫键环化反应，在氨基酸序列位置30和38的两个Cys(C)残基之间形成形成分子内二硫键。

在一个实施方案中，本发明所述的制备方法，其中，在步骤3)中对所述粗肽进行以下操作：

使用乙腈和醋酸的混合溶剂溶解粗肽，得到粗肽溶液；

向粗肽溶液中加入水，得到稀释液；

搅拌中向稀释液中逐滴加入碘甲醇溶液。

优选地，所述混合溶剂中，乙腈和醋酸的体积比为0.5～1.5:1，优选为0.8～1.2:1，更有选为0.9～1.1:1，进一步优选为1:1；

优选地，所述粗肽与混合溶剂的质量/体积比为0.5～1.5g/100mL，优选为0.8～1.2g/100mL，更有选为0.9～1.1g/100mL，进一步优选为1g/100mL；

优选地，向粗肽溶液中加入水的量为所述混合溶剂体积的0.8～1.2倍，优选向粗肽溶液中加入水的量与所述混合溶剂体积相同；

优选地，所述碘甲醇溶液的浓度为每100mL甲醇中含有0.5g～2.5g碘，优选为每100mL甲醇中含有1g～2g碘，例如每100mL甲醇中含有1.2g碘或1.5g碘。

在另一个实施方案中，本发明所述的制备方法或本发明任意适用的实施方案，其中所述裂解液为TFA、茴香硫醚、水、EDT、TIS和苯酚的混合物，其中TFA、茴香硫醚、水、EDT、TIS和苯酚之间的用量比为：14～18mL TFA:0.8～1.2mL茴香硫醚:0.8～1.2mL水:0.3～0.7mL EDT:0.1～0.3mL TIS:0.8～1.2g苯酚，进一步优选为16.3mL TFA:1mL茴香硫醚:1mL水:0.5mL EDT:0.2mL TIS:1g苯酚。

优选地，裂解液的用量为1g肽树脂加8～20mL裂解液，优选1g肽树脂加8～15mL裂解液，更优选1g肽树脂加10mL裂解液。

在另一个实施方案中，本发明所述的制备方法或本发明任意适用的实施方案，其中所述固相载体为Rink酰胺树脂，Rink Amide AM树脂或Rink Amide MBHA树脂，优选为Rink Amide AM树脂；

优选地，所述固相载体的取代度小于或等于0.33mmol/g，进一步优选小于或等于0.3mmol/g，更进一步优选小于或等于0.25mmol/g，再进一步优选小于或等于0.22mmol/g，例如0.2mmol/g。

在另一个实施方案中，本发明所述的制备方法或本发明任意适用的实施方案，其中步骤1)合成全保护的肽序列的方法包括以下步骤：

a)脱除固相载体上的氨基保护基；

b)进行缩合反应，将第一个氨基酸Cys的羧基共价连接在固相载体上；

c)脱除Fmoc保护基；

d)进行缩合反应，将第二个氨基酸Asp的羧基与已接在固相载体Cys的氨基反应形成肽键；

e)按照肽链顺序，重复步骤c)和步骤d)，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度；

f)将N末端乙酰化，

步骤a)至f)均在在氮气保护下进行。

在另一个实施方案中，本发明所述的制备方法或本发明任意适用的实施方案，其中缩合反应采用方法一或方法二进行，

方法一包括以下步骤：

1)将HOBT和保护氨基酸用DMF溶解，加入DIC活化，混合均匀，得到混合液；

2)将混合液与固相载体混合，反应，

方法二包括以下步骤：

1)向固相载体中加入DMF和DCM溶液，搅拌得到固相载体悬浮液，

2)向固相载体悬浮液加入HOBT和保护氨基酸，溶解，再加入DIC活化，混合均匀，反应。

在另一个实施方案中，本发明所述的制备方法或本发明任意适用的实施方案，其中，保护氨基酸的投料量大于或等于理论用量，

优选地，方法一中保护氨基酸的投料量大于或等于2倍理论用量，进一步优选为大于或等于3倍理论用量，

优选地，方法二中保护氨基酸的投料量大于或等于3倍理论用量，进一步优选为大于或等于5倍理论用量。

在另一个实施方案中，本发明所述的制备方法或本发明任意适用的实施方案，其中，

方法一中：DMF的用量为每kg固相载体3～5L(例如4L)，HOBT的用量为每kg固相载体45～120g(例如80g、95g或100g)，DIC的用量为每kg固相载体120～250mL(例如150ml、180mL或200mL)；

方法二中：DMF的用量为每kg固相载体2.5～5L(例如3L)，DCM的用量为每kg固相载体2.5～5L(例如3L)，HOBT的用量为每kg固相载体140～180g(例如300g、320g或350g)，DIC的用量为每kg固相载体600～1000mL(例如700ml、800mL或900mL)。

在另一个实施方案中，本发明所述的制备方法或本发明任意适用的实施方案，所述制备方法还包括纯化的步骤，环化反应后得到的液体反应液，不经冻干处理，直接采用制备型反向高效液相色谱法进行提纯，

可选地，重复所述纯化步骤，得到精制多肽。

在另一个实施方案中，本发明所述的制备方法或本发明任意适用的实施方案，所述制备方法还包括将多肽转化为盐的步骤。

本发明还涉及由权利要求1至11任一项所述的制备方法制备得到的多肽或其药学上可接受的盐。

本发明还涉及一种裂解液，其为TFA、茴香硫醚、水、EDT、TIS和苯酚的混合物，其中TFA、茴香硫醚、水、EDT、TIS和苯酚之间的用量比为：14～18mL TFA:0.8～1.2mL茴香硫醚:0.8～1.2mL水:0.3～0.7mL EDT:0.1～0.3mL TIS:0.8～1.2g苯酚，

优选地，TFA、茴香硫醚、水、EDT、TIS和苯酚之间的用量比为：16.3mL TFA:1mL茴香硫醚:1mL水:0.5mL EDT:0.2mLTIS:1g苯酚。

本发明所述的多肽，其序列中含有的Met，Cys，Trp等残基，对树脂裂解过程中产生的碳正离子超敏感，容易产生烷基化副产物。采用本发明所述的裂解液对肽树脂进行裂解，不易产生烷基化副产物。

在一个实施方案中，本发明所述的制备方法，包括5个步骤：1)在固相载体上合成全保护的肽序列，得到肽树脂；

2)用裂解液裂解肽树脂，得到粗肽；

3)采用碘氧化法对粗肽直接进行二硫键环化反应，在氨基酸序列位置30和38的两个Cys(C)残基之间形成形成分子内二硫键；

4)环化反应后得到液体反应液，不经冻干处理，直接采用制备型反向高效液相色谱法进行提纯；

5)重复步骤4)，得到精制多肽，将精制多肽转化为盐(例如转化为醋酸盐)，冻干。

本发明所述的制备方法或本发明任意适用的实施方案，其中所述固相载体为Rink酰胺树脂，Rink Amide AM树脂或Rink AmideMBHA树脂，优选为Rink Amide AM树脂。更为优选的固相载体为取代度为0.2mmol/g的Rink Amide AM树脂。树脂取代度低可以降低反应密度，减少肽链间空间位阻对合成的影响。

本发明所述的制备方法可以采用所述方法一或方法二进行缩合反应。特别是方法二通过提高保护氨基酸的投料量，稀释反应液浓度，改变加料顺序，能够克服在固相合成过程中出现的树脂收缩现象。

本发明的制备方法中，反应过程中充入高纯氮气，能够隔绝氧气，避免Met在反应过程中被氧化，进一步提高产品纯度。

多肽合成中形成二硫键的方法很多，如空气氧化法，铁氰化钾氧化法，碘氧化法，三氟乙酸铊氧化法，二甲基亚砜(DMSO)氧化法，氰化碘(ICN)氧化法等等。

本发明人经过研究后发现，空气氧化法效率低，不适合大规模合成；DMSO氧化法需要在低浓度溶液中反应，高浓度容易形成分子间二硫键，操作繁琐，后处理困难，不适合大量合成；铁氰化钾氧化法和三氟乙酸铊氧化法等虽然反应迅速，但后处理繁琐，且产生有毒废水，不利于环保。

本发明采用碘氧化法进行二硫键环化反应，该法反应快捷、操作简便、收率高，适合大规模合成制备。本发明人同时发现，在树脂上进行二硫键环化的方法不适合本发明所述多肽的合成，先环化再序列延长的方法不能得到目标产物；全序列合成后在树脂上环化，反应时间长，收率低，副产物多，纯度低。裂解后的粗肽，纯化后再环化，结果得到的未环化纯肽不稳定，很快降解产生未知杂质，环化收率低，步骤繁琐。本发明将肽树脂裂解后的粗肽不经纯化直接进行二硫键环化，应用碘氧化方法，反应快速，操作简便，后处理简单，收率高，适合大规模合成制备。

将环化后的液体反应液，不经冻干处理，直接采用制备型反向高效液相色谱法进行一次纯化，得到大约98％纯度的产品。

一次纯化产品不经冻干，直接再经制备型反向高效液相色谱法进行二次纯化，同时转盐后得到纯肽，冻干后得纯肽醋酸盐，终产品纯度>98.5％，例如纯度可达99.1％，单杂<0.4％。

本发明所述制备方法适用于大规模制备所述多肽。该方法的制备规模可达百克到千克级。本发明所述方法的总收率，以环化前的粗肽产品计算，所得一次纯化样品纯度大于98.0％，单杂<1.0％的收率为13％-15％；二次纯化后的纯肽醋酸盐，纯度>99.0％，单杂<0.4％，纯肽总收率>11％。可作为临床治疗癌症的原料药使用。

本文中，所使用的术语“取代度”是指每一克树脂上面含有的活性位点的毫摩尔数。

本文中，所使用的术语“保护氨基酸”是指氨基被Fmoc保护和/或羧基被酸敏感保护基团保护的氨基酸。所述酸敏感保护基团可以是叔丁基(tBu)，三苯甲基(Trt)，叔丁氧羰基(Boc)，2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)，或2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)。示例性的保护氨基酸包括但不限于：Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH。

本文中，所述的“理论用量”是指保护氨基酸的理论用量，即，固相载体中的活性位点与保护氨基酸完全反应所需要的保护氨基酸的用量。

本文中，“药学上可接受的盐”是指保留目标化合物的所需生物活性并表现出最小的不希望的毒理学效应的盐。例如所述多肽的盐酸盐、醋酸盐、硫酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、硝酸盐等，优选为醋酸盐。

本文中，所使用的英文缩写具有下面的含义：

Fmoc：笏甲氧羰基；

DCM：Dichloromethane，二氯甲烷；

DMF：N,N-Dimethylformamide，N,N-二甲基甲酰胺；

DIC：N,N-diisopropylcarbodiimide，N,N-二异丙基碳二亚胺；

DIEA：N,N-Diisopropylethylamine，N,N-二异丙基乙胺；

HOBT：1-Hydroxybenzotriazole，1-羟基苯并三唑；

TFA：Trifluoroacetic acid，三氟乙酸；

EDT：乙二硫醇

TIS：Tris-isopropylsilane，三异丙基硅烷。

本发明所涉及的氨基酸符号如下表所示：

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1ATAP-M8 38肽的制备

1.1固相肽合成

反应釜砂芯清洗，用无水乙醇浸泡过夜，然后用清水冲洗至洁净，最后用无水乙醇洗两遍，抽干备用。环境温度控制在25±2℃，脱Fmoc和氨基酸缩合过程需要全程高纯氮气鼓泡。

树脂改造：称量2kg Rink Amide AM树脂(取代度0.33mmol/g)，加入至100L多肽合成反应釜中，量取25L DCM加入至反应釜，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，溶胀过夜。脱Fmoc保护基：抽取18L20％(v/v)哌啶/DMF溶液到抽干的反应釜中，搅拌30min。洗涤：用18L DMF到抽干的反应釜中，搅拌然后抽干，重复操作5遍。

缩合反应：将240g Fmoc-Cys(Trt)-OH(按树脂取代度0.20mmol/g计算)和90gHOBT放于10L烧杯中，加6.5L DMF将其溶解，再加入300mL DIC活化，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应釜中搅拌反应4h。洗涤：抽取18L DMF到抽干的反应釜中搅拌然后抽干，重复操作3遍。

树脂封头：配制醋酸酐:DIEA:DMF＝1:1:2(体积比)16L，将其加入到抽干的反应釜中，搅拌反应1h。洗涤：抽取18L DMF到抽干的反应釜中搅拌然后抽干，重复操作3遍。茚三酮检测，树脂无色。Rink Amide AM树脂取代度降低为0.2mmol/g。

肽链延长：上述改造后的树脂，连接上了第一个氨基酸Cys，后续的保护氨基酸，按照肽链顺序，依次缩合反应到树脂上。所用到的保护氨基酸分别为：Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH。反应过程如下：1)脱保护基：抽取18L 20％哌啶/DMF溶液到抽干的反应釜中，搅拌30min；洗涤：抽取18L DMF到抽干的反应釜中搅拌然后抽干，重复操作5遍。茚三酮检测：用长吸管吸取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B(检测剂A为20g苯酚溶解于150mL无水乙醇中得到的溶液；检测剂B为5g茚三酮溶解于100ml无水乙醇中得到的溶液)各两滴置100℃的水浴中20s，树脂显色。2)缩合反应：将493g(3倍量)Fmoc-Asp(OtBu)-OH和190g HOBT放于20L烧杯中，加8L DMF将其溶解，再加入400mL DIC活化，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应釜反应4h。茚三酮检测：用长吸管吸取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴置100℃的水浴中20s，树脂无色，表明反应完全。洗涤：抽取用18LDMF到抽干的反应釜中搅拌然后抽干，重复操作3遍。

对于产生树脂收缩的氨基酸，反应过程如下：1)脱保护基：抽取18L 20％哌啶/DMF溶液到抽干的反应釜中，搅拌30min；洗涤：抽取18L DMF到抽干的反应釜中搅拌然后抽干，重复操作5遍；茚三酮检测：用长吸管吸取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴置100℃的水浴中20s，树脂显色。2)缩合反应：首先向抽干的反应釜中加入6L DMF和6LDCM溶液，将肽树脂搅拌悬浮，然后加入5倍量的保护氨基酸和320g HOBT溶解，再加入700mLDIC活化，混合均匀，反应5h。茚三酮检测：用长吸管吸取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴置100℃的水浴中20s，树脂无色，表明反应完全。洗涤：抽取用18L DMF到抽干的反应釜中搅拌然后抽干，重复操作3遍。

N端乙酰化：第38个保护氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH反应完成后，洗涤完全。脱Fmoc：抽取18L 20％哌啶/DMF溶液到抽干的反应釜中，搅拌30min。洗涤：抽取18L DMF到抽干的反应釜中搅拌然后抽干，重复操作5遍。封闭反应：配好3L乙酸酐+3L DIEA+6L DMF加入到反应釜中反应1h。反应完成后，用长勺捞取10-20颗树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴置100℃的水浴中20s，树脂无色。洗涤：抽取用18L DMF到抽干的反应釜中搅拌然后抽干，重复操作3遍。

肽树脂干燥：向抽干的反应器中加入30L DCM溶液搅拌5min，用真空水泵将DCM抽掉，重复操作3次。再用20L的乙醚洗涤3次，抽干过夜。第二天取出树脂放在通风橱里晾干，装瓶保存。增重后的树脂肽的重量为4776g。

1.2肽树脂裂解

裂解液配制：81.5mL TFA+5mL茴香硫醚+5mL水+2.5mLEDT+5g苯酚+1mL TIS，备用。配置量一般为1g肽树脂加10mL裂解液。

肽树脂裂解：固相合成的肽树脂增重较多，分成四个1000g和一次776g进行裂解反应。反应过程如下：称取树脂肽1000g加入到20L反应器中，加入配制好的裂解液10L，搅拌反应1h。裂解结束后，将反应液抽滤到5L的抽滤瓶中，再将切割液分到事先准备好冰乙醚的烧杯中，将析出粗品的乙醚倒入5L的砂芯漏斗中进行抽滤，再用乙醚进行洗涤完后，抽干。加水溶解后冻干，得粗肽产品396g。

粗肽HPLC纯度分析：

色谱柱：luna C18，3μm，4.6I.D.×150[mm](phenomenex)

流动相:A：0.1％(v/v)TFA/水

B：0.1％(v/v)TFA/乙腈

波长：214nm

流速：1mL/min

分析梯度

进样量：20μl

粗肽主峰保留时间大约为20min，纯度为62.49％。

1.3二硫键环化

称取39g粗肽样品，置于5L玻璃烧杯中，加入1900mL乙腈，1900mL醋酸，使得样品溶解，然后加水稀释一倍。将烧杯放于磁力搅拌器上搅拌，逐滴加入配制好的碘甲醇溶液(1.2g碘溶于100ml甲醇中)至样品溶液微黄，取样进行MS检测。环化完成。

1.4粗肽的一次纯化(粗制)

仪器设备：

大制备型HPLC，DAC150，江苏迪沃特仪器设备科技有限公司；

大型制备HPLC，LC6000，北京创新通恒科技有限公司；

LC-MS，LC-MS-2020，岛津仪器；

分析型HPLC，Agilent1200，Agilent；

0.5M²冷冻干燥机，GD-0.5M²，阴市新申宝科技有限公司；

分析柱luna C18(2)，3μm，4.6I.D.×150[mm](phenomenex)

制备条件：

大制备柱Daisogel C18，8μm，150mmI.D.×250[mm](Daisoco.Ltd)

流动相A：0.1％(v/v)TFA/水，25L

流动相B：0.1％(v/v)TFA/乙腈，25L

梯度制备：

波长：214nm

流速：350mL/min

制备：环化反应完成后的粗肽样品，直接由A泵以450mL/min的流速将样品进样。上样结束后，用15％的B相平衡直至醋酸峰完全出完，开始运行制备梯度。程序出峰结束，质谱确认主峰为目标产物后，停止制备程序，停泵后用350mL/min，80％B相冲洗10min，350mL/min，100％甲醇冲洗15min。

制备后分析

流动相：A：0.1％TFA/水

B：0.1％TFA/乙腈

波长：214nm

流速：0.8mL/min

分析程序：

合并峰形，集中各管的样品溶液，进行图谱分析。

粗制后纯度：98.2％，单杂0.8％。分析后，确认合格的产品合并冻干。

粗制样品纯度大于98.0％，单杂小于1.0％的收率为13％-15％。

1.5精制及转盐

所用仪器设备同1.4粗制。

开机平衡基线：以80％B相平衡10min，15％B相平衡10min。然后将A相更换为0.01M醋酸铵水溶液。

流动相A：0.1％(v/v)醋酸/水25L

流动相B：0.1％(v/v)醋酸/乙腈25L

流速：350mL/min

上样：将粗制纯度达到98％以上的样品，用10％的乙腈水溶解，上样。然后，将A相改为0.01M醋酸铵水溶液。与B相0.1％醋酸/乙腈搭配，5％的B相平衡15min。再将A相更换为0.1％醋酸/水进行运行梯度程序。

制备：

制备后分析：

分析流速：1mL/min

分析柱：Kinetex C18 2.6μm 4.6I.D.×150[mm](phenomenex)

精制后的纯肽，纯度99.1％，单杂<0.4％。分别收集合格样品溶液，冻干后得纯肽醋酸盐。

本工艺总收率，以环化前的粗肽产品计算，精制后的纯肽醋酸盐，纯度99.1％，单杂<0.4％的纯肽总收率>11％。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京爱泰浦生物医药科技有限责任公司

<120> 多肽的制备方法

<130> IDC180027

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> ACETYLATION

<220>

<221> DISULFID

<222> (30)..(38)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (38)..(38)

<223> AMIDATION

<400> 1

Lys Lys Phe Glu Pro Lys Ser Gly Trp Met Thr Phe Leu Glu Val Thr

1 5 10 15

Gly Lys Ile Ala Glu Met Leu Ser Leu Leu Lys Gln Tyr Cys Arg Gly

20 25 30

Asp Lys Gly Pro Asp Cys

35

Claims

1.一种裂解液，其为TFA、茴香硫醚、水、EDT、TIS和苯酚的混合物，其中TFA、茴香硫醚、水、EDT、TIS和苯酚之间的用量比为：14～18mL TFA:0.8～1.2mL茴香硫醚:0.8～1.2mL水:0.3～0.7mL EDT:0.1～0.3mL TIS:0.8～1.2g苯酚。

2.权利要求1所述的裂解液，其中TFA、茴香硫醚、水、EDT、TIS和苯酚之间的用量比为：16.3mL TFA:1mL茴香硫醚:1mL水:0.5mL EDT:0.2mL TIS:1g苯酚。

3.一种制备SEQ ID NO.1所示多肽或其药学上可接受的盐的方法，

包括以下步骤：

1)在固相载体上合成全保护的肽序列，得到肽树脂；

2)用裂解液裂解肽树脂，得到粗肽；

3)采用碘氧化法对粗肽直接进行二硫键环化反应，在氨基酸序列位置30和38的两个Cys(C)残基之间形成形成分子内二硫键，

所述裂解液为权利要求1或2所述的裂解液，其中在步骤3)中对所述粗肽进行以下操作：

使用乙腈和醋酸的混合溶剂溶解粗肽，得到粗肽溶液；

向粗肽溶液中加入水，得到稀释液；

搅拌中向稀释液中逐滴加入碘甲醇溶液，所述混合溶剂中，乙腈和醋酸的体积比为0.5～1.5:1，

所述粗肽与混合溶剂的质量/体积比为0.5～1.5g/100mL，

向粗肽溶液中加入水的量为所述混合溶剂体积的0.8～1.2倍，

所述碘甲醇溶液的浓度为每100mL甲醇中含有0.5g～2.5g碘，

裂解液的用量为1g肽树脂加8～20mL裂解液。

4.权利要求3所述的制备方法，其中所述混合溶剂中，乙腈和醋酸的体积比为0.8～1.2:1。

5.权利要求4所述的制备方法，其中所述混合溶剂中，乙腈和醋酸的体积比为0.9～1.1:1。

6.权利要求5所述的制备方法，其中所述混合溶剂中，乙腈和醋酸的体积比为1:1。

7.权利要求3所述的制备方法，其中所述粗肽与混合溶剂的质量/体积比为0.8～1.2g/100mL。

8.权利要求7所述的制备方法，其中所述粗肽与混合溶剂的质量/体积比为0.9～1.1g/100mL。

9.权利要求8所述的制备方法，其中所述粗肽与混合溶剂的质量/体积比为1g/100mL。

10.权利要求3所述的制备方法，其中向粗肽溶液中加入水的量与所述混合溶剂体积相同。

11.权利要求3所述的制备方法，其中所述碘甲醇溶液的浓度为每100mL甲醇中含有1g～2g碘。

12.权利要求11所述的制备方法，其中所述碘甲醇溶液的浓度为每100mL甲醇中含有1.2g碘或1.5g碘。

13.权利要求3所述的制备方法，其中，裂解液的用量为1g肽树脂加8～15mL裂解液。

14.权利要求13所述的制备方法，其中，裂解液的用量为1g肽树脂加10mL裂解液。

15.权利要求3所述的制备方法，其中所述固相载体为Rink酰胺树脂，Rink Amide AM树脂或Rink Amide MBHA树脂。

16.权利要求15所述的制备方法，其中所述固相载体为Rink Amide AM树脂。

17.权利要求16所述的制备方法，其中所述固相载体的取代度小于或等于0.33mmol/g。

18.权利要求17所述的制备方法，其中所述固相载体的取代度小于或等于0.3mmol/g。

19.权利要求18所述的制备方法，其中所述固相载体的取代度小于或等于0.25mmol/g。

20.权利要求19所述的制备方法，其中所述固相载体的取代度小于或等于0.22mmol/g。

21.权利要求20所述的制备方法，其中所述固相载体的取代度为0.2mmol/g。

22.权利要求3所述的制备方法，其中步骤1)合成全保护的肽序列的方法包括以下步骤：

a)脱除固相载体上的氨基保护基；

b)进行缩合反应，将第一个氨基酸Cys共价连接在固相载体上；

c)脱除Fmoc保护基；

e)后续的保护氨基酸按照肽链顺序，重复步骤c)和步骤d)，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度；

f)将N末端乙酰化，

步骤a)至f)均在在氮气保护下进行。

23.权利要求22所述的制备方法，其中缩合反应采用方法一或方法二进行，

方法一包括以下步骤：

2)将混合液与固相载体混合，反应；

方法二包括以下步骤：

24.权利要求23所述的制备方法，其中，保护氨基酸的投料量大于或等于理论用量。

25.权利要求24所述的制备方法，方法一中保护氨基酸的投料量大于或等于2倍理论用量。

26.权利要求25所述的制备方法，方法一中保护氨基酸的投料量大于或等于3倍理论用量。

27.权利要求24所述的制备方法，方法二中保护氨基酸的投料量大于或等于3倍理论用量。

28.权利要求27所述的制备方法，方法二中保护氨基酸的投料量大于或等于5倍理论用量。

29.权利要求23所述的制备方法，其中，

方法一中：DMF的用量为每kg固相载体3～5L，HOBT的用量为每kg固相载体45～120g，DIC的用量为每kg固相载体120～250mL；

方法二中：DMF的用量为每kg固相载体2.5～5L，DCM的用量为每kg固相载体2.5～5L，HOBT的用量为每kg固相载体140～180g，DIC的用量为每kg固相载体600～1000mL。

30.权利要求29所述的制备方法，其中，

方法一中：DMF的用量为每kg固相载体4L，HOBT的用量为每kg固相载体80g、95g或100g，DIC的用量为每kg固相载体150ml、180mL或200mL；

方法二中：DMF的用量为每kg固相载体3L，DCM的用量为每kg固相载体3L，HOBT的用量为每kg固相载体300g、320g或350g，DIC的用量为每kg固相载体700ml、800mL或900mL。

31.权利要求3至30任一项所述的制备方法，该方法还包括纯化的步骤，环化反应后得到的液体反应液，不经冻干处理，直接采用制备型反向高效液相色谱法进行提纯。

32.权利要求31所述的制备方法，该方法还包括：重复所述纯化步骤，得到精制多肽。

33.权利要求3至30任一项所述的制备方法，该方法还包括将多肽转化为盐的步骤。

34.权利要求3至30任一项所述的制备方法，其中所述药学上可接受的盐为所述多肽的醋酸盐。