CN106519009B - 一种乌拉立肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽合成技术领域，公开了一种乌拉立肽的制备方法，包括以下步骤：1)合成全保护线性肽树脂；2)裂解得到线性肽；3)氧化得到乌拉立肽；4)纯化，转盐，冻干得乌拉立肽精品。本发明方法工艺简单，能够降低乌拉立肽的合成难度，合成得到的乌拉立肽收率高，成本较低，纯度在98％以上，利于推广。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，尤其涉及一种乌拉立肽的制备方法。
背景技术
乌拉立肽是32个氨基酸残基组成的促尿钠排泄环肽，最初是在1988年由Schulz-Knappe等从尿液中分离得到的一种属于心房钠尿肽(atrial natriureticpeptide，ANP)家族的肾利钠肽。内源性乌拉立肽在肾远端肾小管细胞合成，由管腔后分泌，在内部髓集合管与下游利钠肽A型受体结合，能够调节肾脏钠和水的排泄，因此乌拉立肽有舒张血管和利钠利尿的作用，并且已证实乌拉立肽能够降低肾脏对尿液的重吸收。临床上治疗失代偿性心力衰竭(DHF)是以缓解症状和稳定病人的血液动力学为目标，目前使用的治疗药物包括利尿剂、血管舒张药和增强收缩力药物，然而这些药物都存在临床局限性。二期临床研究表明，乌拉立肽能降低心脏充盈压力和改善呼吸困难，且对DHF患者的肾脏功能没有明显的不良影响，可见乌拉立肽在治疗DHF中有广阔前景。
但是目前，乌拉立肽的制备工艺较为复杂，由于合成难度高，成本高，收率较低，获得的成品纯度低。
申请号为CN201410027928.9的中国专利公开了一种乌拉立肽的纯化方法，通过优化条件得到合适的柱分离条件，进一步放大到动态轴向压缩工业制备色谱系统上分离，得到高纯度的乌拉立肽。该发明的优点是，粗品直接使用动态轴向压缩工业制备色谱分离即可达到较好的分离提纯效果，操作简单，周期短，效率高。
但是上述方法并未对乌拉立肽的合成阶段工艺进行改进，因此无法提高乌拉立肽合成的收率，并且获得相同纯度的成品，成本更高。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种乌拉立肽的制备方法。本发明方法工艺简单，能够降低乌拉立肽的合成难度，合成得到的乌拉立肽收率高，成本较低，纯度高，利于推广。
本发明的具体技术方案为：一种乌拉立肽的制备方法，所述乌拉立肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY；
所述制备方法包括以下步骤：
1)合成全保护线性肽树脂：
以Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂作为固相载体，将所述Fmoc-Tyr(tbu)-WangResin树脂与DCM或DMF混合，鼓动或震荡或搅拌25-35min，使树脂充分溶胀，然后抽掉溶液，用DMF将Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂洗净。
向Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂中加入其2-3倍体积量的脱保护试剂反应4-6min，然后抽滤，用DMF洗涤，抽滤，再添加树脂2-3倍体积量的脱保护试剂反应8-12min，获得H-Tyr(tbu)-Wang Resin；用DMF洗净，抽掉溶液；取Fmoc-Arg(pdf)-OH与H-Tyr-(tbu)-Wang Resin通过偶联剂进行偶联，用茚三酮检测法确定反应进程，偶联不完全可延时或重复投料，偶联完全获得Fmoc-Arg(pdf)-Tyr(tbu)-WangResin；抽掉，用DMF洗净；重复上述步骤依次偶联剩余氨基酸直至N端最后一个氨基酸苏氨酸，其中13位和14位的两个Gly采用Fmoc-Gly-Gly-OH一次性偶联；加入脱保护试剂脱出N端苏氨酸Fmoc保护基团；用DMF、DCM、无水甲醇分别洗三遍收缩树脂，得到全保护线性肽树脂。
2)裂解得到线性肽：
配制裂解液将进行冷冻，所述裂解液由以下体积百分比的组分配得：TFA80-95％，茴香硫醚2-8％，EDT含量1-8％，苯酚1-4％，水1-4％；将冰裂解液和步骤1)所得的全保护直链肽树脂低温下(-10℃至10℃)混合震荡10-20min，升温至23-27℃，震荡2-4小时。
抽滤收集滤液，将滤液加入到冰乙醚中析出，沉淀，通过抽滤或离心收集沉淀物；用乙醚将所述沉淀物洗涤3-6遍，真空干燥后，得到未成环的乌拉立肽线性肽固体，测质谱MS并通过HPLC检测。
3)氧化得到乌拉立肽：
对步骤2)所得的未成环的乌拉立肽线性肽进行氧化，使多肽中两个半胱氨酸的侧链巯基搭桥成环得到乌拉立肽，具体为：
将未成环的乌拉立肽线性肽溶解到水中，将pH值调节到7-9，敞口室温下搅拌24-48h，进行自然氧化或加入辅助氧化剂氧化；用HPLC检测反应进程，直至乌拉立肽线性肽完全环化。其中，具体的环化部位为氨基酸序列中的两个半胱氨酸二硫键成环。
在环化前，乌拉立肽线性肽的结构为：TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY；在环化后，形成环状的乌拉立肽，结构为：TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY，其中，两个半胱氨酸侧链巯基(结构式中的两个C)是成环链接在一起的。
4)纯化，转盐，冻干得乌拉立肽精品：
将步骤3所得的乌拉立肽溶液用0.45μm微孔过滤板过滤；接着通过反向高效液相色谱法分离杂质，提纯收集目标峰溶液。
将所述目标峰溶液转盐形成醋酸盐形式或脱盐形成无盐多肽溶液。
然后经过浓缩、冷冻干燥后，得到乌拉立肽固体粉末；产物经MS质谱和HPLC确认。
本发明的合成主要过程为：以Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin作为固相载体(或以Wang Resin作为固相载体在树脂上偶联Fmoc-Tyr(tbu)-OH得到Fmoc-Tyr(tbu)-WangResin)，然后采用Fmoc保护策略的固相接肽法进行后续氨基酸偶联(13和14的位的两个Gly采用Fmoc-Gly-Gly-OH一次性偶联)，得到全保护线性肽树脂，用裂解液进行切割，乙醚沉淀，洗涤，干燥后得到乌拉立肽的直链，多肽氧化得到乌拉立肽粗品，再经过反相高效液相色谱法纯化、转盐、冻干得到乌拉立肽。
本发明固相液相结合，固相合成线性肽，液相氧化(环化)。本发明合成方法简单，能够降低乌拉立肽的合成难度，合成得到的乌拉立肽收率高，纯度较高。
作为优选，步骤1)中所述Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂为市购或以Wang Resin树脂作为固相载体，在Wang Resin树脂上偶联Fmoc-Tyr(tbu)-OH得到Fmoc-Tyr(tbu)-WangResin树脂。
作为优选，步骤1)中所述脱保护试剂为体积百分比为20％的DBLK溶液。
作为优选，步骤1)中所述偶联剂为DIPEA、NMM、DIC、HATU、TBTU、PYBOP、HOBT中的一种或多种组合且并不仅限于此。
作为优选，步骤1)中无水甲醇每次洗涤的时间为2-10min。
作为优选，步骤2)中所述裂解液由以下体积百分比的组分配得：TFA85％，茴香硫醚5％，EDT含量5％，苯酚3％，水2％。
作为优选，步骤3)中，将未成环的乌拉立肽线性肽溶解到水中，将pH值调节到7-8。
作为优选，步骤3)中，所述辅助氧化剂氧化为双氧水氧化或DMSO氧化或碘氧化；所述DMSO氧化具体为向未成环的乌拉立肽线性肽中加入质量浓度为1～10％的DMSO，辅助氧化30min-24h；所述双氧水氧化为向未成环的乌拉立肽线性肽中加入质量浓度为30％的双氧水溶液，双氧水溶液添加量为乌拉立肽线性肽溶液的0.05-0.15％。
作为优选，步骤3)中，采用自然氧化或双氧水氧化或DMSO氧化时，将未成环的乌拉立肽线性肽溶解到水中，将pH值调节到7-9；采用碘氧化时，将未成环的乌拉立肽线性肽溶解到水中，将pH值调节到6-7。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明方法工艺简单，能够降低乌拉立肽的合成难度，合成得到的乌拉立肽收率高，成本较低，纯度高(大于98％)，利于推广。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种乌拉立肽的制备方法，所述乌拉立肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY；
所述制备方法包括以下步骤：
1)合成全保护线性肽树脂：
以Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂作为固相载体，将所述Fmoc-Tyr(tbu)-WangResin树脂与DCM混合，鼓动30min，使树脂充分溶胀，然后抽掉溶液，用DMF将Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂洗三次。
向Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂中加入其2.5倍体积量的体积浓度为20％的DBLK溶液反应5min，然后抽滤，用DMF洗涤，抽滤，再添加树脂2.5倍体积量的体积浓度为20％的DBLK溶液反应10min，获得H-Tyr(tbu)-Wang Resin；用DMF洗六次，抽掉溶液；取Fmoc-Arg(pdf)-OH与H-Tyr-(tbu)-Wang Resin通过偶联剂HOBT+DIC进行偶联；用茚三酮检测法确定反应进程，偶联不完全可延时或重复投料，偶联完全获得Fmoc-Arg(pdf)-Tyr(tbu)-Wang Resin；抽掉，用DMF洗三次；重复上述步骤依次偶联剩余氨基酸直至N端最后一个氨基酸苏氨酸，其中13位和14位的两个Gly采用Fmoc-Gly-Gly-OH一次性偶联；加入脱保护试剂脱出N端苏氨酸Fmoc保护基团；用DMF、DCM、无水甲醇分别洗三遍(无水甲醇每次洗涤的时间为6min)收缩树脂，得到全保护线性肽树脂。
2)裂解得到线性肽：
配制裂解液将进行冷冻，所述裂解液由以下体积百分比的组分配得：TFA85％，茴香硫醚5％，EDT含量5％，苯酚3％，水2％。将冰裂解液和步骤1)所得的全保护线性肽树脂在0℃下混合震荡15min，升温至25℃，震荡3小时；
抽滤收集滤液，将滤液加入到冰乙醚中析出，沉淀，通过抽滤或离心收集沉淀物；用乙醚将所述沉淀物洗涤5遍，真空干燥后，得到未成环的乌拉立肽线性肽固体，测质谱MS并通过HPLC检测。
3)氧化得到乌拉立肽：
对步骤2)所得的未成环的乌拉立肽线性肽进行氧化，使多肽中两个半胱氨酸的侧链巯基搭桥成环得到乌拉立肽，具体为：
将未成环的乌拉立肽线性肽溶解到水中，将pH值调节到7-8，敞口室温下搅拌36h，进行自然氧化；用HPLC检测反应进程，直至乌拉立肽完全环化。
4)纯化，转盐，冻干得乌拉立肽精品：
将步骤3所得的乌拉立肽溶液用0.45μm微孔过滤板过滤；接着通过反向高效液相色谱法分离杂质，提纯收集目标峰溶液。
将所述目标峰溶液转盐形成醋酸盐形式或脱盐形成无盐多肽溶液。
然后经过浓缩、冷冻干燥后，得到乌拉立肽固体粉末；产物经MS质谱和HPLC确认。
实施例2
一种乌拉立肽的制备方法，所述乌拉立肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY；
所述制备方法包括以下步骤：
1)合成全保护线性肽树脂：
以Wang Resin树脂作为固相载体，在Wang Resin树脂上偶联Fmoc-Tyr(tbu)-OH得到Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂。以Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂作为固相载体，将所述Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂与DMF混合震荡25min，使树脂充分溶胀，然后抽掉溶液，用DMF将Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂洗三次。
向Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂中加入其2倍体积量的体积浓度为20％的DBLK溶液反应6min，然后抽滤，用DMF洗涤，抽滤，再添加树脂2倍体体积的质量浓度为20％的DBLK溶液反应12min，获得H-Tyr(tbu)-Wang Resin；用DMF洗三次，抽掉溶液；取Fmoc-Arg(pdf)-OH与H-Tyr-(tbu)-Wang Resin通过偶联剂HBTU+HOBT+NMM进行偶联，用茚三酮检测法确定反应进程，偶联不完全可延时或重复投料，偶联完全获得Fmoc-Arg(pdf)-Tyr(tbu)-Wang Resin；抽掉，用DMF洗三次；重复上述步骤依次偶联剩余氨基酸直至N端最后一个氨基酸苏氨酸；加入脱保护试剂脱出N端苏氨酸Fmoc保护基团；用DMF、DCM、无水甲醇分别洗三遍(无水甲醇每次洗涤的时间为2min)收缩树脂，得到全保护线性肽树脂。其中13位和14位的两个Gly采用Fmoc-Gly-Gly-OH一次性偶联。
2)裂解得到线性肽：
配制裂解液将进行冷冻，所述裂解液由以下体积百分比的组分配得：TFA80％，茴香硫醚8％，EDT含量8％，苯酚3％，水1％；将冰裂解液和步骤1)所得的全保护线性肽树脂在-10℃下混合震荡10min，升温至23℃，震荡4小时。
抽滤收集滤液，将滤液加入到冰乙醚中析出，沉淀，通过抽滤或离心收集沉淀物；用乙醚将所述沉淀物洗涤3遍，真空干燥后，得到未成环的乌拉立肽线性肽固体，测质谱MS并通过HPLC检测。
3)氧化得到乌拉立肽：
对步骤2)所得的未成环的乌拉立肽线性肽进行氧化，使多肽中两个半胱氨酸的侧链巯基搭桥成环得到乌拉立肽，具体为：
将未成环的乌拉立肽线性肽溶解到水中，将pH值调节到7-9，敞口室温下搅拌24h，然后进行氧化：向未成环的乌拉立肽中加入质量浓度为5.5％的DMSO，辅助氧化12h。用HPLC检测反应进程，直至乌拉立肽线性肽完全环化。
4)纯化，转盐，冻干得乌拉立肽精品：
将步骤3所得的乌拉立肽溶液用0.45μm微孔过滤板过滤；接着通过反向高效液相色谱法分离杂质，提纯收集目标峰溶液。
将所述目标峰溶液转盐形成醋酸盐形式或脱盐形成无盐多肽溶液。
然后经过浓缩、冷冻干燥后，得到乌拉立肽固体粉末；产物经MS质谱和HPLC确认。
实施例3
一种乌拉立肽的制备方法，所述乌拉立肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY；
所述制备方法包括以下步骤：
1)合成全保护线性肽树脂：
以Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂作为固相载体，将所述Fmoc-Tyr(tbu)-WangResin树脂与DCM混合，搅拌35min，使树脂充分溶胀，然后抽掉溶液，用DMF将Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂洗三次。
向Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂中加入其3倍体积量的体积浓度为20％的DBLK溶液反应4min，然后抽滤，用DMF洗涤，抽滤，再添加树脂3倍体积量的体积浓度为20％的DBLK溶液反应8min，获得H-Tyr(tbu)-Wang Resin；用DMF洗三次，抽掉溶液；取Fmoc-Arg(pdf)-OH与H-Tyr-(tbu)-Wang Resin通过偶联剂TBTU+HOBT+DIPEA进行偶联，用茚三酮检测法确定反应进程，偶联不完全可延时或重复投料，偶联完全获得Fmoc-Arg(pdf)-Tyr(tbu)-Wang Resin；抽掉，用DMF洗三次；重复上述步骤依次偶联剩余氨基酸直至N端最后一个氨基酸苏氨酸；加入脱保护试剂脱出N端苏氨酸Fmoc保护基团；用DMF、DCM、无水甲醇分别洗三遍(无水甲醇每次洗涤的时间为10min)收缩树脂，得到全保护线性肽树脂。其中13位和14位的两个Gly采用Fmoc-Gly-Gly-OH一次性偶联。
2)裂解得到线性肽：
配制裂解液将进行冷冻，所述裂解液由以下体积百分比的组分配得：TFA95％，茴香硫醚2％，EDT含量1％，苯酚1％，水1％。将冰裂解液和步骤1)所得的全保护线性肽树脂在10℃下混合震荡20min，升温至27℃，震荡2小时；
抽滤收集滤液，将滤液加入到冰乙醚中析出，沉淀，通过抽滤或离心收集沉淀物；用乙醚将所述沉淀物洗涤6遍，真空干燥后，得到未成环的乌拉立肽线性肽固体，测质谱MS并通过HPLC检测。
3)氧化得到乌拉立肽：
对步骤2)所得的未成环的乌拉立肽线性肽进行氧化，使多肽中两个半胱氨酸的侧链巯基搭桥成环得到乌拉立肽，具体为：
将未成环的乌拉立肽线性肽溶解到水中，将pH值调节到7-8，敞口室温下搅拌48h，然后添加双氧水进行氧化：向未成环的乌拉立肽线性肽中加入质量浓度为30％的双氧水溶液，双氧水溶液添加量为乌拉立肽线性肽溶液的0.05-0.15％。用HPLC检测反应进程，直至乌拉立肽线性肽完全环化。
4)纯化，转盐，冻干得乌拉立肽精品：
将步骤3所得的乌拉立肽溶液用0.45μm微孔过滤板过滤；接着通过反向高效液相色谱法分离杂质，提纯收集目标峰溶液。
将所述目标峰溶液转盐形成醋酸盐形式或脱盐形成无盐多肽溶液。
然后经过浓缩、冷冻干燥后，得到乌拉立肽固体粉末；产物经MS质谱和HPLC确认。
本发明方法制得的乌拉立肽纯度在98％以上。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州固拓生物科技有限公司
<120> 一种乌拉立肽的制备方法
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met
1 5 10 15
Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
20 25 30
Claims (1)
1.一种乌拉立肽的制备方法，其特征在于：所述乌拉立肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY；所述制备方法包括以下步骤：
1)合成全保护线性肽树脂：
以Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂作为固相载体，将所述Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂与DCM或DMF混合，鼓动或震荡或搅拌25-35min，使树脂充分溶胀，然后抽掉溶液，用DMF将Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂洗净；
向Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂中加入其2-3倍体积量的脱保护试剂反应4-6min，然后抽滤，用DMF洗涤，抽滤，再添加树脂2-3倍体积量的脱保护试剂反应8-12min，获得H-Tyr(tbu)-Wang Resin；用DMF洗净，抽掉溶液；取Fmoc-Arg(pdf)-OH与H-Tyr-(tbu)-WangResin通过偶联剂进行偶联，用茚三酮检测法确定反应进程，偶联不完全可延时或重复投料，偶联完全获得Fmoc-Arg(pdf)-Tyr(tbu)-Wang Resin；抽掉，用DMF洗净；重复上述步骤依次偶联剩余氨基酸直至N端最后一个氨基酸苏氨酸，其中13位和14位的两个Gly采用Fmoc-Gly-Gly-OH一步偶联；加入脱保护试剂脱出N端苏氨酸Fmoc保护基团；用DMF、DCM、无水甲醇分别洗三遍收缩树脂，得到全保护线性肽树脂；无水甲醇每次洗涤的时间为2-10min；
其中，所述Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂为市购或以Wang Resin树脂作为固相载体，在Wang Resin树脂上偶联Fmoc-Tyr(tbu)-OH得到Fmoc-Tyr(tbu)-Wang Resin树脂；所述脱保护试剂为体积百分比为20％的DBLK溶液；所述偶联剂为DIPEA、NMM、DIC、HATU、TBTU、PYBOP、HOBT中的一种或多种组合；
2)裂解得到线性肽：
配制裂解液将进行冷冻，所述裂解液由以下体积百分比的组分配得：TFA85％，茴香硫醚5％，EDT含量5％，苯酚3％，水2％；将冰裂解液和步骤1)所得的全保护线性肽树脂在-10℃至10℃下混合震荡10-20min，升温至23-27℃，震荡2-4小时；
抽滤，收集滤液，将滤液加入到冰乙醚中析出，沉淀，通过抽滤或离心收集沉淀物；用乙醚将所述沉淀物洗涤3-6遍，真空干燥后，得到乌拉立肽线性肽固体，测质谱MS并通过HPLC检测；
3)氧化得到乌拉立肽：
对步骤2)所得的乌拉立肽线性肽进行氧化，使多肽中两个半胱氨酸的侧链巯基搭桥成环得到乌拉立肽，具体为：
将乌拉立肽线性肽溶解到水中，将pH值调节到6-9，敞口室温下搅拌24-48h，进行自然氧化或加入辅助氧化剂氧化；用HPLC检测反应进程，直至乌拉立肽线性肽完全环化；
所述辅助氧化剂氧化为双氧水氧化或DMSO氧化或碘氧化；所述DMSO氧化具体为向未成环的乌拉立肽线性肽中加入质量浓度为1～10％的DMSO，辅助氧化30min-24h；所述双氧水氧化为向未成环的乌拉立肽线性肽中加入质量浓度为30％的双氧水溶液，双氧水溶液添加量为乌拉立肽线性肽溶液的0.05-0.15％；
采用自然氧化或双氧水氧化或DMSO氧化时，将未成环的乌拉立肽线性肽溶解到水中，将pH值调节到7-9；采用碘氧化时，将未成环的乌拉立肽线性肽溶解到水中，将pH值调节到6-7；
4)纯化，转盐，冻干得乌拉立肽精品：
将步骤3所得的乌拉立肽溶液用0.45μm微孔过滤板过滤；接着通过反向高效液相色谱法分离杂质，提纯收集目标峰溶液；
将所述目标峰溶液转盐形成醋酸盐形式或脱盐形成无盐多肽溶液；
然后经过浓缩、冷冻干燥后，得到乌拉立肽固体粉末；产物经MS质谱和HPLC确认。
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