CN104371018A - 一种乌拉立肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种乌拉立肽的纯化方法，通过优化条件得到合适的柱分离条件，进一步放大到动态轴向压缩工业制备色谱系统上分离，得到高纯度的乌拉立肽。本发明的优点是，粗品直接使用动态轴向压缩工业制备色谱分离即可达到较好的分离提纯效果，操作简单，周期短，效率高，纯度可达98%以上。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种乌拉立肽的纯化方法。
技术背景
乌拉立肽是32个氨基酸残基组成的促尿钠排泄环肽，最初是在1988年由 Schulz-Knappe等从尿液中分离得到的一种属于心房钠尿肽（atrial natriureticpeptide，ANP）家族的肾利钠肽。内源性乌拉立肽在肾远端肾小管细胞合成，由管腔后分泌，在内部髓集合管与下游利钠肽 A 型受体结合，能够调节肾脏钠和水的排泄，因此乌拉立肽有舒张血管和利钠利尿的作用，并且已证实乌拉立肽能够降低肾脏对尿液的重吸收。临床上治疗失代偿性心力衰竭（DHF）是以缓解症状和稳定病人的血液动力学为目标，目前使用的治疗药物包括利尿剂、血管舒张药和增强收缩力药物，然而这些药物都存在临床局限性。二期临床研究表明，乌拉立肽能降低心脏充盈压力和改善呼吸困难，且对 DHF 患者的肾脏功能没有明显的不良影响，可见乌拉立肽在治疗 DHF 中有广阔前景。本发明采用制备高效液相色谱法对乌拉立肽粗品分离纯化，并冷冻干燥，制备乌拉立肽纯品。
发明内容
本发明的目的在于针对目前在纯化乌拉立肽等多肽物质的过程中所存在的时间长以及纯度不高的问题，提供一种采用制备液相色谱系统纯化高纯度乌拉立肽的新方法，该方法包括以下步骤：
a.将乌拉立肽粗品溶于水后进行过滤，一般将乌拉立肽配制成饱和溶液，具体实施时，可根据实际溶解效果进行调整；
b.取配制好的乌拉立肽溶液，用填充好固定相填料的动态轴向压缩柱进行分离，收集乌拉立肽对应谱带的馏分；
c.将步骤b中收集的对应谱带洗脱液中的溶剂蒸干，即可得到色谱纯为98的乌拉立肽。
本发明的有益效果是可直接采用合成后的乌拉立肽粗品来制备，不需要大量的前处理过程，简单、易控制，工艺技术简化，适用于大规模制备。高效液相色谱测定中，纯度高于98%，完全可用于药物的开发。
具体实施方式
实施例1
1.取1g乌拉立肽粗品溶于水，配制成饱和溶液，置于过滤装置中，过滤除去固体颗粒；
2.将乌拉立肽溶液泵入动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱填充尺寸为Φ50×250mm，填料为十八烷基硅胶，粒径为10um，上样量1g。流动相的体积比为10:90~30:70梯度洗脱80min，当乌拉立肽洗脱完毕后，流动相切换成高比例乙腈，将后端杂质冲出，一个分离周期结束。采用的紫外可见光度检测器的检测波长为215nm，收集保留时间在37~45min的馏分，经HPLC分析纯度≥98.7%。
实施例2
1.取1.5g乌拉立肽粗品溶于水，配制成饱和溶液，置于过滤装置中，过滤除去固体颗粒；
2.将乌拉立肽溶液泵入动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱填充尺寸为Φ50×250mm，填料为十八烷基硅胶，粒径为10um，上样量1.5g。流动相的体积比为5:95~30:70梯度洗脱80min，当乌拉立肽洗脱完毕后，流动相切换成高比例乙腈，将后端杂质冲出，一个分离周期结束。采用的紫外可见光度检测器的检测波长为215nm，收集保留时间在42~50min的馏分，经HPLC分析纯度≥98.5%。
实施例3
1.取2.5g乌拉立肽粗品溶于水，配制成饱和溶液，置于过滤装置中，过滤除去固体颗粒；
2.将乌拉立肽溶液泵入动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱填充尺寸为Φ150×250mm，填料为十八烷基硅胶，粒径为10um，上样量2.5g。流动相的体积比为5:95~30:70梯度洗脱100min，当乌拉立肽洗脱完毕后，流动相切换成高比例乙腈，将后端杂质冲出，一个分离周期结束。采用的紫外可见光度检测器的检测波长为215nm，收集保留时间在51~59min的馏分，经HPLC分析纯度≥98.2%。
Claims (4)
1.一种乌拉立肽的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将乌拉立肽合成粗品溶于水后进行过滤，除去微小的固体不溶物，得到滤液作为分离粗品；
（2）将过滤产物通过进样泵或者进样阀注入制备色谱系统；
（3）采用乙腈/甲酸水做流动相，洗脱得到乌拉立肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的乌拉立肽粗品为固相法合成，经氧化反应成环所得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：所述色谱系统采用动态轴向压缩柱，且所填充固定相为十八烷基硅胶填料。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：流动相中乙腈与甲酸水的体积比（V/V）范围为10:90~30:70梯度洗脱。
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