CN102260323A - 固相液相结合制备比伐卢定的方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多肽的合成，尤其涉及一种固相液相结合合成比伐卢定的方法，属于多肽合成技术领域。该方法包括以下步骤：a、将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和式V反应，得式IV；b、将制得的式IV和去保护剂反应，得式III；c、通过固相合成的方法将剩余的氨基酸与式III缩合，在经过去保护基，切除树脂处理后得到比伐卢定精肽。本发明具有以下优点：工艺过程简单，生产成本低，且产品收率高。同时，避免杂质des-G，des+G的产生，所得的产品纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽的合成，尤其涉及一种固相液相结合合成比伐卢定的方法，属于多肽合成技术领域。
背景技术
多肽的合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)的一个合成过程。
凝血酶抑制剂是一种很有前途的抗血栓药，而抗凝血药比伐卢定(bivalirudin)是一个由20个氨基酸组成的多肽，分子量为2180。属于强有力的凝血酶直接抑制剂，是近年来应用于临床的较广的药物。
现有技术中比伐卢定的合成一般采用固相合成的方法：包括以下步骤：将Fmoc-L-Leu-OH绑定至Wang树脂上，脱除Fmoc保护；继续绑定下一个氨基酸，脱除Fmoc保护，重复上述步骤，直至到第1位Fmoc-D-Phe-OH脱除Fmoc保护，最终得到序列如下的比伐卢定
D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn9-Gly10-Asp11-Phe12-Glu13-Glu14-Ile15-Pro16-Glu17-Glu18-Tyr19-Leu20。但是该方法的缺陷是容易产生杂质des-G和des+G，这两个杂质在后续纯化分离的过程中很难被去除。
为解决上述固相合成方法中所存在的问题，美国专利申请(公开号：US20070093423A)中公开了一种多肽固相合成比伐卢定的方法，其采用固相液相 相 结 合 的 方 法 合 成 比 伐 卢 定 ， 其 是 将Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly和Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu两个片段耦合反应制备得到比伐卢定，但是该方法的成本较高，而且产生的杂质多，产品纯度也比较低。
发明内容
本发明针对以上现有技术中所存在的缺陷，提出成本低、工艺过程简单、且所得的产品纯度高的一种固相液相结合制备比伐卢定的方法。
本发明一种固相液相结合制备比伐卢定的方法，是通过以下技术方案得以实现，该方法包括以下步骤：
a、将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和式V所示的多肽树脂缩合反应，得到式IV所示的多肽树脂；
b、将制得的式IV所示的多肽树脂和去保护剂混合反应，得到式III所示的多肽树脂；
c、通过固相合成的方法将氨基酸自C端向N端按照Pro至Arg至Pro至Phe的顺序依次同式III所示的多肽树脂上的多肽缩合，形成式II所示的多肽树脂；
d、使制得的式II所示的多肽树脂脱除Fmoc，再加入切割剂，除去树脂，得到式I所示的多肽树脂粗品；
f、将得到的式I所示的多肽树脂粗品经过HPLC精制，得到比伐卢定精肽；
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(ot式IBu)-Phe-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ile-Pro-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Tyr(tBu)-Leu
Fmoc-D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-式IIGly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂
-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-式IIIGlu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂
Fmoc-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-式IVPhe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂
-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14式V-Ile16-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂
本发明一种固相液相结合制备比伐卢定的方法中，其中步骤a中所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH采用以下方法制得：
以Fmoc-Gly-OH与H-Gly-OH为原料，液相合成，制得Fmoc-Gly-Gly-OH，然后再与H-Gly-OH液相合成，制得Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH，最后与H-Gly-OH液相合成制得Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
更具体的说，即将Fmoc-Gly-OH与HOSu加入溶剂中，在温度为15℃～30℃的条件下，反应1～4小时，反应结束后，后处理，得固体产物，再将得到的固体与H-Gly-OH液相合成，得Fmoc-Gly-Gly-OH。再将得到的Fmoc-Gly-Gly-OH与HOSu加入溶剂中，在温度为15℃～30℃的条件下，再与H-Gly-OH液相合成，得Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH，重复上述步骤，即可制得Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。也可以将Fmoc-Gly-Gly-OH去除保护基后，再与Fmoc-Gly-Gly-OH液相反应制得Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。上述所述的Fmoc-Gly-OH、HOSu、H-Gly-OH的摩尔比为1∶1～1.5∶1～1.5；所述的Fmoc-Gly-Gly-OH、HOSu、H-Gly-OH的摩尔比为1∶1～1.5∶1～1.5；所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH、HOSu、H-Gly-OH的摩尔比为1∶1～1.5∶1～1.5；所述的Fmoc-Gly-Gly-OH、H-Gly-Gly-OH的摩尔比为1∶1～1.5。作为优选，所述的Fmoc-Gly-OH、HOSu、H-Gly-OH的摩尔比为1∶1∶1；所述的Fmoc-Gly-Gly-OH、HOSu、H-Gly-OH的摩尔比为1∶1∶1；所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH、HOSu、H-Gly-OH的摩尔比为1∶1∶1；所述的Fmoc-Gly-Gly-OH、H-Gly-Gly-OH的摩尔比为1∶1。采用上述方法，先将-Gly-Gly-Gly-Gly-用液相合成好后，再与多肽固相反应，后再制得比伐卢定。与单单采用固相法合成相比，本发明的方法能够有效的控制杂质des-G和des+G的产生，得到的产品纯度高。因为这两个杂质在后续纯化分离的过程中很难被去除，所以在反应过程中控制该杂质的产生，是有利于提高产品的质量的，同时减少后处理的难度，也大大的降低了生产成本。
本发明一种固相液相结合制备比伐卢定的方法中，其中所述的式IV所示的多肽树脂还可以采用以下方法制得：
i、将Fmoc-Gly-OH和式式V所示的多肽树脂缩合反应，得到式VI所示的多肽树脂；
ii、将制得的式VI所示的多肽树脂去除保护剂Fmoc，再与Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH缩合反应，得到式IV所示的多肽树脂；
Fmoc-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-式VIGlu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂
其中所述的式IV所示的多肽树脂还可以采用以下方法制得：
(1)、将Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和式式V所示的多肽树脂缩合反应，得到式VII所示的多肽树脂；
(2)、将制得的式VII所示的多肽树脂去除保护剂Fmoc，再与Fmoc-Gly-OH缩合反应，得到式III所示的多肽树脂；
Fmoc-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-式Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18VII-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂。利用上述的方法，同样也能有效地控制杂质des-G和des+G的产生，得到的产品纯度高。同样有利于提高产品的质量，同时减少后处理的难度，降低了生产成本。
本发明一种固相液相结合制备比伐卢定的方法中，其中步骤a中所述的缩合反应是在下列缩合剂N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、二异丙基乙胺(DIEA)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)、1-羟基苯并三唑(HOBt)中的一种或几种存在下进行反应，作为优选，所述缩合剂为N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、二异丙基乙胺(DIEA)、1-羟基苯并三唑(HOBt)中的一种或几种。采用上述的缩合剂与本发明的方法相结合，能够更有效的发挥缩合剂的作用，从而使最终整个反应能够进行完全，减少了中间杂质的存在，也有效的提高了产品的纯度，同时，制得得比法卢定收率也高。
其中步骤b中所述的去保护剂是1-羟基苯并三唑(HOBt)、5％～25％哌啶、六氢吡啶、3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)中的一种或几种，作为优选，所述的去保护剂是1-羟基苯并三唑(HOBt)、5％～25％哌啶、5％～25％(六氢吡啶)中的一种或几种。更进一步的优选，所述的去保护剂为5％～25％六氢吡啶。利用上述的去保护剂，结合本发明的方法，能够有效的使保护基脱除，又不破坏产品的结构，也不产生其它杂质，从这些方面来说，都是有利于提高产品的纯度的。
其中步骤d中所述的切割剂可以是弱酸性的溶液，作为优选，所述的切割剂为含有TFA、TIS、盐酸中的一种或几种弱酸性水溶液。才有上述的切割剂，能够有效的使树脂与多肽脱离，又不影响产品的质量。达到了去除树脂的同时，也保证了质量。
其中步骤f中所述的HPLC精制是：
通过两步反相纯化和一步转盐的方法得到比伐卢定精品，具体步骤如下：
(1)一步纯化：
制备柱：5cm*250mm填料规格为C18；
上样量：1-5g目的肽；
上样流速：80ml/min；
检测波长：220nm；
洗脱液：A：0.1％(体积百分比含量)TFA水溶液 B：乙腈
梯度：B相 5％-5％ 5min
5min后调整到20％
20％-30％ 40min(梯度可视情况进行调整)
洗脱流速：80ml/min
冲柱和平衡：50％ 5min 50％，5％ 8min 5％
收峰：峰前、峰顶、峰后，峰前、峰后样品再次按上述体系纯化，所得峰顶并入粗纯峰顶样品，收集样品馏分，浓缩除去乙睛，进一步纯化。
(2)二步纯化：
制备柱：5cm*250mm C18；
上样量：1-5g目的肽；
上样流速：80ml/min；
检测波长：220nm；
洗脱液：A：0.3-1.5％HAC B：乙腈；
梯度：5％ 5min 5％，20％ 40min 28％(梯度可视情况进行调整)；
洗脱流速：80ml/min；
冲柱和平衡：50％ 5min 50％，5％ 8min 5％；
收峰：峰前、峰顶、峰后，峰前、峰后样品再次按上述体系纯化，所得峰顶并入粗纯峰顶样品，收集样品馏分，浓缩除去乙睛，进一步纯化。
(3)转盐
制备柱：5cm*250mm C18；
上样量：5～10g目的肽；
上样流速：80ml/min；
检测波长：220nm；
流速：80ml/min；
使用溶液：A：ACN B：0.25％TFA溶液 C：0.1％TFA溶液；D：0.4％TFA溶液(用氨水调节pH至7.0-7.5)。
操作过程
清洗柱子：使用A相和C相，60％ 15min 60％，60％为A相；
平衡柱子：使用A相和B相，5％ 12min 5％，5％为A相。
上样：
离子转盐：5％ 12min 5％，5％为A相。
平衡柱子：使用A相和B相，5％ 12min 5％，5％为A相。
洗脱：使用A相和B相，50％为A相，50％B相冲洗下来。
利用本发明的上述方法，生成成本低，工艺过程简单，收率高，且避免产生杂质des-G，des+G，使制得的比伐卢定的纯度高。对于杂质des-G，des+G的检测，现有技术中一般的HPLC检测方法，例如0.1％TFA，TEAP等都不能对EMEA关于比伐卢定讨论中的4个杂质有效的分离，现有技术中常规的分析方法确认的比伐卢定产品不能确检出是否有此4个杂质，尤其是des-G，des+G两个杂质，本发明针对上述问题，提出了一种新的检测方法，能够检测出这几个杂质峰的情况。该方法采用的检测条件是：
色谱柱：C18 4.6×250mm
流动相：A：TEAP-5mM庚烷磺酸钠pH 3.0B：乙腈
洗脱梯度：23％ 60min 26％(23％→26％为乙腈变化梯度)
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温；40℃
其中所述的流动相：A：TEAP-5mM庚烷磺酸钠PH3.0，其中的庚烷磺酸钠pH3.0是通过将磷酸和庚烷磺酸钠加入的水中，用三乙胺调节pH至3.0，即可制得。更具体的说，即用11ml磷酸和5mmol的庚烷磺酸钠加入1000ml的纯化水中，用三乙胺调节pH至3.0，即可制得，洗脱梯度为乙腈体积百分含量从23％到26％的变化梯度。
而常规分析条件一：
色谱柱：C18 4.6×250mm
流动相：A：0.1％TFA B：乙腈
洗脱梯度：24％ 20min 28％(24％→28％为乙腈变化梯度)
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温；40℃
其中所述的流动相：A：0.1％TFA，用1000ml纯化水和1mlTFA混合即可制得。
常规分析条件二：
色谱柱：C18 4.6×250mm
流动相：A：10mM庚烷磺酸钠PH 2.3 B：乙腈
洗脱梯度：28％ 60min 36％(28％→36％为乙腈变化梯度)
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温；40℃；
其中所述的流动相：A：10mM庚烷磺酸钠PH 2.3，其中的10mM庚烷磺酸钠pH2.3是通过将庚烷磺酸钠配制成10mM的庚烷磺酸钠的水溶液，用三乙胺调节pH至2.3，即可制得。
分析条件三：
色谱柱：C18 4.6*250mm
流动相：A：TEAP B：乙腈
洗脱梯度：21％ 60min 27％(21％→27％为乙腈变化梯度)
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
温度；40度
其中所述的流动相：A：TEAP，即用11ml磷酸加入1000ml的纯化水中，用三乙胺调节pH至3.0，即可制得。
四种分析方法对以下4个比伐卢定杂质分析结果见附图1-5。
本发明一种固相液相结合制备比伐卢定的方法，结合上述的检测方法，更有利于生产过程中的杂质的控制，从而也保证了产品的质量。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明一种固相液相结合制备比伐卢定的方法，工艺过程简单，生产成本低，且产品收率高。
2、本发明一种固相液相结合制备比伐卢定的方法，避免杂质des-G，des+G的产生，所得的产品纯度高。
附图说明
图1表示的是常规分析条件一的图示：0.1％TFA 24％20min 28％使用时，比伐卢定和des-G，+G两个杂质不能有效分开的情况；
图2表示的是常规分析条件二的图示：10mM庚烷磺酸钠PH(用TFA调PH到2.3)2.3 28％ 60min 36％，使用时，比伐卢定和des-G，+G两个杂质不能有效分开的情况；
图3表示的是常规分析条件三的图示：A：TEAP(1.1％(V/V)磷酸水溶液用三乙胺调节PH为2.3)B：乙腈，使用时，比伐卢定和des-G，+G两个杂质不能有效分开的情况。
图4为本发明的第一分析条件系统适应性图示；
图5为本发明的第二分析条件系统适应性图示；
色谱柱：C18 4.6×250mm
流动相：A：TEAP-5mM庚烷磺酸钠pH 3.0 B：乙腈
洗脱梯度：23％ 60min 26％ 23％→26％为乙腈变化梯度
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温；40℃。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明；但是本发明并不限于这些实施例。
以下是说明书内容中所提到的缩写的含义见表1。
表1
以下实施例中所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH可以通过下列方法制得的：
将2.97kg Fmoc-Gly-OH和1.15kg HOSu溶于17.5L四氢呋喃(THF)中，再加入DCC/THF混合液2.06kg/3.5L，在常温下反应2小时，反应结束后，过滤除去沉淀物，用THF洗涤5次，合并滤液，旋转蒸干溶剂后，再加入30L乙酸乙酯溶解，用2％～10％NaHCO3水溶液洗涤三次，每次用5％NaHCO3水溶液10L，洗至点板呈单点。再用旋转仪旋转蒸干乙酸乙酯溶剂，得固体物Fmoc-Gly-OSu，备用。
将1.06kg Na2CO3和0.75kg Gly-OH加入到4L纯净水中，再加入6L四氢呋喃(THF)，溶清后，加入到溶于7L四氢呋喃(THF)的上述制得的Fmoc-Gly-OSu中，常温下反应48小时，反应结束后，用稀盐酸调节pH至3，得到大量白色沉淀，乙酸乙酯重结晶6次，得到Fmoc-Gly-Gly-OH；将得到的Fmoc-Gly-Gly-OH溶于7L20％哌啶/DMF溶液中，常温下反应2小时后，加入乙酸乙酯沉淀，过滤得白色产品H-Gly-Gly-OH。
将3.54kgFmoc-Gly-Gly-OH和1.15kgHOSu溶于10L THF中，常温下加入DCC/THF的混合液2.06kg/3.5L，常温下反应2小时。反应完全后，过滤将沉淀滤除，用THF洗涤2次，合并滤液用旋转仪旋转蒸干溶剂后，加入30L乙酸乙酯溶解，用2-10％NaHCO3水溶液洗涤三次，每次用2-10％NaHCO3水溶液10L，洗至点板呈单点。蒸干乙酸乙酯，得固体物Fmoc-Gly-Gly-OSu，备用。
将1.06kg Na2CO3和1.32kgH-Gly-Gly-OH加入到2L DMF溶剂中溶清后，加入到溶于7L四氢呋喃(THF)的上述制得的4.5kg Fmoc-Gly-Gly-OSu中，常温下反应24小时，反应结束后，用稀盐酸调节pH至3，得到大量白色沉淀，用水洗涤6次，得到Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
以下实施例中所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH可以通过下列方法制得的：
将1.06kg Na2CO3和0.75kg Gly-OH加入到4L纯净水中，再加入6L四氢呋喃(THF)，溶清后，加入到溶于7L四氢呋喃(THF)的上述制得的4.5kgFmoc-Gly-Gly-OSu中，常温下反应48小时，反应结束后，用稀盐酸调节pH至3，得到大量白色沉淀，乙酸乙酯重结晶6次，得到Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH。
表2是实施例1中相应原料的使用情况表。
表2
表3是实施例2中相应原料的使用情况表。
表3
表4是实施例3中相应原料的使用情况表。
表4
实施例1
第一步将10g替代度为1.Ommol/g的Wang(即10mmol)树脂加入至玻璃砂心反应柱中，加入100ml DMF溶涨1小时，过滤抽除DMF。然后将17.7gFmoc-L-Leu-OH与6.8g HOBT及7.8ml DIC、6.1g DMAP、100mlDMF混合反应2小时后抽去反应液。用20％的六氢吡啶/DCM(体积比)溶液100ml洗涤树脂5分钟，然后抽去溶液，用DCM洗涤树脂2次，每次100ml；
第二步然后用100mlDMF将5.5g Fmoc-tyr(tBu)-OH、3.9g TBTU、2.1mlDIEA溶解后，加入到反应柱中反应3小时，反应结束后，抽滤除去反应液。用DCM洗涤树脂2次，每次100ml。再用20％的六氢吡啶/DCM(体积比)溶液洗涤树脂5分钟，然后用DCM洗涤树脂2次，每次100ml。
依照比伐卢定序列，跟据表2中的数据重复第二步的操作，直至到第9位Fmoc-Asn(Trt)-OH脱除Fmoc保护，得到多肽树脂：
-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang树脂。
重复第二步的操作，将得到的多肽树脂与Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH缩合反应，得到多肽树脂：
Fmoc-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang树脂，脱除保护剂Fmoc，得多肽树脂：
-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang树脂，再通过固相合成的方法重复上述第二步的操作方法，将氨基酸自C端向N端按照Pro至Arg至Pro至Phe的顺序依次同式III所示的多肽树脂上的多肽缩合，得式II所示的多肽树脂；脱除Fmoc，得多肽树脂：
D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang树脂。
将上述树脂用甲醇洗涤3次，再用DCM洗涤树脂3次，然后再用DMF洗涤树脂3次，真空干燥至恒重，得树脂约50g。
然后将TFA∶TIS∶H2O＝90∶5∶5(体积比)配制成100ml，加入到砂心反应柱中，与树脂混合均匀反应3小时，过滤，收集滤液，将滤液加入到乙醚中沉淀1小时。然后离心，滤饼用乙醚洗涤2次，得到的比伐卢定粗品，在真空干燥下，干燥至恒重，HPLC精制得比伐卢定成品18g。
HPLC精制：通过两步反相纯化和一步转盐的方法得到比伐卢定精品，具体步骤如下：
(1)一步纯化：
制备柱：5cm*250mm填料规格为C18；
上样量：1-5g目的肽；
上样流速：80ml/min；
检测波长：220nm；
洗脱液：A：0.1％(体积百分比含量)TFA水溶液 B：乙腈
梯度：B相 5％-5％ 5min
5min后调整到20％
20％-30％ 40min (梯度可视情况进行调整)
洗脱流速：80ml/min
冲柱和平衡：50％ 5min 50％，5％ 8min 5％
收峰：峰前、峰顶、峰后，峰前、峰后样品再次按上述体系纯化，所得峰顶并入粗纯峰顶样品，收集样品馏分，浓缩除去乙睛，进一步纯化。
(2)二步纯化：
制备柱：5cm*250mm C18；
上样量：1-5g目的肽；
上样流速：80ml/min；
检测波长：220nm；
洗脱液：A：0.3-1.5％HAC B：乙腈；
梯度：5％ 5min 5％，20％ 40min 28％(梯度可视情况进行调整)；
洗脱流速：80ml/min；
冲柱和平衡：50％ 5min 50％，5％ 8min 5％；
收峰：峰前、峰顶、峰后，峰前、峰后样品再次按上述体系纯化，所得峰顶并入粗纯峰顶样品，收集样品馏分，浓缩除去乙睛，进一步纯化。
(3)转盐
制备柱：5cm*250mm C18；
上样量：5～10g目的肽；
上样流速：80ml/min；
检测波长：220nm；
流速：80ml/min；
使用溶液：A：ACN B：0.25％TFA溶液 C：0.1％TFA溶液；D：0.4％TFA溶液(用氨水调节pH至7.0-7.5)。
操作过程
清洗柱子：使用A相和C相，60％ 15min 60％，60％为A相；平衡柱子：使用A相和B相，5％ 12min 5％，5％为A相。
上样：
离子转盐：5％ 12min 5％，5％为A相。
平衡柱子：使用A相和B相，5％ 12min 5％，5％为A相。
洗脱：使用A相和B相，50％为A相，50％B相冲洗下来。
实施例2
多肽树脂：
-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang树脂的制备方法同实施例1中的方法一致，不再赘述。
重复实施例1中第二步的操作方法，将得到的多肽树脂与Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH缩合反应，得到多肽树脂：
Fmoc-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang树脂，脱除保护剂Fmoc，得多肽树脂：
-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang树脂，再通过固相合成的方法重复上述第二步的操作方法，将氨基酸自C端向N端按照Gly至Pro至Arg至Pro至Phe的顺序依次同多肽树脂：
-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang树脂上的多肽缩合，得式II所示的多肽树脂；脱除Fmoc，得多肽树脂：
D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Ash(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang树脂。
将上述树脂用甲醇洗涤3次，再用DCM洗涤树脂3次，然后再用DMF洗涤树脂3次，真空干燥至恒重，得树脂约56g。
然后将TFA∶TIS∶H2O＝90∶5∶5(体积比)配制成100ml，加入到砂心反应柱中，与树脂混合均匀反应3小时，过滤，收集滤液，将滤液加入到乙醚中沉淀1小时。然后离心，滤饼用乙醚洗涤2次，得到的比伐卢定粗品，在真空干燥下，干燥至恒重，HPLC精制得比伐卢定成品21g。
实施例3
多肽树脂：
-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang树脂的制备方法同实施例1中的方法一致，不再赘述。
依照比伐卢定序列，跟据表1中的数据重复第二步的操作，直至到第10位Fmoc-Gly-OH，脱除Fmoc保护，得到多肽树脂：
-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-EWang树脂。
重复实施例1中第二步的操作方法，将上述得到的多肽树脂与Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH缩合反应，得到多肽树脂：
Fmoc-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang树脂，脱除保护剂Fmoc，制得多肽树脂：
-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang树脂，再通过固相合成的方法重复上述第二步的操作方法，将氨基酸自C端向N端按照Pro至Arg至Pro至Phe的顺序依次同式III所示的多肽树脂上的多肽缩合，得式II所示的多肽树脂；脱除Fmoc，得多肽树脂：
D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(otBu)11-Phe12-Glu(otBu)13-Glu(otBu)14-Ile15-Pro16-Glu(otBu)17-Glu(otBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang树脂。
将上述树脂用甲醇洗涤3次，再用DCM洗涤树脂3次，然后再用DMF洗涤树脂3次，真空干燥至恒重，得多肽树脂约58g。
然后将TFA∶TIS∶H2O＝90∶5∶5(体积比)配制成100ml，加入到砂心反应柱中，与树脂混合均匀反应3小时，过滤，收集滤液，将滤液加入到乙醚中沉淀1小时。然后离心，滤饼用乙醚洗涤2次，得到的比伐卢定粗品，在真空干燥下，干燥至恒重，HPLC精制得比伐卢定成品22g。
实施例4
其与实施例1中所述的方法一致，其区别在于将所述的缩合剂“DIC”改为“TBTU、DIEA、HOBt中的一种或几种”。
实施例5
其与实施例1中所述的方法一致，其区别在于将所述的缩合剂“HOBt”改为“5％～25％哌啶、六氢吡啶、HOOBT中的一种或几种”。
实施例6
其与实施例2中所述的方法一致，其区别在于将所述的“20的六氢吡啶”改为“10％六氢吡啶、15％六氢吡啶、25％六氢吡啶中的一种”。
实施例7
其与实施例3中所述的方法一致，其区别在于将所述的“TFA∶TIS∶H2O＝90∶5∶5(体积比)”改为“TFA∶TIS∶H2O＝90∶5∶5(体积比)、TFA∶TIS∶H2O＝85∶10∶5(体积比)、TFA∶TIS∶H2O＝85∶5∶10(体积比)中的一种”。
上述实施例1-实施例7中合成的比卢伐卢定，用本发明所述的分析方法进行检测分析，见对应的表6-12，即实施例1的分析结果见表6；可以看出，利用本发明的方法制得得比伐卢定，纯度高。从图中还可以看出，利用本发明的方法，能够有效的分离出杂质des-G，des+G这两个峰。
表6(实施例1的分析结果)
表7(实施例2的分析结果)
表8(实施例3的分析结果)
表9(实施例4的分析结果)
表10(实施例5的分析结果)
表11(实施例6的分析结果)
表12(实施例7的分析结果)
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (9)
1.一种固相液相结合制备比伐卢定的方法，该方法包括以下步骤：
a、将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和式V所示的多肽树脂缩合反应，得到式IV所示的多肽树脂；
b、将制得的式IV所示的多肽树脂和去保护剂混合反应，得到式III所示的多肽树脂；
c、通过固相合成的方法将氨基酸自C端向N端按照Pro至Arg至Pro至Phe的顺序依次同式III所示的多肽树脂上的多肽缩合，形成式II所示的多肽树脂；
d、使制得的式II所示的多肽树脂脱除Fmoc，再加入切割剂，除去树脂，得到式I所示的多肽树脂粗品；
f、将得到的式I所示的多肽树脂粗品经过HPLC精制，得到比伐卢定精品；
2.根据权利要求1所述的一种固相液相结合制备比伐卢定的方法，其特征在于：步骤a中所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH采用以下方法制得：
以Fmoc-Gly-OH与H-Gly-OH为原料，液相合成，制得Fmoc-Gly-Gly-OH，然后再与H-Gly-OH液相合成，制得Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH，最后与H-Gly-OH液相合成制得Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
3.根据权利要求1所述的一种固相液相结合制备比伐卢定的方法，其特征在于：步骤a中所述的式IV所示的多肽树脂还可以采用以下方法制得：
i、将Fmoc-Gly-OH和式V所示的多肽树脂缩合反应，得到式VI所示的多肽树脂；
ii、将制得的式VI所示的多肽树脂去除保护剂Fmoc，再与Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH缩合反应，得到式IV所示的多肽树脂；
4.根据权利要求1所述的一种固相液相结合制备比伐卢定的方法，其特征在于：步骤a中所述的式IV所示的多肽树脂还可以采用以下方法制得：
(1)、将Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和式式V所示的多肽树脂缩合反应，得到式VII所示的多肽树脂；
(2)、将制得的式VII所示的多肽树脂去除保护剂Fmoc，再与Fmoc-Gly-OH缩合反应，得到式III所示的多肽树脂；
5.根据权利要求3或4所述的一种固相液相结合制备比伐卢定的方法，其特征在于：所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH采用以下方法制得：
以Fmoc-Gly-OH和H-Gly-OH原料，液相合成制得Fmoc-Gly-Gly-OH，再以制得的Fmoc-Gly-Gly-OH与H-Gly-OH为原料混合，液相合成制得Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH。
6.根据权利要求1或3或4所述的一种固相液相结合制备比伐卢定的方法，其特征在于：步骤a中所述的缩合反应是在下列缩合剂N，N’-二异丙基碳二亚胺、O-(7-氮杂苯荓三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸、二异丙基乙胺、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲六氟磷酸、1-羟基苯并三唑中的一种或几种存在下进行反应。
7.根据权利要求1所述的一种固相液相结合制备比伐卢定的方法，其特征在于：步骤b中所述的去保护剂是1-羟基苯并三唑、5％～25％哌啶、3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的一种固相液相结合制备比伐卢定的方法，其特征在于：步骤d中所述的切割剂是含有TFA、TIS、盐酸中的一种或几种弱酸性水溶液。
9.根据权利要求1所述方法制备的比伐卢定的检测方法，其特征在于采用的检测条件是：
色谱柱规格：C18 4.6×250mm
流动相：A：TEAP-5mM庚烷磺酸钠pH 3.0 B：乙腈
洗脱梯度：23％ 60min 26％
流速：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温；40℃
其中所述的流动相：A：TEAP-5mM庚烷磺酸钠PH3.0，其中的庚烷磺酸钠pH3.0是通过将磷酸和庚烷磺酸钠加入的水中，用三乙胺调节pH至3.0，即可制得。更具体的说，即用11ml磷酸和5mmol的庚烷磺酸钠加入1000ml的纯化水中，用三乙胺调节pH至3.0，即可制得，洗脱梯度为乙腈体积百分含量从23％到26％的变化梯度。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102702325A (zh) * | 2012-06-19 | 2012-10-03 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种抗凝血多肽的制备方法 |
| CN105388239A (zh) * | 2015-12-18 | 2016-03-09 | 兆科药业（合肥）有限公司 | 一种多肽固相合成的监测方法 |
| CN105548432A (zh) * | 2015-12-18 | 2016-05-04 | 乐普药业股份有限公司 | 一种比伐卢定中氨基酸的检测分析方法 |
| CN105806965A (zh) * | 2014-12-30 | 2016-07-27 | 深圳信立泰药业股份有限公司 | 一种比伐芦定中三氟乙酸的定量测定方法 |
| USRE46830E1 (en) | 2004-10-19 | 2018-05-08 | Polypeptide Laboratories Holding (Ppl) Ab | Method for solid phase peptide synthesis |
| CN108663439A (zh) * | 2017-03-31 | 2018-10-16 | 江苏汉邦科技有限公司 | 一种使用高效液相色谱纯化比伐卢定的方法 |
| CN110187036A (zh) * | 2019-07-02 | 2019-08-30 | 昆明龙津药业股份有限公司 | 一种比伐芦定原料及其制剂的质量控制方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010117725A2 (en) * | 2009-04-06 | 2010-10-14 | Novetide, Ltd. | Production of peptides containing poly-gly sequences using fmoc chemistry |
| CN101906150A (zh) * | 2010-06-28 | 2010-12-08 | 上海昂博生物技术有限公司 | 一种比法卢定的制备方法 |
-
2011
- 2011-05-30 CN CN2011101443179A patent/CN102260323A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010117725A2 (en) * | 2009-04-06 | 2010-10-14 | Novetide, Ltd. | Production of peptides containing poly-gly sequences using fmoc chemistry |
| CN101906150A (zh) * | 2010-06-28 | 2010-12-08 | 上海昂博生物技术有限公司 | 一种比法卢定的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 沈忱等: "固相合成抗凝血药比伐卢定及合成条件的优化", 《南京医科大学报自然科学版》 * |
| 黄维德等: "《多肽合成原理》", 30 September 1985, 科学出版社 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE46830E1 (en) | 2004-10-19 | 2018-05-08 | Polypeptide Laboratories Holding (Ppl) Ab | Method for solid phase peptide synthesis |
| CN102702325A (zh) * | 2012-06-19 | 2012-10-03 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种抗凝血多肽的制备方法 |
| CN102702325B (zh) * | 2012-06-19 | 2015-09-23 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种抗凝血多肽的制备方法 |
| CN105806965A (zh) * | 2014-12-30 | 2016-07-27 | 深圳信立泰药业股份有限公司 | 一种比伐芦定中三氟乙酸的定量测定方法 |
| CN105806965B (zh) * | 2014-12-30 | 2019-07-16 | 深圳信立泰药业股份有限公司 | 一种比伐芦定中三氟乙酸的定量测定方法 |
| CN105388239A (zh) * | 2015-12-18 | 2016-03-09 | 兆科药业（合肥）有限公司 | 一种多肽固相合成的监测方法 |
| CN105548432A (zh) * | 2015-12-18 | 2016-05-04 | 乐普药业股份有限公司 | 一种比伐卢定中氨基酸的检测分析方法 |
| CN105388239B (zh) * | 2015-12-18 | 2018-01-05 | 兆科药业（合肥）有限公司 | 一种多肽固相合成的监测方法 |
| CN108663439A (zh) * | 2017-03-31 | 2018-10-16 | 江苏汉邦科技有限公司 | 一种使用高效液相色谱纯化比伐卢定的方法 |
| CN110187036A (zh) * | 2019-07-02 | 2019-08-30 | 昆明龙津药业股份有限公司 | 一种比伐芦定原料及其制剂的质量控制方法 |
| CN110187036B (zh) * | 2019-07-02 | 2022-02-22 | 昆明龙津药业股份有限公司 | 一种比伐芦定原料及其制剂的质量控制方法 |
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