CN101838308B - 依替巴肽的固相合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种依替巴肽的固相合成方法。该依替巴肽的固相合成方法采用以下步骤：在载体树脂上进行氨基酸缩合，所得树脂烘干后以三氟乙酸进行切割，得到依替巴肽粗品；然后以双氧水进行氧化，氧化时间30～60分钟；以醋酸中和并过滤后，对滤液进行HPLC纯化，收集特征峰；然后将收集物旋蒸并浓缩、冻干，即得醋酸依替巴肽精品。本发明提供了一种很简单而且易操作的工艺合成路线，在合成上选用的原料只需要单保护的Fmoc-Har-OH2和Fmoc-Trp-OH2，这样在原料的得到上就更容易，缩短了生产周期。

Description

依替巴肽的固相合成方法
技术领域
本发明涉及药物的制备方法，具体地说，本发明是一种依替巴肽的固相合成方法。
背景技术
依替巴肽(Eptifibatide)是一种含一个巯基丙酸和六个氨基酸残基的环肽，它的分之式：C35H49N11O9S2，它的序列是：
Figure G2009101195858D00011
依替巴肽是血管和血液系统药物类中的抗凝药，为无色非晶态无定型的白色粉末，在水中易溶。它的主要作用是选择性的阻断糖蛋白IIb/IIIa与黏附蛋白的结合，对黏附类相关的受体有一定的弱抑制作用，在低浓度可对二磷酸腺(ADP)和肾上腺素引起的血小板聚集起到阻止的作用。
目前这个产品国外的生产厂家是瑞士的Bachem公司，Bachem公司的合成路线是液相合成法和BOC策略法，液相合成周期比较长，BOC法合成对环境污染大。
中国专利申请02145292.X(申请日2002年11月14日，公开日2004年6月2日)公开了一种制备依非巴肽的新工艺，该新工艺采用片段合成法，是先用Fmoc-Rink Amide AM Resin为起始原料载体，然后依次接上Fmoc-Cys(trt)-OH2，Fmoc-Pro-OH2，Fmoc-Trp(boc)-OH2，Fmoc-Asp(otbu)-OH2和Fmoc-Gly-OH2，然后利用H-Lys-OH为起始原料合成高精氨酸。该技术的主要特点是把巯基丙酸当作赖氨酸的保护基团引入，再利用两个片段进行合成。这个方法的优点是能够比较好地解决高精氨酸的液相合成问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种依替巴肽的固相合成方法。
为了说明的方便，先列出官能团的简称与全称的对照：
Fmoc：芴甲氧羰基Otbu：叔丁氧基
HOBt：1-羟基苯骈三唑DIC：N，N-二异丙基碳二亚胺
Cys：半胱氨酸Trp：色氨酸Har：高精氨酸
Pro：脯氨酸Asp：天冬氨酸Gly：甘氨酸
Boc：叔丁氧羰基
Pbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
Piperdine：六氢吡啶
Fmoc-Rink-AM Resin：芴甲氧羰基氨甲基树脂
TFA：三氟乙酸HAC：醋酸
Kaiser test：茚三酮
Trt：2-氯三苯基EDT：乙二硫醇
DIEA：N，N-二异丙基乙胺
MeOH：甲醇ACN：乙腈Mpr：巯基丙酸
为了实现上述的发明目的，本发明采用以下技术方案：
在载体树脂上进行氨基酸缩合，所得树脂烘干后以三氟乙酸进行切割，得到依替巴肽粗品；然后将粗品用水溶解，以双氧水进行氧化来增加粗品在水中的溶解度，氧化时间30～60分钟；以醋酸中和并过滤后，对滤液进行HPLC纯化，收集特征峰；然后将收集物旋蒸并浓缩、冻干，即得醋酸依替巴肽精品。
双氧水的优选用量是依替巴肽粗品体积的0.1～0.5％。所得树脂烘干后以三氟乙酸进行切割，切割是以87.5wt％的三氟乙酸在30℃条件下处理2个小时。
所述的氨基酸缩合是将Fmoc-Cys(trt)-OH2，Fmoc-Pro-OH2，Fmoc-Trp-OH2，Fmoc-Asp(otbu)-OH2，Fmoc-Gly-OH2，Fmoc-Har-OH2，Mpr(trt)依次连接在Fmoc-linker-AM Resin上。
现在一般的公司都是采用的Fmoc-Har(pbf)-OH2这种双保护的策略，而这种双保护的氨基酸原料本来就比较难做，很难得到高纯度的产物，价格上是更加的贵了；同理Fmoc-Trp(Boc)-OH2也是一个比较难合成的氨基酸，对于双保护的氨基酸纯度不是很高，国内市场做得不是很好，采用单保护的氨基酸，一是能解决原料供应问题，而且能进一步提高粗品的纯度；只要能控制好一定的条件；本发明采用的是上述比较难合成的氨基酸都是单保护的策略，在这种原料上就更加容易得到些，价格方面也有更大的优势；这个产品的粗品溶解比较困难，也增加了纯化的难度和降低了收率。为了解决粗品难溶解的问题，先加入乙腈类的有机溶剂，然后用稀氨水调pH值到中性，再加入双氧水，进行氧化。双氧水的用量是依替巴肽粗品体积的0.1～0.5％。氧化时间是30～60分钟，通常30～40分钟，最长1小时。
本发明具有以下的优点：
①在二硫键的氧化上，以前一般是才用的空气氧化或者碘氧化等，但本发明采用的是双氧水氧化，这样对产品的氧化在时间上一般更加迅速，上述几种氧化方法一般都需要24小时以上，而采用双氧水氧化则只要30～60分钟就可以了，缩短了生产周期。
②在合成上选用的原料只需要单保护的Fmoc-Har-OH2和Fmoc-Trp-OH2，这样在原料的得到上就更容易，而且经济实用，节省了生产成本。
③提供了一种很简单而且易操作的工艺合成路线，一般的人只要进行简单的培训就能熟练地生产出精制的依替巴肽。
具体实施方式
实施例1
1.制备Fmoc-Cys(trt)-Linker-AM树脂
将Fmoc-Linker-AM树脂用DMF洗过两次，然后用DCM浸泡10分钟左右，使树脂充分溶涨，加入25％的哌啶，反应20分钟，抽干，用DMF和DCM各洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Cys(trt)-OH2/HOBt/DIC的混合物，在室温下反应2个小时，抽干，然后用DMF和DCM交替着洗三遍，就得到了Fmoc-Cys(trt)-Linker-AM树脂。所用的氨基酸和缩合试剂的量是树脂的摩尔系数的两倍过量；以下过程同。
2.制备Fmoc-Pro-Cys(trt)-Linker-AM树脂
在上面的步骤后，加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍，抽干，加入用DMF溶解好的Fmoc-Pro-OH2/HOBt/DIC/DMAP的混合物，在室温下反应2个小时，抽干，然后用DMF和DCM交替着洗三遍，就得到了Fmoc-Pro-Cys(trt)-Linker-AM树脂。
3.制备Fmoc-Trp-Pro-Cys(trt)-Linker-AM树脂
在步骤2.后加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍，加入已溶解好的Fmoc-Trp-OH/HOBt/DIC的混合物，在室温下反应2个小时后，抽干，用DMF和DCM交替着洗三遍，即得到了Fmoc-Trp-Pro-Cys(trt)-Linker-AM树脂。
4.制备Fmoc-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(trt)-Linker-AM树脂
在步骤3.后加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍，加入已溶解好的Fmoc-Asp(Otbu)-OH/HOBt/DIC的混合物，在室温下反应2个小时后，抽干，用DMF和DCM交替着洗三遍，即得到Fmoc-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(trt)-Linker-AM树脂。
5.制备Fmoc-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(trt)-Linker-AM树脂
在步骤4.后加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍，加入已溶解好的Fmoc-Gly-OH2/HOBt/DIC的混合物，在室温下反应2个小时，抽干，用DMF和DCM交替着洗，即得到Fmoc-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(trt)-Linker-AM树脂。
6.制备Fmoc-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(trt)-Linker-AM树脂
在步骤5.后加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍，加入已溶解好的单保护的Fmoc-Har-OH/HOBt/DIC的混合物，在室温下反应2个小时，抽干，用DMF和DCM交替着洗，即得到Fmoc-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(trt)-Linker-AM树脂。
7.制备Mpr(trt)-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(trt)-Linker-AM树脂
在步骤6.后加入25％的哌啶反应20分钟，用DMF，DCM交替着洗三遍，加入已溶解好的Mpr(trt)-OH/HOBt/DIC的混合物，在室温下反应2个小时，抽干，用DMF和DCM交替着洗，即得到Mpr(trt)-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(trt)-Linker-AM树脂。
8.制备Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2
把Mpr(trt)-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(trt)-Linker-AM树脂吹干或者稍微烘干然后用预冷的87.5％的三氟乙酸切割试剂在30度左右进行切割，大概切割2个小时左右，用砂心漏斗过滤得到滤液，把滤液用冰乙醚进行沉淀，然后过滤或者离心得到白色的固体，即得到了粗品：为线性Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2。
9.制备醋酸
Figure G2009101195858D00061
精品
把得到的线性粗品用水溶解，这个产品的溶解性不是很好，可以稍微加一些乙腈之类的有机溶剂适当的可以增加其的溶解度。然后用稀氨水调PH到中性，再适量的加一点双氧水，其体积是粗品体积的0.1～0.5％，进行氧化，大概只需要一个小时左右就可以了，这个过程需要搅拌。这个过程要用MS或者HPLC监测，反应完全了则用醋酸把它中和，然后用￠0.45um的膜进行过滤，得到澄清的滤液。再把过滤好的滤液进行高效液相HPLC纯化，收集依替巴肽的特征峰。然后把收集的产品合并一起，旋蒸去掉乙腈，把旋蒸过后的液体过高压液相柱进行换醋酸盐；再把得到的样品液进行旋蒸浓缩，把浓缩液进行冻干后，即得到合格的醋酸依替巴肽精品：
Figure G2009101195858D00062
以上对本发明所提供的依替巴肽的固相合成方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (2)

1.一种依替巴肽的固相合成方法，其特征在于：在载体树脂上进行氨基酸缩合，将Fmoc-Cys（trt）-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Asp（otbu）-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Har-OH，Mpr（trt）-OH依次连接在Fmoc-Linker-AM Resin上，所得树脂烘干后，以三氟乙酸进行切割，得到依替巴肽粗品；然后将粗品用水溶解，先加入有机溶剂乙腈，然后用稀氨水调pH值到中性，以双氧水进行氧化来增加粗品在水中的溶解度，双氧水的用量是依替巴肽粗品体积的0.1~0.5%，氧化时间30~60分钟；以醋酸中和并过滤后，对滤液进行HPLC纯化，收集特征峰；然后将收集物旋蒸并浓缩、冻干，即得醋酸依替巴肽精品。
2.根据权利要求1所述的依替巴肽的固相合成方法，其特征在于：所述的切割是以87.5wt%的三氟乙酸在30℃条件下处理2个小时。
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