CN105585613A - 一种依替巴肽的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种依替巴肽的合成方法，以芴甲氧羰基氨甲基树脂为载体，包括步骤一到七的氨基酸缩合反应，步骤八将连接有7个氨基酸的树脂进行切割得到线性的巯基丙酸-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-NH2，以及步骤九在2,2ˊ-二硫二吡啶的催化下成环，得到依替巴肽。进一步地，是在60-80℃下，进行缩合反应和脱保护反应。本发明具有产率高、副产物少，分离纯化简单的特点，与现有技术相比大量的节省了时间，适用于中试和工业生产。

Description

一种依替巴肽的合成方法
技术领域
本发明涉及一种多肽的合成方法，尤其涉及一种依替巴肽的合成方法。
背景技术
依替巴肽，英文名为Eptifibatide，分子式为C35H49N11O9S2，序列为：Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2，依替巴肽在临床上为一种可以静注的特异性GPIIb/IIIa受体拮抗剂。为无色非晶态无定型的白色粉末，在水中易溶。通过阻止纤维原与GPIIb/IIIa受体结合，从而抑制血小板聚集和防止血栓形成，临床上本品作为肝素或阿司匹林的辅助用药。
依替巴肽为人工合成的环状七肽，是血小板糖蛋白GPIIb/IIIa受体拮抗剂，可阻断由各种激活剂引起的血小板聚集反应，是已知最强的特异性血小板聚集抑制剂，主要用于防止心肌供氧动脉闭塞，心脏病发作，不稳定性心绞痛、无Q波心肌梗塞、冠脉介入治疗引起的猝死。
该品种由美国CORTherapeutics公司(加拿大科尔治疗药物公司)开发，于1998年由CORTherapeutics公司与Schering-Plough公司(先灵葆雅公司)合作使其在美国上市，商品名Integrelin(依替非巴肽)。
目前这个产品国外的生产厂家是瑞士的Bachem公司(巴亨公司)，Bachem公司的合成路线是液相合成法。液相合成法周期比较长；液相合成法的优点是避开了使用较昂贵的树脂，但缺点是，每合成一步均需耗费大量的时间纯化，故而合成周期长，大致需要一个多月时间。而固相合成法克服了工时长的缺点，整个周期只需1-2天的时间。现有技术中的Boc策略固相法(即：叔丁氧羰基策略固相法)也存在二个缺点：1、在将精氨酸转化为高精氨酸过程中是在非均相条件下进行的，反应不易完全。而这种转化程度是否完全，在树脂上无法检测跟踪，因此影响粗品的纯度，造成纯化难度加大，产率降低。2、多肽从树脂上洗落时用到了强腐蚀性、剧毒的氟化氢，易造成环境污染，产生一系列环境社会问题。
表1氨基酸的缩写对照表
表2英文名或缩写与中文名的对照表
发明内容
为了获得更高的产率，提高反应速率，反应更安全，本发明提供一种依替巴肽的合成方法，包括以下步骤：
步骤一、制备芴甲氧羰基-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将清洗、溶胀和脱芴甲氧羰基保护处理后的芴甲氧羰基氨甲基树脂与芴甲氧羰基-半胱氨酸(2-氯三苯基)-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤二、制备芴甲氧羰基-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将步骤一得到的芴甲氧羰基-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-脯氨酸-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤三、制备芴甲氧羰基-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将步骤二得到的芴甲氧羰基-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-色氨酸(叔丁氧羰基)-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤四、制备芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将步骤三得到的芴甲氧羰基-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤五、制备芴甲氧羰基-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将步骤四得到的芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-甘氨酸-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤六、制备芴甲氧羰基-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将步骤五得到的芴甲氧羰基-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-高精氨酸-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤七、制备巯基丙酸(2-氯三苯基)-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将步骤六得到的芴甲氧羰基-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-巯基丙酸(2-氯三苯基)-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到巯基丙酸(2-氯三苯基)-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤八、制备线性的巯基丙酸-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-NH2：将步骤七得到的巯基丙酸(2-氯三苯基)-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂用三氟乙酸切割树脂，然后离心或者过滤得到线性的巯基丙酸-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-NH2；
步骤九、制备依替巴肽：将步骤八中的线性的巯基丙酸-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-NH2在pH＝8-10的条件下，由2,2'-二硫二吡啶催化进行成环反应，得到环状的巯基丙酸-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-NH2，即依替巴肽；
多肽连接试剂包括2-肟氰乙酸乙酯、N,N-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯骈三唑中的一种或者多种。
进一步地，步骤一到七中的脱芴甲氧羰基保护都是加入体积比1:4的哌啶和N,N-二甲基甲酰胺，通过水浴、油浴或者微波加热，在60-80℃下反应2-5分钟。
进一步地，步骤一到七中的清洗都是用N,N-二甲基甲酰胺进行清洗2-3次，3-10mL/次。
进一步地，步骤一到七中的氨基酸在树脂上的缩合反应都是通过水浴、油浴或者微波加热，在60-80℃下，反应10-30分钟。
进一步地，步骤八在将巯基丙酸(2-氯三苯基)-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂进行切割前先以氮气吹干。
进一步地，步骤八中三氟乙酸的纯度为95％，切割温度是25℃，反应时间是1-2小时。
进一步地，步骤九中pH是通过稀氨水调节，成环反应的时间是10-20分钟。
进一步地，还包括步骤十、制备醋酸依替巴肽精品：将步骤九得到的依替巴肽用三氟乙酸进行中和得到沉淀并过滤，以HPLC纯化收集特征峰，然后将收集物旋转蒸馏浓缩后冻干，得到醋酸依替巴肽精品。HPLC是高效液相色谱。
进一步地，通过LC/MS对步骤九中成环反应进行监测。LC/MS是液质联用。
进一步地，步骤一中的溶胀是以二氯甲烷浸泡芴甲氧羰基氨甲基树脂5-15分钟。
本发明提供了一种高效，高产率的工艺合成方法，副产物更少，成环反应更快，具有以下的优点：
1)通过水浴或者油浴以及微波对氨基酸在载体树脂上缩合时进行加热，每次缩合反应在10分钟至30分钟之间，Fmoc脱保护反应在2分钟至5分钟之间。之前的固相合成法中，都以常温进行，每一步缩合反应需要90分钟-120分钟；每一步Fmoc脱保护反应需要10分钟-15分钟。因此，之前的固相合成法，7步氨基酸的连接至少需要14小时的反应时间，而本发明中的方法可以将氨基酸连接至树脂的时间减少到3小时，大大缩短了制备的时间。
2)在二硫键的成环反应中，以前一般是采用的空气、双氧水或者碘氧化等，但本发明采用的是，以2,2'-二硫二吡啶为催化剂，催化形成二硫键成环，由于使用催化成环的方法，本来需要数小时的成环反应，现在只需要10-20分钟，进一步缩短了生产周期。
附图说明
图1是依替巴肽结构式的示意图。
具体实施方式
下面结合附图与具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
Fmoc-Mpr(Trt)-OH购买自成都诚诺新技术有限公司(ChengduChengnuoNew-techCo.,Ltd.)。Fmoc-Linker-AM树脂购买自RappPolymere公司，网址：http://www.rapp-polymere.com/index.php？id＝720。Fmoc-Linker-AM树脂也可以在Sigma公司购买到。
如图1所示，依替巴肽的结构是Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2组成的环肽。
实施例1
1.制备Fmoc-Cys(Trt)-Linker-AM树脂：将80mLFmoc-Linker-AM树脂用10mLDMF洗两次(5mLDMF/次)；然后用10-15mL二氯甲烷浸泡10分钟左右，使树脂充分溶胀，加入10-15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以水浴或者油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应2分钟，抽干，用15mLDMF洗三遍(5mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Cys(Trt)-OH、Oxyma和DIC的混合物10-15mL，以水浴、油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应15分钟左右，抽干，然后用15mLDMF洗三遍(5mLDMF/次)，就得到了Fmoc-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
请注意：Oxyma也可用HOBt代替，所用的氨基酸(比如Fmoc-Cys(Trt)–OH)和缩合试剂(比如Oxyma和DIC)的量是树脂的摩尔数的两倍或以上，以下过程相同。
2.制备Fmoc-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在上面的步骤后，加入10-15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以水浴、油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Pro-OH、Oxyma、DIC的混合物，以水浴、油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，就得到了Fmoc-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
3.制备Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在步骤2.后，加入15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以水浴、油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Trp(Boc)-OH、Oxyma、DIC的混合物，以水浴、油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，就得到了Fmoc-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
4.制备Fmoc-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在步骤3后，加入10-15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以水浴或者油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Oxyma和DIC的混合物，以水浴或者油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Fmoc-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
5.制备Fmoc-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在步骤4后，加入10-15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以水浴或者油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Gly-OH、Oxyma和DIC的混合物，以水浴或者油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Fmoc-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
6.制备Fmoc-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在步骤5后，加入10-15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以水浴或者油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Har-OH、Oxyma和DIC的混合物，以水浴或者油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Fmoc-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
7.制备Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂：在步骤6后，加入10-15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以水浴或者油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Mpr(Trt)-OH、Oxyma和DIC的混合物，以水浴或者油浴或者微波加热，在60℃到80℃下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
8.制备Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2：把Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂以氮气吹干，加入95％的三氟乙酸，3％EDT，2％三异丙基硅烷的混合液在25℃左右进行切割，大概切割1.5个小时，把切割后的母液用冰甲叔丁基醚进行沉淀，然后过滤或者离心得到白色的固体，即得线性Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2。
9.制备醋酸Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2精品：把得到的线性多肽用体积比1：1的乙腈和水进行溶解，然后用稀氨水调pH到8，再加入0.1-0.2当量的2,2'-二硫二吡啶，进行成环反应，10-20分钟，以LC/MS进行反应监测，反应完全后加入三氟乙酸猝灭反应，然后用0.45μm的膜进行过滤，得到澄清的滤液。再把过滤好的滤液进行HPLC纯化，收集依替巴肽的特征峰。然后把收集的产品合并，冻干，以HPLC进行换醋酸盐，即将HPLC的流动相溶液(乙腈加入1％体积的醋酸，水中加入1％体积的醋酸)；再把得到的样品进行冻干后，即得到合格的醋酸依替巴肽精品。
实施例2
1.制备Fmoc-Cys(Trt)-Linker-AM树脂：将60mLFmoc-Linker-AM树脂用12mLDMF洗两次(4mLDMF/次)；然后用10mL二氯甲烷浸泡10分钟左右，使树脂充分溶胀，加入15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以微波加热，在60-80℃下反应2分钟，抽干，用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Cys(Trt)-OH、Oxyma和DIC的混合物15mL，以微波加热，在60-80℃下反应15分钟，抽干，然后用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，就得到了Fmoc-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
请注意：Oxyma也可用HOBt代替，所用的氨基酸(比如Fmoc-Cys(Trt)–OH)和缩合试剂(比如Oxyma和DIC)的量是树脂的摩尔数的两倍，以下过程相同。
2.制备Fmoc-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在上面的步骤后，加入15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以微波加热，在60-80℃下反应2分钟，抽干，用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Pro-OH、Oxyma、DIC的混合物15mL，以微波加热，在60-80℃下反应15分钟，抽干，然后用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，就得到Fmoc-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
3.制备Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在步骤2.后，加入15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以微波加热，在60-80℃下反应2分钟，抽干，用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Trp(Boc)-OH、Oxyma、DIC的混合物15mL，以微波加热，在60-80℃下反应15分钟，抽干，然后用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，就得到Fmoc-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
4.制备Fmoc-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在步骤3后，加入15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以微波加热，在60-80℃下反应2分钟，抽干，用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Oxyma和DIC的混合物15mL，以微波加热，在60-80℃下反应15分钟，抽干，然后用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，就得到Fmoc-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
5.制备Fmoc-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在步骤4后，加入15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以微波加热，在60-80℃下反应2分钟，抽干，用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Gly-OH、Oxyma和DIC的混合物15mL，以微波加热，在60-80℃下反应15分钟，抽干，然后用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，就得到Fmoc-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
6.制备Fmoc-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在步骤5后，加入15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以微波加热，在60-80℃下反应2分钟，抽干，用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Har-OH、Oxyma和DIC的混合物15mL，以微波加热，在60-80℃下反应15分钟，抽干，然后用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，就得到Fmoc-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
7.制备Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂：在步骤6后，加入15mL体积比为1：4的哌啶和DMF，以微波加热，在60-80℃下反应2分钟，抽干，用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Mpr(Trt)-OH、Oxyma和DIC的混合物15mL，以微波加热，在60-80℃下反应15分钟，抽干，然后用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，就得到Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
8.制备Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2：把Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂以氮气吹干，加入95％的三氟乙酸，3％EDT，2％三异丙基硅烷的混合液在28℃进行切割，切割1.5个小时，把切割后的母液用冰甲叔丁基醚进行沉淀，然后过滤或者离心得到白色的固体，即得线性Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2。
9.制备醋酸Mpr-Har-GIy-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2精品：把得到的线性多肽用体积比1：1的乙腈和水进行溶解，然后用稀氨水调pH到8，再加入0.1当量的2,2'-二硫二吡啶，进行成环反应，15分钟，以LC/MS进行反应监测，反应完全后加入三氟乙酸猝灭反应，然后用0.45μm的膜进行过滤，得到澄清的滤液。再把过滤好的滤液进行HPLC纯化，收集依替巴肽的特征峰。然后把收集的产品合并，冻干，以HPLC进行换醋酸盐，即将HPLC的流动相溶液(乙腈加入1％体积的醋酸，水中加入1％体积的醋酸)；再把得到的样品进行冻干后，即得到合格的醋酸依替巴肽精品。
实施例3
1.制备Fmoc-Cys(Trt)-Linker-AM树脂：将60mLFmoc-Linker-AM树脂用9mLDMF洗两次(3mLDMF/次)；然后用15mL二氯甲烷浸泡10分钟左右，使树脂充分溶胀，加入10mL体积比为1：3的哌啶和DMF，以水浴加热，在70℃下反应3分钟，抽干，用9mLDMF洗三遍(3mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Cys(Trt)-OH、Oxyma和DIC的混合物12mL，以水浴加热，在70℃下反应18分钟，抽干，然后用12mLDMF洗三遍(4mLDMF/次)，就得到了Fmoc-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
请注意：Oxyma也可用HOBt代替，所用的氨基酸(比如Fmoc-Cys(Trt)–OH)和缩合试剂(比如Oxyma和DIC)的量是树脂的摩尔数的两倍，以下过程相同。
2.制备Fmoc-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在上面的步骤后，加入10mL体积比为1：3的哌啶和DMF，以水浴加热，在70℃下反应3分钟，抽干，用9mLDMF洗三遍(3mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Pro-OH、Oxyma、DIC的混合物12mL，以水浴加热，在70℃下反应20分钟抽干，然后用9mLDMF洗三遍(3mLDMF/次)，就得到Fmoc-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
3.制备Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在步骤2.后，加入10mL体积比为1：3的哌啶和DMF，以水浴加热，在70℃下反应3分钟，抽干，用9mLDMF洗三遍(3mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Trp(Boc)-OH、Oxyma、DIC的混合物12mL，以水浴加热，在70℃下反应20分钟抽干，然后用9mLDMF洗三遍(3mLDMF/次)，就得到Fmoc-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
4.制备Fmoc-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在步骤3后，加入10mL体积比为1：3的哌啶和DMF，以水浴加热，在70℃下反应3分钟，抽干，用9mLDMF洗三遍(3mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Oxyma和DIC的混合物12mL，以水浴加热，在70℃下反应20分钟抽干，然后用9mLDMF洗三遍(3mLDMF/次)，就得到Fmoc-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
5.制备Fmoc-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在步骤4后，加入10mL体积比为1：3的哌啶和DMF，以水浴加热，在70℃下反应3分钟，抽干，用9mLDMF洗三遍(3mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Gly-OH、Oxyma和DIC的混合物12mL，以水浴加热，在70℃下反应20分钟抽干，然后用9mLDMF洗三遍(3mLDMF/次)，就得到Fmoc-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
6.制备Fmoc-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂，在步骤5后，加入10mL体积比为1：3的哌啶和DMF，以水浴加热，在70℃下反应3分钟，抽干，用9mLDMF洗三遍(3mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Har-OH、Oxyma和DIC的混合物12mL，以水浴加热，在70℃下反应20分钟抽干，然后用9mLDMF洗三遍(3mLDMF/次)，就得到Fmoc-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
7.制备Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂：在步骤6后，加入10mL体积比为1：3的哌啶和DMF，以水浴加热，在70℃下反应3分钟，抽干，用9mLDMF洗三遍(3mLDMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Mpr(Trt)-OH、Oxyma和DIC的混合物12mL，以水浴加热，在70℃下反应20分钟抽干，然后用9mLDMF洗三遍(3mLDMF/次)，就得到Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂。
8.制备Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2：把Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(Otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Linker-AM树脂以氮气吹干，加入95％的三氟乙酸，3％EDT，2％三异丙基硅烷的混合液在28℃进行切割，切割1.8个小时，把切割后的母液用冰甲叔丁基醚进行沉淀，然后过滤或者离心得到白色的固体，即得线性Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2。
9.制备醋酸Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2精品：把得到的线性多肽用体积比1：1的乙腈和水进行溶解，然后用稀氨水调pH到8，再加入0.2当量的2,2'-二硫二吡啶，进行成环反应，10分钟，以LC/MS进行反应监测，反应完全后加入三氟乙酸猝灭反应，然后用0.45μm的膜进行过滤，得到澄清的滤液。再把过滤好的滤液进行HPLC纯化，收集依替巴肽的特征峰。然后把收集的产品合并，冻干，以HPLC进行换醋酸盐，即将HPLC的流动相溶液(乙腈加入1％体积的醋酸，水中加入1％体积的醋酸)；再把得到的样品进行冻干后，即得到合格的醋酸依替巴肽精品。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种依替巴肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备芴甲氧羰基-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将清洗、溶胀和脱芴甲氧羰基保护处理后的芴甲氧羰基氨甲基树脂与芴甲氧羰基-半胱氨酸(2-氯三苯基)-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤二、制备芴甲氧羰基-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将所述步骤一得到的芴甲氧羰基-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-脯氨酸-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤三、制备芴甲氧羰基-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将所述步骤二得到的芴甲氧羰基-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-色氨酸(叔丁氧羰基)-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤四、制备芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将所述步骤三得到的芴甲氧羰基-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤五、制备芴甲氧羰基-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将所述步骤四得到的芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-甘氨酸-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤六、制备芴甲氧羰基-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将所述步骤五得到的芴甲氧羰基-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-高精氨酸-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤七、制备巯基丙酸(2-氯三苯基)-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂：将所述步骤六得到的芴甲氧羰基-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-巯基丙酸(2-氯三苯基)-OH在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到巯基丙酸(2-氯三苯基)-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂；
步骤八、制备线性的巯基丙酸-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-NH2：将所述步骤七得到的巯基丙酸(2-氯三苯基)-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂用三氟乙酸切割树脂，然后离心或者过滤得到线性的巯基丙酸-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-NH2；
步骤九、制备依替巴肽：将所述步骤八中的线性的巯基丙酸-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-NH2在pH＝8-10的条件下，由2,2'-二硫二吡啶催化进行成环反应，得到环状的巯基丙酸-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-NH2，即依替巴肽；
所述多肽连接试剂包括2-肟氰乙酸乙酯、N,N-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯骈三唑中的一种或者多种。
2.如权利要求1所述的依替巴肽的合成方法，其特征在于，所述步骤一到七中的脱芴甲氧羰基保护都是加入体积比1:4的哌啶和N,N-二甲基甲酰胺，通过水浴、油浴或者微波加热，在60-80℃下反应2-5分钟。
3.如权利要求1所述的依替巴肽的合成方法，其特征在于，所述步骤一到七中的清洗都是用N,N-二甲基甲酰胺进行清洗2-3次，3-10mL/次。
4.如权利要求1所述的依替巴肽的合成方法，其特征在于，所述步骤一到七中的氨基酸在树脂上的缩合反应都是通过水浴、油浴或者微波加热，在60-80℃下，反应10-30分钟。
5.如权利要求1所述的依替巴肽的合成方法，其特征在于，所述步骤八在将巯基丙酸(2-氯三苯基)-高精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-色氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(2-氯三苯基)-氨甲基树脂进行切割前先以氮气吹干。
6.如权利要求1所述的依替巴肽的合成方法，其特征在于，所述步骤八中三氟乙酸的纯度为95％，切割温度是25℃，反应时间是1-2小时。
7.如权利要求1所述的依替巴肽的合成方法，其特征在于，所述步骤九中pH是通过稀氨水调节，所述成环反应的时间是10-20分钟。
8.如权利要求1所述的依替巴肽的合成方法，其特征在于，还包括步骤十、制备醋酸依替巴肽精品：将所述步骤九得到的依替巴肽用三氟乙酸进行中和得到沉淀并过滤，以HPLC纯化收集特征峰，然后将收集物旋转蒸馏浓缩后冻干，得到醋酸依替巴肽精品。
9.如权利要求1所述的依替巴肽的合成方法，其特征在于，通过LC/MS对所述步骤九中成环反应进行监测。
10.如权利要求1-9任一项所述的依替巴肽的合成方法，其特征在于，所述步骤一中的溶胀是以二氯甲烷浸泡芴甲氧羰基氨甲基树脂5-15分钟。
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