CN105548432A - 一种比伐卢定中氨基酸的检测分析方法 - Google Patents

Abstract

一种比伐卢定中氨基酸的检测分析方法，属于高效液相色谱检测技术领域，包括如下步骤：（1）衍生前处理程序：6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）柱前衍生；（2）样品检测：AccQ?Tag氨基酸分析C18柱，3.9×150mm，4μm，柱温：37℃，流速：1.0mL/min，检测波长：254nmUV，流动相A：量取100mLAccQ?Tag洗脱剂A，加入900mL水混合均匀即得；流动相B：乙腈；流动相C：纯水，梯度洗脱。本发明系统适用性试验和色谱系统回校均符合要求，测试结果可靠，且本发明省去了购买waters提供的浓缩A液，节约了成本。

Description

一种比伐卢定中氨基酸的检测分析方法

技术领域

本发明属于高效液相色谱检测领域，具体涉及一种比伐卢定中氨基酸的检测分析方法。

背景技术

高效液相色谱法是利用衍生化试剂将荧光基团加在氨基酸的氨基上，然后通过荧光和紫外检测器进行检测。此方法较灵敏，分离条件较易改进，通用性强，分析速度较快。1993年，Waters公司开发了反相高效液相色谱法方法-AccQ·Tag法。此法操作简单；灵敏度极高，定量结果准确；精确度高，重复性好。能够较好地分离天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸17种氨基酸。比伐卢定作为一种常见药，但是关于比伐卢定中氨基酸成分的测定方法报道甚少，因此探寻比伐卢定中氨基酸成分的测定方法是目前迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种比伐卢定中氨基酸的检测分析方法。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种比伐卢定中氨基酸的检测分析方法，包括如下步骤：

（1）衍生前处理程序：6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）柱前衍生；

（2）样品检测：AccQ·Tag氨基酸分析C18柱，3.9×150mm，4μm，柱温：37℃，流速：1.0mL/min，检测波长：254nmUV，流动相A：量取100mLAccQ·Tag洗脱剂A浓溶液，加入900mL水混合均匀即得；流动相B：乙腈；流动相C：纯水；

梯度洗脱程序：0~36min，流动相A：100%~78%，流动相B：0~22%，流动相C：0；36.01~40min，流动相A：0%，流动相B：60%，流动相C：40%；

40.01~50min，流动相A：100%，流动相B：0，流动相C：0；

（3）结果判定：将待测比伐卢定和氨基酸标样谱图对比，根据下式计算比伐卢定中各氨基酸的含量，

计算公式：

M_RX：测得氨基酸组分相对摩尔比值；

Mx：样品衍生溶液中某氨基酸摩尔数；

Aspl：样品衍生溶液中某氨基酸峰面积；

Aistd：样品衍生溶液中内标物质峰面积；

Aistd’：氨基酸标样衍生溶液中内标物质峰面积；

Astd：氨基酸标样衍生溶液中某氨基酸峰面积；

Rspl：样品衍生溶液中某氨基酸峰与内标物峰比值；

：氨基酸标样衍生溶液中氨基酸峰与内标物峰比值的平均值；

Cstd：氨基酸标准样品溶液衍生前所含对应氨基酸摩尔浓度，μmol/μl；

S：测定得到样品衍生溶液中的氨基酸的摩尔数之和。

所述步骤（1）中柱前衍生包括氨基酸标样衍生溶液和样品比伐卢定衍生溶液的制备，样品比伐卢定衍生溶液的制备包括如下步骤：

1）水解样品的制备

取比伐卢定25mg，一式两份，精密称定，置10ml容量瓶中,加水释释定容至刻度，混匀；用微量移液器移取50μl上述溶液注入清洁的自动进样瓶底部，置真空干燥箱，55℃真空干燥样品溶液10min；在20ml的反应瓶中加入300μl的含0.1%苯酚的6mol/L盐酸，将自动进样瓶放入反应瓶，用氮气吹扫反应瓶2分钟，用瓶塞密封反应瓶，在110℃水解24小时；冷却反应瓶，打开瓶塞，擦去自动进样瓶外过量的盐酸，并在55℃真空干燥，得水解样品；

2）含内标物的水解样品

加500ul水到水解样品中，溶解，涡旋混匀，得到水解样品稀释液，量取100μl水解样品稀释液注入清洁的6×50mm样品管，加入140μl-氨基丁酸内标稀释液，加入110μl水，涡旋混匀，得到含内标物的水解样品，该含内标物的水解样品含内标的浓度为0.0001μmol/μl；

3）样品的衍生

分别量取10μl含内标物的水解样品，注入清洁的6×50mm样品管底部，加入70μl硼酸盐缓冲液到样品管中，涡旋混合，加入20μl衍生试剂到样品管中，立即涡旋混匀，放置1分钟，将样品管用封口膜密封后，在55℃加热10分钟，取出，放冷至室温，即得样品衍生溶液。

所述步骤（2）中AccQ·Tag洗脱剂A浓溶液的配制过程如下：

（a）EDTA溶液的配制：

称取EDTA100mg，溶于100ml水中，超声振荡至全部溶解；

（b）称取NaAc·3H₂O190.4g，加1000ml纯水，搅拌，溶解，用浓磷酸（质量分数85wt%，物质的量浓度15mol/L，下同）调pH值为5.2；

（c）向（b）中依次加入步骤（a）的EDTA溶液、0.1g叠氮钠、23.7ml三乙胺；

（d）将（c）的混合溶液用浓磷酸调pH值至4.95；

（e）将（d）的混合溶液用水溶性过滤器过滤，滤液4℃储备，备用。

本发明系统适用性试验和色谱系统回校均符合要求，测试结果可靠，且本发明省去了购买waters提供的浓缩A液，节约了成本。

附图说明

图1是空白溶液的高效液相色谱图；

图2至6是系统适用性试验中5针氨基酸标样衍生溶液的高效液相色谱图；

图7是色谱系统回校中氨基酸标样衍生溶液的高效液相色谱图；

图8、图9是样品衍生溶液1、样品衍生溶液2的高效液相色谱图。

具体实施方式

实施例1

比伐卢定氨基酸的测定：

1仪器及试剂：分析天平（±0.01mg）、高效液相色谱仪戴安U-3000、微型旋涡混合仪、真空干燥箱、干式恒温器、水解氨基酸标样（含17种水解氨基酸，天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸各2.5μmol/ml，胱氨酸为1.25μmol/ml）、WatersAccQ·Fluor试剂盒（氨基酸专利衍生剂）、AccQ·Tag洗脱剂A浓溶液、L--氨基丁酸、乙腈（色谱级）、浓盐酸（分析纯）、苯酚（分析纯）、纯水（娃哈哈纯净水）。

2色谱条件：

色谱柱：AccQ·Tag氨基酸分析柱C18（3.9×150mm，4μm）

进样体积：5μl，

柱温：37℃，

流速：1.0ml/min，

检测波长：254nmUV

洗脱梯度程序见表1：

表1

流动相A：量取100mlAccQ·Tag洗脱剂A浓溶液，加入900ml水混合均匀即可；

流动相B：乙腈；

流动相C：纯水

AccQ·Tag洗脱剂A浓溶液的配制过程如下：

（a）EDTA(乙二胺四乙酸二钠)溶液的配制：

EDTA（二钠盐）称取100mg，溶于100ml水中，超声振荡溶解；

实际称样量：EDTA（二钠盐）称样量101.36mg；

（b）称取NaAc·3H₂O190.4g，加1000ml纯水，搅拌，溶解，用浓磷酸（质量分数85wt%，物质的量浓度15mol/L，下同）调pH值为5.2，

NaAc·3H₂O实际称样量190.43，加1000ml溶解后pH为8.03，再用浓磷酸调pH值为5.2；

（c）向（b）中依次加入10mlEDTA溶液、0.1g叠氮钠（NaN₃）、23.7ml三乙胺（约17.2g）；

（d）将（c）的混合溶液用浓磷酸调pH值至4.95；

（e）将（d）混合溶液用水溶性过滤器过滤；

（f）将（e）滤液置于4℃储备，备用（可保存6个月）。以上试剂级别均为分析纯。

3溶液的配制：

3.1含0.1%苯酚的6mol/L盐酸称取苯酚100mg，置100ml容量瓶中，加浓盐酸（质量分数36~38%，物质的量浓度约12mol/L，下同）50ml溶解后，加水释释定容至刻度，混匀，即得。

3.20.1N盐酸量取9ml浓盐酸，注入1000ml水中，混匀，即得。

3.3-氨基丁酸（AABA）内标储备液称取25.8mg-氨基丁酸（AABA）置于100ml容量瓶中，加0.1N盐酸稀释定容至刻度，混匀，即得。

3.4-氨基丁酸（AABA）内标稀释液取100μl-氨基丁酸（AABA）内标储备液，加入到900μl水中，混合均匀，即为0.00025μmol/μl的-氨基丁酸（AABA）内标稀释液。

3.5含内标物的校正标样：在清洁的自动进样瓶中加入40μl-氨基丁酸内标储备液、40μlWaters水解氨基酸标样和920μl水，混匀，此含内标物的校正标样中含各种氨基酸和内标物的摩尔浓度均为0.0001μmol/μl(含胱氨酸摩尔浓度为0.00005μmol/μl，相当于含半胱氨酸摩尔浓度为0.0001μmol/μl)。

3.6样品水解取比伐卢定约25mg，精密称定（1式2份，记为样品1、样品2），置10ml容量瓶中，加水释释定容至刻度，混匀；用微量移液器移取50μl上述溶液注入清洁的自动进样瓶底部，置真空干燥箱，室温真空（真空度不高于-0.1MPa）干燥至少1h；在20ml的反应瓶中加入300μl的含0.1%苯酚的6mol/L盐酸，将自动进样瓶放入反应瓶，用氮气吹扫反应瓶2分钟，以排除两瓶中的空气；用塞密封反应瓶。在110℃水解24小时，冷却反应瓶，小心打开瓶塞，擦去自动进样瓶外过量的盐酸，室温真空（真空度不高于-0.1MPa）干燥至少30min，得水解样品。

3.7含内标物的水解样品加500μl水到水解样品中，溶解，涡旋混匀，得到水解后样品稀释液，分别量取100μl水解后样品稀释液注入清洁的6×50mm样品管，加入140μl-氨基丁酸（AABA）内标稀释液，加入110μl水，涡旋混匀，得到含内标物的水解样品，该含内标物的水解样品含内标的浓度为0.0001μmol/μl。

3.8衍生试剂从衍生剂稀释液(WatersAccQ·Fluor试剂盒2B瓶)中吸取1ml稀释剂置衍生剂粉末(WatersAccQ·Fluor试剂盒2A瓶)中，密塞振摇使溶解，在55℃下加热，一般时间不超过10min，若未全溶可适当延长时间，至溶解完全，取出，放冷至室温，备用。

3.9空白样衍生在样品管中加入80μl硼酸盐缓冲液(WatersAccQ·Fluor试剂盒1瓶)，加入20μl衍生试剂，涡旋混匀，放置1分钟，使过量的衍生剂水解为AMQ，将样品管中的反应物转移到一只微量自动进样瓶中，加盖密封，得到衍生空白样，衍生空白样无需加热。

3.10样品的衍生分别量取10μl含内标物的水解样品，注入清洁的6×50mm样品管底部，加入70μl硼酸盐缓冲液(WatersAccQ·Fluor试剂盒1瓶)到样品管中，涡旋混匀，加入20μl衍生试剂到样品管中，立即涡旋混合几秒钟，放置1分钟，将样品管用封口膜密封后，放在55℃的加热装置中加热10分钟，取出，放冷至室温，即得样品衍生溶液。

3.11含内标物校正标样的衍生分别量取10μl含内标物的校正标样，注入清洁的6×50mm样品管底部，加入70μl硼酸盐缓冲液(WatersAccQ·Fluor试剂盒1瓶)到样品管中，涡旋混匀，加入20μl衍生剂到样品管中，立即涡旋混合几秒钟，放置1分钟，将样品管用封口膜密封后，放在55℃的加热装置中加热10分钟，取出，放冷至室温，即得氨基酸标样衍生溶液。

4系统适用性试验：

系统适用性试验操作方法：精密量取空白溶液5μl，注入液相色谱仪，记录谱图，如图1所示，连续注入5针氨基酸标样衍生溶液，记录色谱图，如图2至6所示，5针氨基酸标样中17个氨基酸和内标物峰面积比值的RSD不大于2.0%；AMQ，Asp，NH₃，Arg，Cys和Phe峰保留时间的RSD不大于2.0%；4对氨基酸峰（Arg、Thr；Cys、Tyr；Val、Met和Ile、Leu）的峰高与峰谷比率大于9.0。

5进样序列见表2：

表2

6色谱系统回校如图7所示，氨基酸标样衍生溶液中17个氨基酸和内标物峰面积比值的RSD不大于2.0%；AMQ，Asp，NH₃，Arg，Cys和Phe峰保留时间的RSD不大于3.0%。

7结果与判定

样品衍生溶液1、样品衍生溶液2的高效液相色谱图如图8、9所示，由图8和9可知，样品比伐卢定中含有精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和甘氨酸。

计算公式：

S：测定得到精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、天冬氨酸（Asp）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）的摩尔数之和，

M_RX：测得某氨基酸组分相对摩尔比值，

Mx：水解样品稀释液中各氨基酸摩尔数（mol），

Aspl：样品衍生溶液中各氨基酸峰面积，

Aistd：样品衍生溶液中内标物质峰面积，

Aistd’：氨基酸标样衍生溶液中内标物质峰面积，

Astd：氨基酸标样衍生溶液中各氨基酸峰面积，

Rspl：样品衍生溶液中各氨基酸峰与内标物峰比值，

：氨基酸标样衍生溶液中氨基酸峰与内标物峰比值的平均值，

Cstd：含内标物氨基酸标准样品溶液衍生前所含对应氨基酸摩尔浓度（μmol/μl）。

表3样品衍生溶液中各氨基酸峰与内标物峰比值（公式中对应的Rspl）

表4样品衍生溶液中各氨基酸摩尔数Mx和S

表5样品衍生溶液各氨基酸组分相对摩尔比值M_RX

Claims (3)

1.一种比伐卢定中氨基酸的检测分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）衍生前处理程序：6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）柱前衍生；

（2）样品检测：AccQ·Tag氨基酸分析C18柱，3.9×150mm，4μm，柱温：37℃，流速：1.0mL/min，检测波长：254nmUV，流动相A：量取100mLAccQ·Tag洗脱剂A浓溶液，加入900mL水混合均匀即得；流动相B：乙腈；流动相C：纯水；

梯度洗脱程序：0~36min，流动相A：100%~78%，流动相B：0~22%，流动相C：0；

36.01~40min，流动相A：0%，流动相B：60%，流动相C：40%；

40.01~50min，流动相A：100%，流动相B：0，流动相C：0；

（3）结果判定：将待测比伐卢定和氨基酸标样谱图对比，根据下述计算公式计算比伐卢定中各氨基酸的含量，

M_RX：测得氨基酸组分相对摩尔比值；

Mx：样品衍生溶液中某氨基酸摩尔数；

Aspl：样品衍生溶液中某氨基酸峰面积；

Aistd：样品衍生溶液中内标物质峰面积；

Aistd’：氨基酸标样衍生溶液中内标物质峰面积；

Astd：氨基酸标样衍生溶液中某氨基酸峰面积；

Rspl：样品衍生溶液中某氨基酸峰与内标物峰比值；

：氨基酸标样衍生溶液中氨基酸峰与内标物峰比值的平均值；

Cstd：氨基酸标准样品溶液衍生前所含对应氨基酸摩尔浓度，μmol/μl；

S：测定得到样品衍生溶液中的氨基酸的摩尔数之和。

2.根据权利要求1所述的比伐卢定中氨基酸的检测分析方法，其特征在于，所述步骤（1）中柱前衍生包括氨基酸标样衍生溶液和比伐卢定样品衍生溶液的制备，比伐卢定样品衍生溶液的制备包括如下步骤：

1）水解样品的制备

取比伐卢定25mg，一式两份，精密称定，置10ml容量瓶中,加水释释定容至刻度，混匀；用微量移液器移取50μl上述溶液注入清洁的自动进样瓶底部，室温真空干燥；在20ml的反应瓶中加入300μl含0.1%苯酚的6mol/L盐酸，将自动进样瓶放入反应瓶内，用氮气吹扫反应瓶2分钟，用瓶塞密封反应瓶，在110℃水解24小时；冷却反应瓶，打开瓶塞，擦去自动进样瓶外过量的盐酸，室温真空干燥，得水解样品；

2）含内标物的水解样品

加500μl水到水解样品中，溶解，涡旋混匀，得到水解样品稀释液，量取100μl水解样品稀释液注入清洁的6×50mm样品管，加入140μl-氨基丁酸内标稀释液，再加入110μl水，涡旋混匀，得到含内标物的水解样品，该含内标物的水解样品含内标的浓度为0.0001μmol/μl；

3）样品的衍生

分别量取10μl含内标物的水解样品，注入清洁的6×50mm样品管底部，加入70μl硼酸盐缓冲液到样品管中，涡旋混合，加入20μl衍生试剂到样品管中，立即涡旋混匀，放置1分钟，将样品管用封口膜密封后，在55℃加热10分钟，取出，放冷至室温，即得样品衍生溶液。

3.根据权利要求1所述的比伐卢定中氨基酸的检测分析方法，其特征在于，所述步骤（2）中AccQ·Tag洗脱剂A浓溶液的配制过程如下：

（a）EDTA溶液的配制：

称取EDTA100mg，溶于100ml水中，超声振荡至全部溶解；

（b）称取NaAc·3H₂O190.4g，加1000ml纯水，搅拌，溶解，用浓磷酸调pH值为5.2；

（c）向（b）中依次加入步骤（a）的EDTA溶液、0.1g叠氮钠、23.7ml三乙胺；

（d）将（c）的混合溶液用浓磷酸调pH值至4.95；

（e）将（d）的混合溶液用水溶性过滤器过滤，滤液4℃储备，备用。