CN104280475B - 复方氨基酸（15）双肽（2）注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复方氨基酸（15）双肽（2）注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量检测方法，该方法包括精密量取被测样品及对照品溶液，注入带磺酸基强酸性阳离子交换树脂LCAK06/Na柱的色谱仪，通过流动相缓冲液A、B和再生液进行梯度洗脱与再生平衡，以及衍生试剂茚三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为440nm和570nm下记录色谱图，按外标法以峰面积计算。该方法能同时检测出十五种氨基酸及甘氨酰谷氨酰胺含量，具有低廉、快速及灵敏度高的优点，通过周密的方法学验证，结果表明可用于同时检测复方氨基酸（15）双肽（2）注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量，考察稳定性样品中十七种主药含量的变化。
Description
技术领域
本发明涉及一种氨基酸制剂的含量检测方法，特别是复方氨基酸(15)双肽(2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量检测方法。
背景技术
复方氨基酸(15)双肽(2)注射液为15种氨基酸和2种二肽组成的灭菌水溶液，处方为每1000ml含有：L-丙氨酸(C3H7NO2)16.00g，L-精氨酸(C6H14N4O2)11.30g，L-天冬氨酸(C4H7NO4)3.4g，L-谷氨酸(C5H9NO4)5.60g，L-组氨酸(C6H9N3O2)6.80g，L-异亮氨酸(C6H13NO2)5.60g，L-亮氨酸(C6H13NO2)7.90g，L-赖氨酸醋酸盐(C6H14N2O2·C2H4O2)12.70g，L-蛋氨酸(C5H11NO2S)5.60g，L-苯丙氨酸(C9H11NO2)5.85g，L-脯氨酸(C5H9NO2)6.80g，L-丝氨酸(C3H7NO3)4.50g，L-苏氨酸(C4H9NO3)5.60g，L-色氨酸(C11H12N2O2)1.90g，L-缬氨酸(C5H11NO2)7.30g，一水合甘氨酰谷氨酰胺(C7H13N3O4·H2O)30.27g，二水合甘氨酰酪氨酸3.45g(相当于甘氨酸0.94g；酪氨酸2.28g)
该产品含18种人体必须或非必须氨基酸组成的肠外营养注射剂，根据患者肠外营养的需要提供相应的氨基酸，其中甘氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸三种氨基酸以甘氨酸-谷氨酰胺、甘氨酰-酪氨酸的双肽形式存在。两种双肽(甘氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-酪氨酸)用于提供谷氨酰胺和酪氨酸以促进蛋白质的合成，在体内直接完全分解为甘氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸三种游离氨基酸。
由于复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中成分复杂，对其各组分进行定量分析较为困难。现有技术如中国专利CN103134892A公开了复方氨基酸(15)双肽(2)注射液的分析方法，采用高效液相色谱检测方法，色谱条件为采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱检测，检测波长为265-280nm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为甲醇，流动相B是通过缓冲溶液调节的pH值2.0-4.0的水溶液，但此方法只是测定的色氨酸和甘氨酰-酪氨酸的含量；叶晓林等人在《复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中两组分的含量测定》(中国药业，2008年07期)中报道了用反相高效色谱法测定氨基酸(15)双肽(2)注射液中两种多肽，即甘氨酰-谷氨酰胺(GQ)和甘氨酰-酪氨酸(GY)的含量，该文献公开的方法，使用乙腈与0.05mol/L的磷酸二氢钠溶液作为流动相，采用了梯度淋洗法，并且还采用了FDNB进行了柱前衍生化处理，该方法检测方法复杂，操作步骤多，而且不能同时检测出十五中氨 基酸的含量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种复方氨基酸(15)双肽(2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量检测方法，该方法能同时检测出十五种氨基酸及甘氨酰谷氨酰胺含量，具有低廉、快速及灵敏度高的优点，通过周密的方法学验证，结果表明可用于同时检测复方氨基酸(15)双肽(2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量，考察稳定性样品中十七种主药含量的变化。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：复方氨基酸(15)双肽(2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量检测方法，该方法包括精密量取被测样品及对照品溶液，注入带磺酸基强酸性阳离子交换树脂LCAK06/Na柱的色谱仪，通过流动相缓冲液A、B和再生液进行梯度洗脱与再生平衡，以及衍生试剂茚三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为440nm和570nm下记录色谱图，按外标法以峰面积计算；
其中，所述流动相缓冲液A的配制为：二水合柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g、乙醇65ml、37％的盐酸5.6ml、辛酸0.1ml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH至2～4；
所述流动相缓冲液B的配制为：二水合柠檬酸三钠19.6g、氢氧化钠3.1g、硼酸5.0g、辛酸0.1ml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH至10～11；
所述再生液的配制为：氢氧化钠20g、EDTA0.2g置1000ml量瓶中，加水定容至刻度；
所述衍生试剂茚三酮溶液的配制为：取茚三酮2g，加乙醇溶解至100mL。
作为优选方案，所述流动相缓冲液A的pH为3.45，流动相缓冲液B的pH为10.85。
作为优选方案，所述方法包括以下步骤：
S1.制备被测样品溶液：精密称取被测样品5ml，置于50ml容量瓶中，用样品稀释液定容至刻度，摇匀；再精密量取定溶液2ml，用样品稀释液定容至100ml，摇匀，即得；所述样品稀释液为取36％盐酸1.5ml稀释至1000ml；
S2.制备对照品溶液:精密称取对照品，用样品稀释液制成每1ml中含有门冬氨酸0.34mg、谷氨酸0.56mg、丝氨酸0.45mg、组氨酸0.68mg、甘氨酰谷氨酰胺3.027mg、精氨酸1.13mg、苏氨酸0.56mg、丙氨酸1.6mg、脯氨酸0.68mg、缬氨酸0.73mg、甲硫氨酸0.56mg、异亮氨酸0.56mg、亮氨酸0.79mg、苯丙氨酸0.585mg、醋酸赖氨酸1.27mg的对照品溶液；所述样品稀释液为取36％盐酸1.5ml稀释至1000ml；
S3.上样、分离及梯度洗脱：分别将待测样品溶液和对照品溶液20μl注入色谱仪，通过流动相缓冲液A、B和再生液进行梯度洗脱与再生平衡，于高温反应器中采用衍生试剂茚三 酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为440nm和570nm下记录色谱图，按外标法以峰面积计算；
其中，色谱仪的色谱条件为：带磺酸基强酸性阳离子交换树脂LCAK06/Na柱；高温反应器温度为：130℃；茚三酮流速：0.25ml/min；茚三酮停止时间：47min；采集时间：50min；流动相缓冲液A的流速：0.45ml/min；流动相缓冲液B的流速：0.45ml/min；再生液的流速：0.45ml/min；氨基酸分析柱温：57～74℃。
所述按外标法以峰面积计算公式为供试品标示含量(％)＝(供试品溶液峰面积/标准品溶液峰面积)×100％。
本发明中测定的氨基酸为：门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酰谷氨酰胺(简称GQ)、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、醋酸赖氨酸、精氨酸。
本发明具有以下优点：本发明使用普通的磺酸基强酸性阳离子交换树脂为色谱柱填充剂，设备要求不高，流动相选用两个介质普通易得，可行性高，操作过程简单方便，重复性好，样品分析时间短，只需要约62分钟，能同时检测出十五种氨基酸及甘氨酰谷氨酰胺含量，通过周密的方法学验证，结果表明可用于同时检测复方氨基酸(15)双肽(2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量，考察稳定性样品中十七种主药含量的变化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实施例1：
1.测定条件
仪器：德国sykam公司的S-433D氨基酸分析仪。
色谱柱：采用阳离子交换色谱柱LCAK06/Na(4.6×150mm)磺酸基强酸性阳离子交换树脂
2.测定法
S1.制备流动相缓冲液、再生液及衍生试剂
A.述流动相缓冲液A的配制为：二水合柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g、乙醇65ml、37％的盐酸5.6ml、辛酸0.1ml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH至2～4；
B.流动相缓冲液B的配制为：二水合柠檬酸三钠19.6g、氢氧化钠3.1g、硼酸5.0g、辛酸0.1ml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH至10～11；
C.再生液的配制为：氢氧化钠20g、EDTA0.2g置1000ml量瓶中，加水定容至刻度；
D.衍生试剂茚三酮溶液的配制为：取茚三酮2g，加乙醇使溶解成100mL，即得。
S2.制备被测样品溶液：精密称取被测样品5ml(生产厂商：四川科伦药业股份有限公司，生产批号为：H14092501)，置于50ml容量瓶中，用样品稀释液定容至刻度，摇匀；再精密量取定溶液2ml，用样品稀释液定容至100ml，摇匀，即得；所述样品稀释液为取36％盐酸1.5ml稀释至1000ml；
S3.制备对照品溶液:精密称取对照品门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酰谷氨酰胺(简称GQ)、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、醋酸赖氨酸、精氨酸，用样品稀释液制成每1ml中含有门冬氨酸0.34mg、谷氨酸0.56mg、丝氨酸0.45mg、组氨酸0.68mg、甘氨酰谷氨酰胺3.027mg、精氨酸1.13mg、苏氨酸0.56mg、丙氨酸1.6mg、脯氨酸0.68mg、缬氨酸0.73mg、甲硫氨酸0.56mg、异亮氨酸0.56mg、亮氨酸0.79mg、苯丙氨酸0.585mg、醋酸赖氨酸1.27mg的对照品溶液；所述样品稀释液为取36％盐酸1.5ml稀释至1000ml；
S4.上样、分离及梯度洗脱：分别将待测样品溶液和对照品溶液20μl注入色谱仪，通过流动相缓冲液A、B和再生液进行梯度洗脱与再生平衡，于高温反应器中采用衍生试剂茚三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为440nm和570nm下记录色谱图，按外标法以峰面积计算，计算公式为：
供试品标示含量(％)＝(供试品溶液峰面积/标准品溶液峰面积)×100％
其中，色谱仪的色谱条件为：带磺酸基强酸性阳离子交换树脂LCAK06/Na柱；高温反应器温度为：130℃；茚三酮流速：0.25ml/min；茚三酮停止时间：47min；采集时间：50min；流动相缓冲液A的流速：0.45ml/min；流动相缓冲液B的流速：0.45ml/min；再生液的流速：0.45ml/min；氨基酸分析柱温：57～74℃。
柱温程序如表1所示，泵梯度如表2所示。
表1：柱温程序
| 时间(min) | 温度(℃) |
| 0 | 58 |
| 23.0 | 58 |
| 28.0 | 74 |
| 50.0 | 74 |
| 55.0 | 58 |
| 61.0 | 57 |
表2：泵梯度
| 时间(min) | 缓冲液A | 缓冲液B | 再生液 | 缓冲泵流速(ml/min) |
| 0.00 | 100 | 0 | 0 | 0.45 |
| 3.00 | 100 | 0 | 0 | 0.45 |
| 5.00 | 87 | 13 | 0 | 0.45 |
| 7.00 | 87 | 13 | 0 | 0.45 |
| 9.00 | 91 | 9 | 0 | 0.45 |
| 13.00 | 85 | 15 | 0 | 0.45 |
| 14.00 | 84 | 16 | 0 | 0.45 |
| 15.00 | 84 | 16 | 0 | 0.45 |
| 20.00 | 80 | 20 | 0 | 0.45 |
| 25.00 | 67 | 33 | 0 | 0.45 |
| 29.00 | 20 | 80 | 0 | 0.45 |
| 31.00 | 20 | 80 | 0 | 0.45 |
| 32.00 | 0 | 100 | 0 | 0.45 |
| 45.00 | 0 | 100 | 0 | 0.45 |
| 45.10 | 0 | 0 | 100 | 0.45 |
| 48.10 | 0 | 0 | 100 | 0.45 |
| 48.20 | 100. | 0 | 0 | 0.45 |
| 61.20 | 100 | 0 | 0 | 0.45 |
| 61.30 | 100 | 0 | 0 | 0.00 |
3.测定结果
计算结果如表3所述。
表3：复方氨基酸(15)双肽(2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺的含量
| 氨基酸 | 计算的含量(％) |
| 门冬氨酸 | 98.8 |
| 苏氨酸 | 103.4 |
| 丝氨酸 | 97.4 |
| 谷氨酸 | 97.3 |
| 脯氨酸 | 101.6 |
| 丙氨酸 | 100.0 |
| 缬氨酸 | 99.8 |
| 甘氨酰谷氨酰胺 | 105.3 |
| 甲硫氨酸 | 95.6 |
| 异亮氨酸 | 99.5 |
| 亮氨酸 | 103.0 |
| 苯丙氨酸 | 99.1 |
| 组氨酸 | 99.1 |
| 醋酸赖氨酸 | 99.1 |
| 精氨酸 | 99.7 |
实施例2：氨基酸及甘氨酰谷氨酰胺定位
1.实验方法
分别称取对照品门冬氨酸12.52mg、苏氨酸12.05mg、丝氨酸12.45mg、谷氨酸11.98mg、脯氨酸12.02mg、丙氨酸12.07mg、缬氨酸11.88mg、甘氨酰谷氨酰胺(GQ)12.65mg、甲硫氨酸12.05mg、异亮氨酸12.36mg、亮氨酸12.22mg、苯丙氨酸12.56mg、组氨酸11.78mg、醋酸赖氨酸12.05mg、精氨酸12.44mg分别置于50ml容量瓶中，加样品稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。按照实施例1的测定条件进样分析。
2.实验结果
氨基酸出峰顺序及保留时间如表4所示。
表4：氨基酸含量测定方法学-氨基酸定位
| 出峰顺序 | 氨基酸名称 | 保留时间(min) |
| 1 | 门冬氨酸 | 7.824 |
| 2 | 苏氨酸 | 10.024 |
| 3 | 丝氨酸 | 10.872 |
| 4 | 谷氨酸 | 11.944 |
| 5 | 脯氨酸 | 13.8 |
| 6 | 丙氨酸 | 18.944 |
| 7 | 缬氨酸 | 20.36 |
| 8 | GQ | 21.552 |
| 9 | 甲硫氨酸 | 22.992 |
| 10 | 异亮氨酸 | 25.672 |
| 11 | 亮氨酸 | 26.904 |
| 12 | 苯丙氨酸 | 31.768 |
| 13 | 组氨酸 | 36.64 |
| 14 | 醋酸赖氨酸 | 40.128 |
| 15 | 精氨酸 | 43.648 |
实施例3：空白干扰试验
1.实验方法
空白溶液的配制：按照处方量(缺以上14种氨基酸与甘氨酰谷氨酰胺)配制，按照实施例2供试品溶液的制备方法制样，即得。
分别取样品稀释液、空白溶液、对照品溶液按照上述分析条件进行进样分析。
2.实验结果
结果显示空白溶液、样品稀释液在对照品溶液各种氨基酸位置不出峰，不干扰其测定，且对照品溶液各种氨基酸峰分离度均符合规定。
实施例4：线性和范围
1.实验方法
氨基酸对照品储备液的配制：精密称取对照品门冬氨酸33.40mg、苏氨酸56.58mg、丝氨酸45.17mg、谷氨酸55.92mg、丙氨酸160.74mg、缬氨酸73.22mg、丙氨酰谷氨酰胺309.32mg、甲硫氨酸57.03mg、异亮氨酸56.11mg、亮氨酸79.32mg、苯丙氨酸58.56mg、组氨酸73.56mg、醋酸赖氨酸127.37mg、精氨酸113.58mg、脯氨酸68.2mg置100ml量瓶中，加样品稀释液溶解并定容至刻度，摇匀。即得氨基酸对照品储备液。
分别精密量取氨基酸对照品储备液0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.5ml置不同定容50ml容量瓶中，加样品稀释液稀释至刻度，摇匀，按照规定的测量条件进行进样测定。
2.实验结果
结果见表5。
表5：氨基酸含量测定方法学-线性与范围
实施例5：重复性实验
1.实验方法
精密量取复方氨基酸(15)双肽(2)注射液5ml置50ml容量瓶中，用样品稀释液定容，摇匀；再精密量取上述溶液2ml，置100ml容量瓶中，用样品稀释液定容，摇匀；平行制备6份供试品溶液，按照规定的测量条件进行进样测定，记录色谱图。
2.实验结果
结果见表6。
表6.氨基酸含量测定方法学-重复性
由表6可知：该方法重复性较好，其相对标准偏差均小于3％，符合要求。
实施例6：中间精密度实验
由两名检验员(检验员1和检验员2)对同一批号复方氨基酸(15)双肽(2)注射液在不同的时间(2014-05-31和2014-05-30)按照规定的测量条件进行进样测定，结果见表7。
表7.氨基酸含量测定方法学-中间精密度
实施例7：准确度
1.空白溶液的配制：精密量取实施例3的空白溶液5ml置50ml容量瓶中，用样品稀释液定容，摇匀。
2.标示量(80％、100％、120％)浓度样品配制：分别精密量取空白溶液1ml置9个不同的50ml容量瓶中，加入氨基酸对照品储备液0.8ml(80％)、1.0ml(100％)、1.2ml(120％)，加稀释液稀释至刻度，摇匀，每个浓度平行制备3份，按照规定的测量条件进行进样测定，记录色谱图，结果见表8。
表8.氨基酸含量测定方法学-准确度
3.实验结果
所有氨基酸和GQ的平均回收率均在98％-102％之间，相对标准偏差均小于3％，符合要求。
实施例8：溶液稳定性实验
取复方氨基酸(15)双肽(2)注射液对照品溶液和供试品溶液；按照规定的测量条件分别于0、12、24、36、49小时内测定，记录色谱图。结果见表9、表10。
表9.氨基酸含量测定方法学-对照品溶液稳定性
表10.氨基酸含量测定方法学-供试品溶液稳定性
实验结果表明：复方氨基酸(15)双肽(2)注射液对照品溶液和供试品溶液可在48小时内稳定。
实施例9：耐用性实验
考察调整试验条件对各种氨基酸之间的分离度和理论塔板数的影响。结果见表11。
实验条件为：
A.调节茚三酮流速(0.20ml/min、0.25ml/min、0.30ml/min)
B.调节反应器温度(125℃、130℃、135℃)
C.调节缓冲液A的pH值(3.35、3.45、3.55)
表11：氨基酸含量测定方法学-耐用性考察
A.调节茚三酮流速
B.调节反应器温度
C.调节缓冲液A的pH值
结果：改变氨基酸含量测定衍生条件，即茚三酮流速0.25±0.05ml/min，反应器温度130±5℃，结果各种氨基酸之间分离度均达到基线分离，均大于1.3，理论塔板数均大于2000；改变缓冲液pH值在3.35～3.55之间，各种氨基酸理论踏板数均符合要求，但缓冲液pH值3.35时，缬氨酸与GQ之间分离度小于1.3，提示氨基酸含量测定使用的缓冲液A，其pH在3.45～3.55范围内较好。
Claims (1)
1.复方氨基酸(15)双肽(2)注射液甘氨酰谷氨酰胺含量检测方法，该方法包括精密量取被测样品及对照品溶液，注入带磺酸基强酸性阳离子交换树脂LCAK06/Na柱的色谱仪，通过流动相缓冲液A、B和再生液进行梯度洗脱与再生平衡，以及衍生试剂茚三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为440nm和570nm下记录色谱图，按外标法以峰面积计算，其特征在于，所述甘氨酰谷氨酰胺含量检测方法包括以下步骤：
S1.制备被测样品溶液：精密称取被测样品5ml，置于50ml容量瓶中，用样品稀释液定容至刻度，摇匀；再精密量取定溶液2ml，用样品稀释液定容至100ml，摇匀，即得；所述样品稀释液为取36％盐酸1.5ml稀释至1000ml；
S2.制备对照品溶液：精密称取对照品，用样品稀释液制成每1ml中含有门冬氨酸0.34mg、谷氨酸0.56mg、丝氨酸0.45mg、组氨酸0.68mg、甘氨酰谷氨酰胺3.027mg、精氨酸1.13mg、苏氨酸0.56mg、丙氨酸1.6mg、脯氨酸0.68mg、缬氨酸0.73mg、甲硫氨酸0.56mg、异亮氨酸0.56mg、亮氨酸0.79mg、苯丙氨酸0.585mg、醋酸赖氨酸1.27mg的对照品溶液；所述样品稀释液为取36％盐酸1.5ml稀释至1000ml；
S3.上样、分离及梯度洗脱：分别将待测样品溶液和对照品溶液20μl注入色谱仪，通过流动相缓冲液A、B和再生液进行梯度洗脱与再生平衡，于高温反应器中采用衍生试剂茚三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为440nm和570nm下记录色谱图，按外标法以峰面积计算；
其中，色谱仪的色谱条件为：带磺酸基强酸性阳离子交换树脂LCAK06/Na柱；高温反应器温度为：130℃；茚三酮流速：0.25ml/min；茚三酮停止时间：47min；采集时间：50min；流动相缓冲液A的流速：0.45ml/min；流动相缓冲液B的流速：0.45ml/min；再生液的流速：0.45ml/min；氨基酸分析柱温：57～74℃；所述梯度洗脱泵梯度如下表：
所述流动相缓冲液A的配制为：二水合柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g、乙醇65ml、37％的盐酸5.6ml、辛酸0.1ml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH至2～4；所述流动相缓冲液B的配制为：二水合柠檬酸三钠19.6g、氢氧化钠3.1g、硼酸5.0g、辛酸0.1ml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH至10～11；所述再生液的配制为：氢氧化钠20g、EDTA 0.2g置1000ml量瓶中，加水定容至刻度；所述衍生试剂茚三酮溶液的配制为：取茚三酮2g，加乙醇溶解至100mL；所述流动相缓冲液A的pH为3.45，流动相缓冲液B的pH为10.85；
所述按外标法以峰面积计算公式为供试品标示含量(％)＝(供试品溶液峰面积/标准品溶液峰面积)×100％。
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