CN102288687B - 一种门冬氨酸鸟氨酸杂质的分析检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种门冬氨酸鸟氨酸杂质的分析检测方法，将配制鸟氨酰胺浓度为1～200μg的溶液注入以烷基键合硅胶为填充剂的高效液相色谱柱中，用含有离子对试剂的无机盐水溶液与色谱纯有机溶剂组成的流动相冲洗分离，再用波长为190～250nm的紫外光分析检测。本发明的方法可用于分析检测鸟氨酰胺、或含杂质鸟氨酰胺的药物及其制剂的杂质鸟氨酰胺，通过计算分析检测结果，准确得到鸟氨酰胺的含量，该方法的分离度大、灵敏度高、准确性佳。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种使用HPLC法分析检测门冬氨酸鸟氨酸杂质的方法，更具体地说，涉及一种分析检测鸟氨酰胺、或含鸟氨酰胺杂质的药物或其制剂的方法。
背景技术
鸟氨酸或其盐已广泛应用于食品、药品中，经研究发现，游离的鸟氨酸在溶液中有自身聚合现象，通过自身聚合会形成一个内酰胺结构，即鸟氨酰胺，其结构式如下所示：
门冬氨酸鸟氨酸是由鸟氨酸与门冬氨酸反应形成的一种稳定的盐，可作为药物治疗肝性昏迷。在对门冬氨酸鸟氨酸原料药和其制剂进行质量研究后发现，门冬氨酸鸟氨酸在溶液中存在游离的鸟氨酸，游离的鸟氨酸也会发生自身聚合现象，而且鸟氨酰胺是其主要的杂质。
鸟氨酰胺无治疗作用，容易引起人体不良反应及药物刺激性，其含量多少直接影响了门冬氨酸鸟氨酸或其制剂的质量，也决定了药品的保质期长短。然而，现有的门冬氨酸鸟氨酸及其制剂的药品质量标准中没有明确收录有关该杂质的定量和定性的方法，尚无文献报道能准确分析检测该杂质的方法。
上述问题同样会出现在其他含杂质鸟氨酰胺的药物或制剂中，如盐酸鸟氨酸。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是解决如何准确地分析检测含鸟氨酰胺杂质的药物或其制剂中的杂质鸟氨酰胺。本发明为解决以上技术问题，提供了一种鸟氨酰胺的分析检测方法，用于分析检测含鸟氨酰胺杂质的药物或其制剂中的杂质鸟氨酰胺，本方法特别适合分析检测鸟氨酸盐或其制剂、门冬氨酸鸟氨酸或其制剂，也适合分析检测鸟氨酰胺或其盐。
本发明提供的技术方案是：
一种鸟氨酰胺的分析检测方法，包括：
a.取鸟氨酰胺或其盐、或含鸟氨酰胺杂质的药物或其制剂，用水、与水混溶的有机溶剂或流动相溶解，配成含鸟氨酰胺1～200μg/mL的溶液；
b.取上述溶液适量，注入到高效液相色谱柱中，用流动相进行冲洗，所述高效液相色谱柱的填充剂为硅烷键合硅胶；
c.使用波长为190～250nm的紫外光检测。
所述鸟氨酰胺盐选自鸟氨酰胺无机酸盐、鸟氨酰胺有机酸盐、鸟氨酰胺金属盐和鸟氨酰胺铵盐；优选盐酸鸟氨酰胺、硫酸鸟氨酰胺、乙酸鸟氨酰胺、甲磺酸鸟氨酰胺、对甲苯磺酸鸟氨酰胺，更优选盐酸鸟氨酰胺。
所述的含鸟氨酰胺杂质的药物或其制剂，优选鸟氨酸盐或其制剂、门冬氨酸鸟氨酸或其制剂，例如盐酸鸟氨酸、门冬氨酸鸟氨酸以及门冬氨酸鸟氨酸冻干粉针剂、注射液、颗粒剂、片剂、散剂等。
上述鸟胺酰胺溶液的配制可使用水、与水混溶的溶剂或流动相，优选用水或流动相作为溶剂；配制的含鸟氨酰胺的浓度优选1～100μg/mL。
上述与水混溶的有机溶剂选自醇类、腈类或含氧杂环类有机溶剂，优选甲醇、乙醇、乙腈或四氢呋喃，更优选甲醇或乙腈。
所述流动相由无机盐水溶液与色谱纯有机溶剂组成，所述无机盐水溶液含离子对试剂0.01％～10％g/L、含无机盐0.01～1mol/L，无机盐水溶液与色谱纯有机溶剂的体积比为99∶1～80∶20。
所述离子对试剂选自烷基磺酸盐、烷基卤化铵、烷基磷酸铵和烷基硫酸铵；所述无机盐选自钾或钠的磷酸盐、碳酸盐、枸橼酸盐、C2-C6羧酸盐、马来酸盐和富马酸盐；所述色谱纯有机溶剂为醇类或腈类有机溶剂。
上述流动相中：
无机盐水溶液与色谱纯有机溶剂的体积比优选99∶1～99∶10，最优选95∶5；
无机盐水溶液优选含离子对试剂0.01％～1％g/L，更优选0.1％～0.5％g/L；
无机盐水溶液优选含无机盐0.05～0.5g/L。
所述离子对试剂优选己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、任烷磺酸钠或癸烷磺酸钠，更优选庚烷磺酸钠。
所述无机盐优选磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、枸橼酸钠、乙酸钠、马来酸钠或富马酸钠，更优选磷酸二氢钾。
所述色谱纯有机溶剂优选甲醇或乙腈，更优选乙腈。
本发明还提供以下优选的流动相：
由磷酸二氢钾水溶液与乙腈组成，磷酸二氢钾水溶液与乙腈的体积比为99∶1～90∶10，最优选95∶5；磷酸二氢钾水溶液含庚烷磺酸钠0.01％～1％g/L，优选0.1～0.5％g/L；磷酸二氢钾水溶液含磷酸二氢钾0.01～1mol/L，优选0.05～0.5mol/L。
本发明提供的鸟氨酰胺分析检测方法，其中步骤b所述的高效液相色谱柱的填充剂优选C2～C18烷基硅烷键合硅胶、氰基硅烷键合硅胶或氨基硅烷键合硅胶，优选C8或C18烷基硅烷键合硅胶，最优选C18烷基硅烷键合硅胶。
本发明提供的鸟氨酰胺分析方法中，步骤c所使用紫外光的检测波长优选195～220nm，更优选205nm或210nm。
本发明的鸟胺酰胺分析检测方法，能用于不同的检测目的，可用于检测鸟氨酰胺或其盐的纯度，更适用于分析检测含杂质鸟胺酰胺的药物或其制剂，特别是门冬氨酸鸟氨酸或其制剂，根据分析检测的结果，能够精确计算出杂质鸟胺酰胺的实际含量，如采用对照品法、自身对照法或面积归一化法等方法分析检测相应的药物或制剂，对分析检测结果进行相应的处理后即可得出杂质鸟氨酰胺的含量。
本发明还提供了一种门冬氨酸鸟氨酸或其制剂杂质鸟氨酰胺的分析检测方法，步骤包括：
a.取鸟氨酰胺或其盐、或含鸟氨酰胺杂质的药物或其制剂，用水或流动相溶解，配成含鸟氨酰胺1～200μg/mL的溶液；
b.取上述溶液样适量注入到高效液相色谱柱中，用流动相进行冲洗，所述高效液相色谱柱以C18烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
c.使用波长为205nm或250nm的紫外光检测；
流动相由磷酸二氢钾水溶液与乙腈组成，磷酸二氢钾水溶液含庚烷磺酸钠0.1％～0.5％g/L、含磷酸二氢钾0.05～0.5mol/L，磷酸二氢钾水溶液与乙腈的体积比为99∶1～90∶10。
本发明的鸟氨酰胺分析检测方法操作简便、灵敏度高、准确性佳。用作杂质的分析检测，具有大的分离度和低的检测限。用于分析检测门冬氨酸鸟氨酸或其制剂的杂质时，鸟氨酰胺最低检测限约为0.2ng，定量限约为0.6ng；在鸟氨酰胺含量1～200μg/mL的范围内有良好的线性关系，相关系数为0.9999。
附图说明
附图1为实施例2门冬氨酸鸟氨酸的HPLC分析图
附图2为实施例2注射用门冬氨酸鸟氨酸的HPLC分析图
附图3为实施例3的门冬氨酸鸟氨酸注射液的HPLC的分析图
附图4为实施例4的门冬氨酸鸟氨酸颗粒剂的HPLC的分析图
附图5为实施例5的门冬氨酸鸟氨酸片剂的HPLC分析图
具体实施方式
为便于理解发明内容，下面结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案，但不以任何方式限制本发明。
实施例1鸟氨酰胺的制备
取游离鸟氨酸10g，在水溶液中回流反应5小时，60℃减压浓缩至干，拌入30g柱层析用硅胶，用正向柱层析分离(硅胶500g，以CH2Cl2∶CH3OH为洗脱剂，体积比1∶1v/v)，收集茚三酮显色为黄色的组分，加盐酸调pH至1，浓缩成浆状物后加乙醇结晶，抽滤后干燥制得盐酸鸟氨酰胺。
实施例2
色谱条件：
以十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相为0.1mol/L磷酸二氢钾(含0.1％庚烷磺酸钠)溶液-乙腈(95∶5v/v)，流速1ml/min，检测波长为205nm，色谱柱：Kromsil 150*4.6，5um，100AC18柱；柱温30℃，进样量：20μl。
供试品溶液制备：
取门冬氨酸鸟氨酸96.8mg，精密称定，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，作为门冬氨酸鸟氨酸样品溶液。
取门冬氨酸鸟氨酸冻干粉针剂98.30mg，精密称定，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，作为门冬氨酸鸟氨酸针剂样品溶液。
对照品溶液制备：
取盐酸鸟氨酰胺40.50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取5ml置100ml量瓶中，加水稀释至刻度。
各取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积以外标法计算.
门冬氨酸鸟氨酸中鸟氨酰胺含量为：0.042％，理论塔板数：18789，分离度为：鸟氨酸与门冬氨酸为14.11，鸟氨酸与鸟氨酰胺为20.26，门冬氨酸鸟氨酸的HPLC分析图见附图1所示，其中保留时间1.952为门冬氨酸吸收峰，3.976为鸟氨酸吸收峰，7.820为鸟氨酰胺吸收峰。
门冬氨酸鸟氨酸针剂中鸟氨酰胺含量为：0.019％，理论塔板数：19363，分离度为：鸟氨酸与门冬氨酸为14.15，鸟氨酸与鸟氨酰胺为20.27。注射用门冬氨酸鸟氨酸的HPLC分析图见附图2所示，其中保留时间1.949为门冬氨酸吸收峰，3.962为鸟氨酸吸收峰，7.747为鸟氨酰胺吸收峰。
实施例3
色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾(含0.1％庚烷磺酸钠)溶液-乙腈(93∶7v/v)，流速1mL/min，检测波长为210nm，色谱柱：Kromsil150*4.6，5um，100AC18柱；柱温30℃，进样量：20μl。
供试品溶液制备：
取门冬氨酸鸟氨酸注射液(按门冬氨酸鸟氨酸计99.10mg)，加流动相配成含门冬氨酸鸟氨酸约10mg/mL的溶液，作为门冬氨酸鸟氨酸注射剂样品溶液。
对照品溶液制备：
取盐酸鸟氨酰胺59.30mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取5ml置100ml量瓶中，加水稀释至刻度。
各取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算。
门冬氨酸鸟氨酸针剂中鸟氨酰胺含量为：0.047％，理论塔板数：18272。分离度为：鸟氨酸与门冬氨酸为18.75，鸟氨酸与鸟氨酰胺为20.73。其HPLC分析如附图3所示，其中保留时间1.889为门冬氨酸吸收峰，5.269为鸟氨酸吸收峰，11.149为鸟氨酰胺吸收峰。
实施例4
色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相为0.2mol/L磷酸二氢钾(含0.5％庚烷磺酸钠)溶液-乙腈(96∶4v/v)，流速1ml/min，检测波长为205nm，色谱柱：Kromsil 150*4.6，5um，100A C18柱；柱温30℃，进样量：20μl。
供试品溶液制备：取门冬氨酸鸟氨酸颗粒剂(按门冬氨酸鸟氨酸1.00g)，加流动相溶解，精滤后，并稀释至50ml，摇匀。
取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算。
门冬氨酸鸟氨酸针剂中鸟氨酰胺含量为：0.015％，理论塔板数(按鸟氨酰胺计)：19310。分离度：鸟氨酸与门冬氨酸为11.43，鸟氨酸与鸟氨酰胺为20.95。HPLC分析如附图4所示，其中保留时间2.014为门冬氨酸吸收峰，3.502为鸟氨酸吸收峰，6.877为鸟氨酰胺吸收峰。
实施例5
色谱条件：
以十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相为0.5mol/L磷酸二氢钾(含0.3％庚烷磺酸钠)溶液-乙腈(90∶10v/v，调节pH至3.0)，流速1ml/min，检测波长为205nm，色谱柱：Kromsil250*4.6，5um，100AC18柱；柱温30℃，进样量：20μl。
供试品溶液制备：
取门冬氨酸鸟氨酸片(按门冬氨酸鸟氨酸计99.6mg)，加流动相溶解，精滤，用流动相稀释至100ml，摇匀。
对照品溶液制备：
取盐酸鸟氨酰胺20.10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取5ml置100ml量瓶中，加水稀释至刻度。
取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算。
门冬氨酸鸟氨酸针剂中鸟氨酰胺含量为：0.054％，理论塔板数：17486。分离度为：鸟氨酸与门冬氨酸为8.13，鸟氨酸与鸟氨酰胺为14.54。HPLC分析如图5所示，其中保留时间2.276为门冬氨酸吸收峰，3.503为鸟氨酸吸收峰，5.817为鸟氨酰胺吸收峰。
Claims (14)
1.一种鸟氨酰胺的分析检测方法，包括：
a.取鸟氨酰胺或其盐、或含鸟氨酰胺杂质的药物或其制剂，用水、与水混溶的有机溶剂或流动相溶解，配成含鸟氨酰胺1～200μg/mL的溶液；
b.取上述溶液适量，注入到高效液相色谱柱中，用流动相进行冲洗，所述高效液相色谱柱以硅烷键合硅胶为填充剂；
c.使用波长为190～250nm的紫外光检测；
上述的鸟氨酰胺盐选自鸟氨酰胺无机酸盐、鸟氨酰胺有机酸盐、鸟氨酰胺金属盐和鸟氨酰胺铵盐，
上述的与水混溶的有机溶剂选自醇类、腈类或含氧杂环类有机溶剂，
上述的流动相由无机或有机盐水溶液与色谱纯有机溶剂组成，无机或有机盐水溶液含离子对试剂0.01％～10％g/L、含无机或有机盐0.01～1mol/L，无机或有机盐水溶液与色谱纯有机溶剂的体积比为99∶1～80∶20，
上述的离子对试剂选自烷基磺酸盐、烷基卤化铵、烷基磷酸铵和烷基硫酸铵，
上述的无机或有机盐选自钾或钠的磷酸盐、碳酸盐、枸橼酸盐、C2-C6羧酸盐、马来酸盐和富马酸盐，
上述的色谱纯有机溶剂为醇类或腈类有机溶剂，
上述的硅烷键合硅胶选自C2～C18烷基硅烷键合硅胶、氰基硅烷键合硅胶和氨基硅烷键合硅胶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的无机或有机盐水溶液含离子对试剂0.01％～1％g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的无机或有机盐水溶液含无机或有机盐0.05～0.5mol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的无机或有机盐水溶液与色谱纯有机溶剂的体积比为99∶1～90∶10。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的方法，其特征是所述的无机或有机盐选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、枸橼酸钠、乙酸钠、马来酸钠和富马酸钠。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是所述的无机或有机盐为磷酸二氢钾。
7.根据权利要求1至4任意一项所述的方法，其特征是所述的色谱纯有机溶剂为甲醇或乙腈。
8.根据权利要求1至4任意一项所述的方法，其特征是所述的离子对试剂为己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、任烷磺酸钠或癸烷磺酸钠。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征是所述的离子对试剂为庚烷磺酸钠。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的硅烷键合硅胶为C18烷基硅烷键合硅胶。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c使用波长为195～220nm的紫外光检测。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于步骤c使用波长为205nm或210nm的紫外光检测。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的鸟氨酰胺盐选自盐酸鸟氨酰胺、硫酸鸟氨酰胺、乙酸鸟氨酰胺、甲磺酸鸟氨酰胺、对甲苯磺酸鸟氨酰胺。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述含鸟氨酰胺杂质的药物或其制剂为盐酸鸟氨酰胺、门冬氨酸鸟氨酸、门冬氨酸鸟氨酸片剂、门冬氨酸鸟氨酸颗粒剂、门冬氨酸鸟氨酸冻干粉针剂或门冬氨酸鸟氨酸注射液。
15. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱柱以C18烷基硅烷键合硅胶为填充剂；所述波长为205nm或250nm；所述流动相由磷酸二氢钾水溶液与乙腈组成，磷酸二氢钾水溶液含庚烷磺酸钠0.1％～0.5％g/L、含磷酸二氢钾0.05～0.5mol/L，磷酸二氢钾水溶液与乙腈的体积比为99∶1～90∶10。
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