CN107632094A - 一种测定黄连中游离氨基酸的方法 - Google Patents

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CN107632094A CN201710842671.6A CN201710842671A CN107632094A CN 107632094 A CN107632094 A CN 107632094A CN 201710842671 A CN201710842671 A CN 201710842671A CN 107632094 A CN107632094 A CN 107632094A
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何洋
李东梅
陈涵婷
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Abstract

本发明提供了一种测定黄连中游离氨基酸的方法，它是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法测定；其中，将待测黄连加入到氨基酸分析仪后，用流动相B1‑B6进行梯度洗脱；所述待测黄连的制备方法如下：取黄连粉末，加水提取，加入质量分数为5％的磺基水杨酸水溶液离心，过滤，即可。本发明方法准确可靠、简便快速、灵敏度高、稳定性好，而且成本低廉，为黄连药材的开发利用、药用价值研究提供了检测依据。

Description

一种测定黄连中游离氨基酸的方法
技术领域
本发明属于中药分析领域，涉及一种测定黄连中游离氨基酸的方法。
背景技术
氨基酸是组成蛋白质的基本单位和生命代谢的物质基础，在食品、药品及药用植物中广泛存在，中药中的各种氨基酸是治疗疾病或滋补营养的主要成分，也是衡量中药材品质的一个重要指标。分析检测中药材的游离氨基酸对其药用价值研究、品质鉴定及相关产品研发具有十分重要的指导意义。
黄连为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.、三角叶黄连CoptisdeltoideaC.Y.Chenget Hsiao或云连Coptisteeza wall.的干燥根茎，三种分别习称“味连”、“雅连”和“云连”。主产四川，湖北、湖南、陕西、甘肃等省亦有栽培。味苦、性寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经。具有清热燥湿，泻火解毒的功效。主要用于湿热痞满、呕吐吞酸、泻痢、黄疸、高热神昏、心火亢盛、心烦不寐、血热、目赤、牙痛、痈肿疔疮，外治湿疹、湿疮、耳道流脓。黄连中含有黄酮类物质、氨基酸、有机酸等多种有效成分。建立准确可靠的黄连中游离氨基酸的分析方法，可对黄连的深入研究及开发打下良好的理论基础。
但是，使用分光光度法对黄连中氨基酸进行测定时，只能解决氨基酸总量的分析，无法确定氨基酸种类，不能满足实际工作需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便易行、准确可靠的测定黄连中游离氨基酸的方法。
本发明提供了一种测定黄连中游离氨基酸的方法，它是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法测定；
其中，将待测黄连加入到氨基酸分析仪后，用流动相B1-B6进行梯度洗脱；流动相B1-B4分别为pH2.8、pH3.7、pH3.6、pH 4.1的柠檬酸-柠檬酸锂缓冲体系；流动相B5为水；流动相B6为氢氧化锂水溶液；
梯度洗脱程序及柱温如下：
时间/min B1/％ B2/％ B3/％ B4/％ B5/％ B6/％ 柱温/℃
0.0 100 0 0 0 0 0 38
2.0 100 0 0 0 0 0 30
21.5 100 0 0 0 0 0
21.6 80 20 0 0 0 0 60
32.5 70 30 0 0 0 0
32.6 10 90 0 0 0 0
36.5 10 90 0 0 0 0 40
43.5 10 90 0 0 0 0
43.6 0 100 0 0 0 0
50.5 0 100 0 0 0 0 70
50.6 0 0 100 0 0 0
68.4 0 0 100 0 0 0 45
69.5 0 0 100 0 0 0
69.6 60 0 0 40 0 0
74.0 60 0 0 40 0 0
74.1 0 0 0 100 0 0
82.0 0 0 0 100 0 0
82.1 0 20 0 80 0 00
92.5 0 20 0 80 0 0 70
99.5 0 20 0 80 0 0
99.6 0 0 0 100 0 0
112.5 0 0 0 100 0 0
112.6 0 0 0 0 0 100
121.5 0 0 0 0 0 100
121.6 100 0 0 0 0 0
148.0 100 0 0 0 0 0 38
其中，所述待测黄连的制备方法如下：取黄连粉末，加水提取，加入质量分数为5％的磺基水杨酸水溶液离心，过滤，即可。
梯度洗脱程序中，“时间/min”栏中的点值代表起始时间，例如“2.0”代表从2min到下一阶段的21.5min的洗脱情况。
其中，所述黄连粉末为过60目筛的粉末。
其中，所述加水提取的方法为：加入50倍量的水，浸泡30min，然后煮沸30min，滤出；再加入粉末30倍量的水，煮沸30min，过滤即可；
其中，所述离心的方法为：6000rpm，离心5min。
其中，所述流动相B1组成为：每1mL中，含有四水柠檬酸锂5.73g、氯化锂1.24g、柠檬酸19.90g、无水乙醇30.0mL、硫代双乙醇5.0mL、25％聚氧乙烯月桂醚4.0mL、辛酸0.1mL，余量为水；
流动相B2组成为：每1mL中，含有四水柠檬酸锂9.80g、氯化锂6.36g、柠檬酸12.00g、无水乙醇30.0mL、硫代双乙醇5.0mL、25％聚氧乙烯月桂醚4.0mL、辛酸0.1mL，余量为水；
流动相B3组成为：每1mL中，含有四水柠檬酸锂8.79g、氯化锂26.62g、柠檬酸11.27g、无水乙醇100.0mL、苯甲醇3.0mL、25％聚氧乙烯月桂醚4.0mL、辛酸0.1mL，余量为水；
流动相B4组成为：每1mL中，含有四水柠檬酸锂9.80g、氯化锂38.15g、柠檬酸3.30g、25％聚氧乙烯月桂醚4.0mL、辛酸0.1mL，余量为水；
流动相B6组成为：每1mL中，含有氢氧化锂8.40g、无水乙醇30.0mL、25％聚氧乙烯月桂醚4.0mL、辛酸0.1mL，余量为水。
其中，色谱柱为生理体液PF柱，内径4.6mm，长度60mm，填料粒径3μm；
流动相流速为0.35mL/min，进样体积为20μL。
其中，茚三酮柱后衍生采用反应液R1-R3进行梯度洗脱，
其中，R1为茚三酮反应液，组成为：茚三酮39.0重量份、乙二醇甲醚979体积份、硼氢化钠81.0重量份；
重量份与体积份的对应关系为：g/mL。
R2为反应缓冲液，组成为：每1mL中，含有无水乙酸钠204.0g、冰乙酸123mL，乙二醇甲醚401mL，余量为水。
R3为洗涤液，组成为：每1mL中，无水乙醇50mL，余量为水。
反应液梯度条件如下：
时间/min R1/％ R2/％ R3/％
0.0 50 50 0
116.0 50 50 0
116.1 0 0 100
126.0 0 0 100
126.1 50 50 0
148.0 50 50 0
此处，“时间/min”栏中的点值仍代表起始时间，例如“0.0”代表从0.0min到下一阶段的116.0min的洗脱情况。
其中，反应温度为135℃，反应液流速为0.3mL/min。
其中，检测波长分别为570nm和440nm。
本发明通过选择特定的样品前处理步骤、特定的缓冲液、梯度洗脱程序及其它反应参数等，实现了采用氨基酸分析仪测定黄连中游离氨基酸的方法，该方法准确可靠、简便快速、灵敏度高、稳定性好，而且成本低廉，为黄连药材的开发利用、药用价值研究提供了检测依据。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1氨基酸标准品图谱
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1本发明方法测定黄连中游离氨基酸
一、溶液配制及实验仪器
1、标准溶液配置
1.1混合氨基酸标准储备液配置
采用氨基酸混合标准溶液，含有17种常用的氨基酸和谷氨酸和谷氨酰胺水解形成的氯化铵；分别为：L-天门冬氨酸(L-Asp)；L-苏氨酸(L-Thr)；L-丝氨酸(L-Ser)；L-谷氨酸(L-Glu)；L-脯氨酸(L-Pro)；甘氨酸(Gly)；L-丙氨酸(L-Ala)；L-胱氨酸(L-Cys)；L-缬氨酸(L-Val)；L-蛋氨酸(L-Met)；L-异亮氨酸(L-Ile)；L-亮氨酸(L-Leu)；L-酪氨酸(L-Tyr)；L-苯丙氨酸(L-Phe)；L-赖氨酸(L-Lys)；L-组氨酸(L-His)；L-精氨酸(L-Arg)；氯化铵(Ammonium Chloride)。每种氨基酸浓度2.50μmol/mL，溶于约0.1mol/mL盐酸溶液中。
另外，称取谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、γ-氨基丁酸(γ-ABA)对照品适量，用0.1摩尔/升盐酸溶解，配置成混合溶液，浓度分别为2.5μmol/mL。该储备溶液冷冻保存有效期为1个月。
1.2混合氨基酸标准工作液配制
分别准确吸取1.0mL氨基酸混合母液(见1.1)至25mL容量瓶中，用纯水稀释定容至刻度，摇匀，即得氨基酸标准使用液，浓度为2.0nmol/20μL。氨基酸标准工作溶液现配现用。
2、流动相配置
2.1流动相B1(pH2.8)配制
准确称取柠檬酸锂(四水)5.73g，氯化锂1.24g，柠檬酸19.90g，溶于700mL纯水中，加入30.0mL无水乙醇，5.0mL硫代双乙醇，4.0mL 25％聚氧乙烯月桂醚，再加入0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用纯水定容，过0.45μm水相滤膜备用。
2.2流动相B2(pH3.7)配制
准确称取柠檬酸锂(四水)9.80g，氯化锂6.36g，柠檬酸12.00g，溶于700mL纯水中，加入30.0mL无水乙醇，5.0mL硫代双乙醇，4.0mL25％聚氧乙烯月桂醚，再加入0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用纯水定容，过0.45μm水相滤膜备用。
2.3流动相B3(pH3.6)配制
准确称取柠檬酸锂(四水)8.79g，氯化锂26.62g，柠檬酸11.27g，溶于700mL纯水中，加入100.0mL无水乙醇，3.0mL苯甲醇，4.0mL 25％聚氧乙烯月桂醚，再加入0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用纯水定容，过0.45μm水相滤膜备用。
2.4流动相B4(pH 4.1)配制
准确称取柠檬酸锂(四水)9.80g，氯化锂38.15g，柠檬酸3.30g，溶于700mL纯水中，加入4.0mL 25％聚氧乙烯月桂醚，再加入0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用纯水定容，过0.45μm水相滤膜备用。
2.5流动相B5配制
流动相B5为经0.45μm水相滤膜过滤后的一级超纯水。
2.6流动相B6配制
准确称取氢氧化锂8.40g，溶于700mL水中，加入30.0mL无水乙醇，4.0mL25％聚氧乙烯月桂醚，再加入0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用纯水定容，过0.45μm水相滤膜备用。
3柱后衍生化反应溶液配制
3.1反应溶液R1配制
准确称取茚三酮39.0g，溶于979mL乙二醇甲醚中，超声溶解5min，过0.45μm有机相滤膜，加入硼氢化钠81.0mg，氮气鼓泡30min，放置过夜使用。
注：反应溶液R1制备好后宜尽快使用完毕，不宜长期储存。
3.2反应溶液R2配制
准确称取无水乙酸钠204.0g，加入300mL水，123mL冰乙酸，401mL乙二醇甲醚，超声至溶解，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45μm有机相滤膜，氮气鼓泡10min，备用。
3.3反应溶液R3配制
准确移取无水乙醇50mL于1000mL容量瓶中，用纯水定容至1000mL，摇匀后利用0.45μm有机相滤膜过滤，备用。
4、主要仪器设备
氨基酸自动分析仪，型号L-8900，日本株式会社日立制作所HITACHI；
分离色谱柱：生理体液(PF)柱(色谱柱规格为3μm，4.6mmX60mm)
二、实验方法
1、样品制备
黄连样品粉碎，过60目筛，称取10g样品，加水500mL，浸泡30min，煮沸，小火煮沸30min，滤出，再加水300mL，煮沸30min，两遍，过滤，定容到1L，1:1加入5％磺基水杨酸水溶液，摇匀后出现沉淀，6000转离心5min，经0.45μm滤膜过滤后待测。
2、仪器分离体系运行条件
流动相配制见溶液配制部分，流动相流速为0.35mL/min，流动相及温度梯度条件见表1，仪器进样体积为20μL。
3、反应检测体系运行条件
反应液配制见溶液配制部分，反应柱温度为135℃，反应液流速为0.3mL/min，反应液梯度条件见表2。
检测器检测波长570nm和440nm。
4、标准品溶液测定
启动氨基酸自动分析仪，设定工作参数，待基线稳定后，吸取氨基酸标准使用液注入氨基酸自动分析仪进行测定，分别得到20种氨基酸的峰面积，通过保留时间识别各氨基酸出峰顺序。见图1。
5、样品测定
用氨基酸分析仪测定样品溶液，分别得到样品中各氨基酸色谱峰面积，采用标准品溶液峰面积对样品溶液中氨基酸组分进行校正，计算出样品溶液中氨基酸组分含量，以0.02mol/L的盐酸作为空白样品，在相同测定条件下进行测定，计算空白样品中各氨基酸本底值。样品测定值扣除空白样品中各氨基酸本底值，即得到各样品中氨基酸净含量。
6、结果计算与表示
按式(1)计算样品中各游离氨基酸的含量。
式中：
W1----试样中各氨基酸组分的含量，单位为毫克每100克(mg/100g)；
c----试样溶液中由校正曲线计算出的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL)；
ck----空白试样溶液中由校正曲线计算出的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL)；
V----试样总体积，单位为毫升(mL)；
M----氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔(g/mol)；
m----试样质量，单位为克(g)；
m1----试样干物率，测定方法见GB/T 8303.
以两次测定的算术平均值作为测定结果，结果精确至0.01mg/100g.
表1离子交换柱分离时的梯度条件程序
时间/min B1/％ B2/％ B3/％ B4/％ B5/％ B6/％ 柱温/℃
0.0 100 0 0 0 0 0 38
2.0 100 0 0 0 0 0 30
21.5 100 0 0 0 0 0
21.6 80 20 0 0 0 0 60
32.5 70 30 0 0 0 0
32.6 10 90 0 0 0 0
36.5 10 90 0 0 0 0 40
43.5 10 90 0 0 0 0
43.6 0 100 0 0 0 0
50.5 0 100 0 0 0 0 70
50.6 0 0 100 0 0 0
68.4 0 0 100 0 0 0 45
69.5 0 0 100 0 0 0
69.6 60 0 0 40 0 0
74.0 60 0 0 40 0 0
74.1 0 0 0 100 0 0
82.0 0 0 0 100 0 0
82.1 0 20 0 80 0 00
92.5 0 20 0 80 0 0 70
99.5 0 20 0 80 0 0
99.6 0 0 0 100 0 0
112.5 0 0 0 100 0 0
112.6 0 0 0 0 0 100
121.5 0 0 0 0 0 100
121.6 100 0 0 0 0 0
148.0 100 0 0 0 0 0 38
表2茚三酮柱后衍生时的反应体系条件程序
时间/min R1/％ R2/％ R3/％
0.0 50 50 0
116.0 50 50 0
116.1 0 0 100
126.0 0 0 100
126.1 50 50 0
148.0 50 50 0
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。
试验例1本发明方法对不同基源黄连的测定结果
黄连样品分别采自四川峨眉(雅连)重庆石柱(味连)、云南福贡(云连)，按照实施例1的方法测定各自的游离氨基酸。结果见表3。
表3：不同黄连中游离氨基酸的浓度及含量
可见，本发明方法可以测定不同基源黄连中的各游离氨基酸含量。
综上，本发明通过选择特定的样品前处理步骤、特定的缓冲液、梯度洗脱程序及其它反应参数等，实现了采用氨基酸分析仪测定黄连中游离氨基酸的方法，该方法准确可靠、简便快速、灵敏度高、稳定性好，而且成本低廉，为黄连药材的开发利用、药用价值研究提供了检测依据。

Claims (9)

1.一种测定黄连中游离氨基酸的方法，其特征在于：它是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法测定；
其中，将待测黄连加入到氨基酸分析仪后，用流动相B1-B6进行梯度洗脱；流动相B1-B4分别为pH2.8、pH3.7、pH3.6、pH 4.1的柠檬酸-柠檬酸锂缓冲体系；流动相B5为水；流动相B6为氢氧化锂水溶液；
梯度洗脱程序及柱温如下：
时间/min B1/％ B2/％ B3/％ B4/％ B5/％ B6/％ 柱温/℃ 0.0 100 0 0 0 0 0 38 2.0 100 0 0 0 0 0 30 21.5 100 0 0 0 0 0 21.6 80 20 0 0 0 0 60 32.5 70 30 0 0 0 0 32.6 10 90 0 0 0 0 36.5 10 90 0 0 0 0 40 43.5 10 90 0 0 0 0 43.6 0 100 0 0 0 0 50.5 0 100 0 0 0 0 70 50.6 0 0 100 0 0 0 68.4 0 0 100 0 0 0 45 69.5 0 0 100 0 0 0 69.6 60 0 0 40 0 0 74.0 60 0 0 40 0 0 74.1 0 0 0 100 0 0 82.0 0 0 0 100 0 0 82.1 0 20 0 80 0 00 92.5 0 20 0 80 0 0 70 99.5 0 20 0 80 0 0 99.6 0 0 0 100 0 0 112.5 0 0 0 100 0 0 112.6 0 0 0 0 0 100 121.5 0 0 0 0 0 100 121.6 100 0 0 0 0 0 148.0 100 0 0 0 0 0 38
其中，所述待测黄连的制备方法如下：取黄连粉末，加水提取，加入质量分数为5％的磺基水杨酸水溶液离心，过滤，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述黄连粉末为过60目筛的粉末。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述加水提取的方法为：加入50倍量的水，浸泡30min，然后煮沸30min，滤出；再加入粉末30倍量的水，煮沸30min，过滤即可。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述离心的方法为：6000rpm，离心5min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述流动相B1组成为：每1mL中，含有四水柠檬酸锂5.73g、氯化锂1.24g、柠檬酸19.90g、无水乙醇30.0mL、硫代双乙醇5.0mL、25％聚氧乙烯月桂醚4.0mL、辛酸0.1mL，余量为水；
流动相B2组成为：每1mL中，含有四水柠檬酸锂9.80g、氯化锂6.36g、柠檬酸12.00g、无水乙醇30.0mL、硫代双乙醇5.0mL、25％聚氧乙烯月桂醚4.0mL、辛酸0.1mL，余量为水；
流动相B3组成为：每1mL中，含有四水柠檬酸锂8.79g、氯化锂26.62g、柠檬酸11.27g、无水乙醇100.0mL、苯甲醇3.0mL、25％聚氧乙烯月桂醚4.0mL、辛酸0.1mL，余量为水；
流动相B4组成为：每1mL中，含有四水柠檬酸锂9.80g、氯化锂38.15g、柠檬酸3.30g、25％聚氧乙烯月桂醚4.0mL、辛酸0.1mL，余量为水；
流动相B6组成为：每1mL中，含有氢氧化锂8.40g、无水乙醇30.0mL、25％聚氧乙烯月桂醚4.0mL、辛酸0.1mL，余量为水。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
色谱柱为生理体液PF柱，内径4.6mm，长度60mm，填料粒径3μm；
流动相流速为0.35mL/min，进样体积为20μL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：茚三酮柱后衍生采用反应液R1-R3进行梯度洗脱，
其中，R1为茚三酮反应液，组成为：茚三酮39.0重量份、乙二醇甲醚979体积份、硼氢化钠81.0重量份；
R2为反应缓冲液，组成为：每1mL中，含有无水乙酸钠204.0g、冰乙酸123mL，乙二醇甲醚401mL，余量为水。
R3为洗涤液，组成为：每1mL中，无水乙醇50mL，余量为水。
反应液梯度条件如下：
时间/min R1/％ R2/％ R3/％ 0.0 50 50 0 116.0 50 50 0 116.1 0 0 100 126.0 0 0 100 126.1 50 50 0 148.0 50 50 0
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：反应温度为135℃，反应液流速为0.3mL/min。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：检测波长分别为570nm和440nm。
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