CN104678044B - 利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法 - Google Patents
利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104678044B CN104678044B CN201510109474.4A CN201510109474A CN104678044B CN 104678044 B CN104678044 B CN 104678044B CN 201510109474 A CN201510109474 A CN 201510109474A CN 104678044 B CN104678044 B CN 104678044B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino acids
- watson
- amino acid
- tealeaves
- water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 62
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 claims abstract description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 57
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 22
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 16
- DATAGRPVKZEWHA-YFKPBYRVSA-N N(5)-ethyl-L-glutamine Chemical compound CCNC(=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O DATAGRPVKZEWHA-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 16
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 15
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 11
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 9
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 9
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 9
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 9
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 9
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 9
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 9
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 9
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 9
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 claims description 9
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 9
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 9
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 229940026510 theanine Drugs 0.000 claims description 8
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims description 7
- ILENNEJNEDBFNR-UHFFFAOYSA-N C(N)(O)=O.ONC(CCC(=O)N)=O.NC=1C=C2C=CC=NC2=CC1 Chemical group C(N)(O)=O.ONC(CCC(=O)N)=O.NC=1C=C2C=CC=NC2=CC1 ILENNEJNEDBFNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 5
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 claims description 5
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000012749 thinning agent Substances 0.000 claims description 4
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 claims 2
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 abstract description 14
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 3
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 abstract 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 abstract 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 abstract 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 12
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 12
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 11
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 8
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 8
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 8
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 8
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 8
- 235000006468 Thea sinensis Nutrition 0.000 description 7
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 4
- 235000020333 oolong tea Nutrition 0.000 description 4
- -1 amino acid triketohydrindene hydrate Chemical class 0.000 description 3
- 235000020279 black tea Nutrition 0.000 description 3
- 238000005515 capillary zone electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 235000009569 green tea Nutrition 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 4-fluoro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(F)C=C1 XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000001012 micellar electrokinetic chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000004407 detection of glutamine Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003822 preparative gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及一种反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法，首先将鲜茶叶干燥粉碎，加入沸水浸提，收集上清后重复提取合并上清液，上清液经抽滤后通过AccQ·Tag衍生试剂对茶汤样品进行柱前衍生，采用HPLC和AccQ-Tag？C18氨基酸专用分析柱对色谱分离检测条件进行优化，从而能够对谷氨酰胺等19种游离氨基酸进行分离和检测。该方法可同时测定茶叶中谷氨酰胺等19种游离氨基酸含量。弥补了目前基于高效液相色谱不能快速准确对茶叶中谷氨酰胺进行定性和定量分析的空缺，并为研究茶叶氨基酸合成途径提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种同时检测茶叶中19种游离氨基酸含量的高效液相色谱(HPLC)方法。
背景技术
氨基酸是构成生物体蛋白的最基本物质，也是生物体内活性肽、酶和其他一些生物活性分子的重要组成成分，与生命活动有着密切的关系。茶叶中含有丰富的氨基酸，因此为人体所需提供了不可或缺的营养成分。茶叶中的氨基酸也是直接影响茶叶品质的特征性成分之一，其含量和组成与茶叶的滋味和香气密切相关。因此，分析茶叶中氨基酸对茶叶的品质鉴定和营养价值评价都具有十分重要的意义。
目前，常用的茶叶氨基酸检测方法主要有电化学分析法、气相色谱法、离子交换色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法。
电化学分析法主要是用于测定游离氨基酸总量，此方法快速、简便，但精确度低，重现性不好。离子交换色谱法方法是利用氨基酸在酸性条件下形成的阳离子在交换柱中保留的时间不同而达到分离的，分离的氨基酸用茚三酮衍牛化为紫色产物，再经紫外可见分光光度检测器进行检测。但该方法破坏了氨基酸的固有结构，分析时间很长，硬件配置复杂，用途专一，灵活性差。毛细管电泳主要有两种模式：毛细管区域电泳(CZE)和胶柬电动毛细管色谱(MEKC)，MEKC的分离度要好于CZE。此方法主要用于氨基酸的手性分离，具有分离效率高、灵敏度高、无须梯度洗脱、分析速度快和溶剂消耗少等优点。但其重现性差因此限制了其在氨基酸分析检测领域中的使用。质谱(GC-MS)分析方法是利用氨基酸分子中的羧基在强碱环境中形成的阴离子在阴离子交换树脂上保留时间不同而达到分离的目的，该方法灵敏，分辨率高、重复性好，主要用于疾病、植物等氨基酸定量分析及氨基酸对映异构体鉴定中，但此方法对仪器以及实验人员水平要求较高，费用较高。
高效液相色谱法是利用衍生化试剂将荧光基团加在氨基酸的氨基上，然后通过荧光和紫外检测器进行检测。此方法较灵敏，分离条件较易改进，通用性强，分析速度较快。1993年，Waters公司开发了反相高效液相色谱法方法-AccQ.Tag法。此法操作简单；灵敏度极高，定量结果准确；精确度高，重复性好。能够较好地分离天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸17种氨基酸。2010年，李大祥建立了能够检测茶氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸18种氨基酸的反相高效液相色谱法。但此方法不包含谷氨酰胺的检测。随着茶叶氨基酸代谢途径研究的深入，此途径中的关键氨基酸-谷氨酰胺受到广泛的重视，探寻茶叶中谷氨酰胺的检测方法是目前迫切需要解决的问题。因此本发明旨在建立测定范围更广的能够检测茶叶中谷氨酰胺、茶氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸19种游离氨基酸的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用RP-HPLC检测茶叶中19种游离氨基酸的方法，对19种游离氨基酸进行定性和定量分析，此方法样品前处理简单，成本低，实现了同时测定茶叶中谷氨酰胺等19种游离氨基酸的目的。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法，其特点在于：包括以下步骤：
(1)标准品：天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、茶氨酸，缬氨酸；
(2)样品前处理
称取1.5g茶样浸泡于200ml屈臣氏水中，100℃浸提45min，冷却至室温，抽滤后转移至250ml容量瓶定容，静置取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，所得滤液密封保存，用于下一步衍生；
(3)标准品及样品的衍生
衍生剂为6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)，衍生时间为10min,衍生温度为55℃；
(4)RP-HPLC色谱条件
检测仪器：Waters600高效液相色谱系统，Waters2478紫外检测器，Waters2456荧光检测器；荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；UV检测波长：254nm；
色谱柱：AccQ-TagC18氨基酸专用分析柱；
流动相A：AccQ·Tag洗脱浓缩液A(商品名为AccQ·Tag洗脱浓缩液A，购自沃特世公司)；流动相B为乙腈；流动相C为屈臣氏水(市购)，柱温37℃；洗脱程序：0-47min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：100％-68％，乙腈：0％-20％，屈臣氏水：0％-12％；47-50min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：68％-0％，乙腈：20％-60％，屈臣氏水：12％-40％；50-58min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：0％-100％，乙腈：60％-0％，屈臣氏水：40％-0％；流速1ml/min，进样量5μl；
(5)测定
根据步骤(4)对衍生后的谷氨酰胺等19种游离氨基酸标准溶液和茶叶样品的游离氨基酸进行色谱分析，经过紫外和荧光检测，获得氨基酸色谱图；根据色谱图结果计算茶叶样品的谷氨酰胺等19种游离氨基酸的含量。
作为优选，所述步骤(2)方案为：准确称取1.5g茶样于250ml试剂瓶中，加入200ml煮沸的屈臣氏水，加盖密封，放入100℃水浴中浸提45min，期间晃动摇匀2-3次；抽滤后转移至250ml容量瓶中，用40℃-60℃屈臣氏水定容，静置5min后取上清液，上清经0.22μm水相滤头过滤，封口，用于下一步衍生。
作为优选，所述步骤(3)具体方法为：
A、取3mg所述衍生剂溶解于1mlAccQ·Fluor稀释剂中得衍生剂液；
B、取20μ1标准品溶液或样品滤液于衍生管中，然后加入70μ1AccQ·FluorBuffer，漩涡10s；
C、向步骤B衍生管中加入10μl步骤A所得衍生剂液，密封、漩涡10s，静置1min，然后立即置于55℃烘箱中加热10min。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
由于AccQ-TagC18氨基酸专用分析柱的柱效和氨基酸的极性，谷氨酰胺和组氨酸在同一时间点出现色谱峰且完全重叠，即一个峰型图指示的是谷氨酰胺和组氨酸两种物质，因此现有的方法无法将这两种氨基酸分开；本发明通过技术改进使谷氨酰胺和组氨酸的色谱峰完全分离，成功将谷氨酰胺和组氨酸两种物质分开，达到了定量检测茶叶中谷氨酰胺等19种游离氨基酸的目的，并为研究茶叶氨基酸代谢途径提供了新方法。此方法样品前处理简单，成本低，可同时测定茶叶中的19种游离氨基酸的含量。
附图说明：
图1是19种氨基酸标准品HPLC色谱图；
图2是乌龙茶样品中游离氨基酸的HPLC色谱图。
具体实施方式
以下实施例中的标准品天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、茶氨酸、缬氨酸为Sigma公司生产的市售常规产品；屈臣氏水为市售产品；AccQ·Tag洗脱浓缩液A、AccQ·Fluor衍生剂(即AQC)、AccQ·Fluor稀释剂、AccQ·FluorBuffer均为沃特世公司生产的市售常规产品。
实施例1绿茶中游离氨基酸的测定
⑴标准品：天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、茶氨酸。
⑵样品前处理
称取1.5g茶样浸泡于200ml屈臣氏水中，100℃浸提45min，冷却至室温，抽滤后转移至250ml容量瓶定容，静置取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，所得滤液密封保存，用于下一步衍生。
⑶样品的衍生
衍生剂为6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)，所述衍生剂衍生时间为10min,衍生温度为55℃。以上述衍生条件对绿茶样品中的游离氨基酸进行衍生；衍生具体步骤如下：
A、取3mg所述衍生剂溶解于1mlAccQ·Fluor稀释剂中得衍生剂液；
B、取20μ1标准品溶液或样品滤液于衍生管中，然后加入70μ1AccQ·FluorBuffer，漩涡10s；
C、向步骤B衍生管中加入10μl步骤A所得衍生剂液，密封、漩涡10s，静置1min，然后立即置于55℃烘箱中加热10min。
⑷RP-HPLC色谱条件
检测仪器：Waters600高效液相色谱系统，Waters2478紫外检测器，Waters2456荧光检测器；荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；UV检测波长：254nm。
色谱柱：AccQ-TagC18氨基酸专用分析柱(150mm×3.9mm，5μm)。
流动相A：AccQ·Tag洗脱浓缩液A；流动相B为乙腈；流动相C为屈臣氏水，柱温37℃。洗脱程序：0-47min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：100％-68％，乙腈：0％-20％，屈臣氏水：0％-12％；47-50min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：68％-0％，乙腈：20％-60％，屈臣氏水：12％-40％；50-58min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：0％-100％，乙腈：60％-0％，屈臣氏水：40％-0％；流速1ml/min，进样量5μl。
表1.绿茶中游离氨基酸的含量(mg/g)
实施例2红茶中游离氨基酸的测定
⑴标准品：天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、茶氨酸、缬氨酸。
⑵样品前处理
称取1.5g茶样浸泡于200ml屈臣氏水中，100℃浸提45min，冷却至室温，抽滤后转移至250ml容量瓶定容，静置取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，所得滤液密封保存，用于下一步衍生。
⑶样品的衍生
衍生剂为6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)，衍生时间为10min,衍生温度为55℃。以上述衍生条件对红茶样品中的游离氨基酸进行衍生，衍生具体步骤同实施例1。
⑷RP-HPLC色谱条件
检测仪器：Waters600高效液相色谱系统，Waters2478紫外检测器，Waters2456荧光检测器；荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；UV检测波长：254nm。
色谱柱：AccQ-TagC18氨基酸专用分析柱(150mm×3.9mm，5μm)。
流动相A：AccQ·Tag洗脱浓缩液A；流动相B为乙腈；流动相C为屈臣氏水，柱温37℃。
洗脱程序：0-47min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：100％-68％，乙腈：0％-20％，屈臣氏水：0％-12％；47-50min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：68％-0％，乙腈：20％-60％，屈臣氏水：12％-40％；50-58min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：0％-100％，乙腈：60％-0％，屈臣氏水：40％-0％；流速1ml/min，进样量5μl。
表2.红茶中游离氨基酸的含量(mg/g)
| 氨基酸 | 祁红 | 日照景阳青 | 福建坦洋工夫 |
| D-Asp | 0.963 | 1.372 | 1.498 |
| S-Ser | 1.068 | 0.457 | 1.053 |
| E-Glu | 3.318 | 3.316 | 4.454 |
| G-Gly | 0.076 | 0.085 | 0.096 |
| Q-Gln | 2.365 | 0.283 | 1.061 |
| H-His | 0.088 | 0.077 | 0.128 |
| R-Arg | 1.663 | 1.013 | 2.073 |
| T-Thr | 0.484 | 0.371 | 0.508 |
| A-Ala | 0.709 | 0.433 | 0.695 |
| P-Pro | 0.561 | 0.757 | 0.654 |
| Thea | 13.140 | 3.417 | 10.481 |
| Y-Tyr | 0.660 | 0.675 | 0.611 |
| C-Cys | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
| V-Val | 0.644 | 0.657 | 0.717 |
| M-Met | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
| I-Ile | 0.526 | 0.463 | 0.533 |
| K-Lys | 0.401 | 0.493 | 0.523 |
| L-Leu | 0.603 | 0.558 | 0.731 |
| F-Phe | 0.803 | 0.729 | 0.651 |
实施例3乌龙茶中游离氨基酸的测定
⑴标准品：天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、茶氨酸，缬氨酸，购自Sigma公司。
⑵样品前处理
称取1.5g茶样浸泡于200ml屈臣氏水中，100℃浸提45min，冷却至室温，抽滤后转移至250ml容量瓶定容，静置取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，所得滤液密封保存，用于下一步衍生。
⑶样品的衍生
衍生剂为6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)，衍生时间为10min,衍生温度为55℃。以上述衍生条件对乌龙茶样品中的游离氨基酸进行衍生，衍生步骤同实施例1。
⑷RP-HPLC色谱条件
检测仪器：Waters600高效液相色谱系统，Waters2478紫外检测器，Waters2456荧光检测器；荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；UV检测波长：254nm。
色谱柱：AccQ-TagC18氨基酸专用分析柱(150mm×3.9mm，5μm)。
流动相A：AccQ·Tag洗脱浓缩液A；流动相B为乙腈；流动相C为屈臣氏水，柱温37℃。洗脱程序：0-47min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：100％-68％，乙腈：0％-20％，屈臣氏水：0％-12％；47-50min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：68％-0％，乙腈：20％-60％，屈臣氏水：12％-40％；50-58min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：0％-100％，乙腈：60％-0％，屈臣氏水：40％-0％；流速1ml/min，进样量5μl。HPLC色谱图见图1、图2。
表3.乌龙茶中游离氨基酸的含量(mg/g)
| 氨基酸 | 铁观音 | 闽南色种 | 武夷岩茶 |
| D-Asp | 0.789 | 0.825 | 0.467 |
| S-Ser | 1.503 | 0.930 | 0.115 |
| E-Glu | 0.951 | 0.823 | 0.352 |
| G-Gly | 0.020 | 0.019 | 0.023 |
| Q-Gln | 0.445 | 0.140 | 0.081 |
| H-His | 0.067 | 0.047 | 0.021 |
| R-Arg | 0.155 | 0.064 | 0.126 |
| T-Thr | 0.264 | 0.150 | 0.034 |
| A-Ala | 0.813 | 0.323 | 0.144 |
| P-Pro | 0.109 | 0.095 | 0.098 |
| Thea | 5.061 | 5.120 | 0.443 |
| Y-Tyr | 0.155 | 0.082 | 0.128 |
| C-Cys | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
| V-Val | 0.176 | 0.139 | 0.076 |
| M-Met | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
| I-Ile | 0.081 | 0.090 | 0.043 |
| K-Lys | 0.167 | 0.130 | 0.052 |
| L-Leu | 0.102 | 0.092 | 0.056 |
| F-Phe | 0.303 | 0.142 | 0.098 |
Claims (2)
1.利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)标准品：天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、茶氨酸、缬氨酸；
(2)样品前处理
称取1.5g茶样浸泡于200ml屈臣氏水中，100℃浸提45min，冷却至室温，抽滤后转移至250ml容量瓶定容，静置取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，所得滤液密封保存，用于下一步衍生；
(3)标准品及样品的衍生
衍生剂为6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)，衍生时间为10min,衍生温度为55℃；
(4)RP-HPLC色谱条件
检测仪器：Waters600高效液相色谱系统，Waters2478紫外检测器，Waters2456荧光检测器；荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；UV检测波长：254nm；
色谱柱：AccQ-TagC18氨基酸专用分析柱；
流动相A：AccQ·Tag洗脱浓缩液A；流动相B为乙腈；流动相C为屈臣氏水，柱温37℃；洗脱程序：0-47min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：100％-68％，乙腈：0％-20％，屈臣氏水：0％-12％；47-50min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：68％-0％，乙腈：20％-60％，屈臣氏水：12％-40％；50-58min，AccQ·Tag洗脱浓缩液A：0％-100％，乙腈：60％-0％，屈臣氏水：40％-0％；流速1ml/min，进样量5μl；
(5)测定
根据步骤(4)对衍生后的氨基酸标准溶液进行紫外和荧光检测，得到色谱图后计算茶样中氨基酸的含量。
2.根据权利要求1所述的利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为：
A、取3mg所述衍生剂溶解于1mlAccQ·Fluor稀释剂中得衍生剂液；
B、取20μ1标准品溶液或样品滤液于衍生管中，然后加入70μ1AccQ·FluorBuffer，漩涡10s；
C、向步骤B衍生管中加入10μl步骤A所得衍生剂液，密封、漩涡10s，静置1min，然后立即置于55℃烘箱中加热10min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510109474.4A CN104678044B (zh) | 2015-03-12 | 2015-03-12 | 利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510109474.4A CN104678044B (zh) | 2015-03-12 | 2015-03-12 | 利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104678044A CN104678044A (zh) | 2015-06-03 |
| CN104678044B true CN104678044B (zh) | 2016-03-30 |
Family
ID=53313390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510109474.4A Expired - Fee Related CN104678044B (zh) | 2015-03-12 | 2015-03-12 | 利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104678044B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107091898A (zh) * | 2017-04-11 | 2017-08-25 | 苏州市农业科学院 | 一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法 |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105372348B (zh) * | 2015-12-09 | 2017-11-07 | 中国农业科学院茶叶研究所 | 一种茶树品种新梢持嫩性的鉴定方法 |
| CN105548432A (zh) * | 2015-12-18 | 2016-05-04 | 乐普药业股份有限公司 | 一种比伐卢定中氨基酸的检测分析方法 |
| CN106525533B (zh) * | 2016-11-11 | 2018-06-29 | 广东省农业科学院茶叶研究所 | 高茶氨酸茶树资源快速筛选方法 |
| CN106680390A (zh) * | 2016-12-21 | 2017-05-17 | 中国农业科学院茶叶研究所 | 一种茶树氮素营养的诊断方法 |
| CN106950306B (zh) * | 2017-03-28 | 2020-05-12 | 武汉一半天科技开发有限公司 | 一种测定复方氨基酸注射液中半胱氨酸含量的方法 |
| CN106841473B (zh) * | 2017-04-11 | 2020-03-24 | 苏州市农业科学院 | 一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法 |
| CN107202836B (zh) * | 2017-04-11 | 2020-03-06 | 苏州市职业大学 | 一种茶叶鲜样中茶氨酸含量的快速分析方法 |
| CN108333267A (zh) * | 2018-01-23 | 2018-07-27 | 广州铭康生物工程有限公司 | 利用高效液相色谱测定铭复乐中精氨酸含量的方法 |
| CN110018260A (zh) * | 2019-02-25 | 2019-07-16 | 山东越品检验认证集团有限公司 | 一种茶叶中游离氨基酸的测定方法 |
| CN110596294B (zh) * | 2019-10-18 | 2021-07-06 | 山东威高药业股份有限公司 | 一种甘氨酰-d-谷氨酰胺的高效液相检测方法 |
| CN112557532A (zh) * | 2020-11-27 | 2021-03-26 | 北京康立生医药技术开发有限公司 | 一种含茶氨酸组合物的检测方法 |
| CN113030338A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-06-25 | 贵州中烟工业有限责任公司 | 一种测定烟丝中氨基酸的方法 |
| CN114965745A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-08-30 | 武汉轻工大学 | 一种茶叶中氨基酸的检测方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5030586B2 (ja) * | 2004-05-26 | 2012-09-19 | 味の素株式会社 | アミノ官能性化合物の分析方法及び装置 |
| CN101251518B (zh) * | 2008-01-31 | 2012-05-30 | 恩施土家族苗族自治州农业科学院 | 一种魔芋指纹图谱的建立方法 |
| CN101726552B (zh) * | 2009-12-14 | 2013-04-10 | 中国农业大学 | 一种氨基化合物高效液相色谱柱前衍生化试剂及其检测方法 |
| CN102440989B (zh) * | 2010-10-13 | 2014-04-02 | 四川科伦药物研究有限公司 | 复方氨基酸注射液的检测方法 |
| CN102323341A (zh) * | 2011-06-09 | 2012-01-18 | 山西出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法 |
| CN103412066B (zh) * | 2013-08-12 | 2014-12-31 | 浙江省中医药研究院 | 一种微波水解-hplc法测定蚕蛹中氨基酸含量的方法 |
| CN103638018B (zh) * | 2013-12-03 | 2015-06-03 | 辽宁海思科制药有限公司 | 一种复方氨基酸注射液18aa-ⅶ药物组合物及其制备方法 |
| CN103645266B (zh) * | 2013-12-27 | 2015-08-05 | 光明乳业股份有限公司 | 乳基料中游离态手性氨基酸的检测方法 |
-
2015
- 2015-03-12 CN CN201510109474.4A patent/CN104678044B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107091898A (zh) * | 2017-04-11 | 2017-08-25 | 苏州市农业科学院 | 一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104678044A (zh) | 2015-06-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104678044B (zh) | 利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法 | |
| CN103163226A (zh) | 30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备 | |
| Zhao et al. | A high-performance liquid chromatographic method for simultaneous determination of 21 free amino acids in tea | |
| CN104502518B (zh) | 一种治疗小儿厌食症的中药制剂的检测方法 | |
| CN104483406B (zh) | L-精氨酸-α-酮戊二酸的高效液相色谱检测方法 | |
| CN107091898A (zh) | 一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法 | |
| CN107091892A (zh) | 采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法 | |
| Weisz et al. | Preparative separation of 1, 3, 6-pyrenetrisulfonic acid trisodium salt from the color additive D&C Green No. 8 (pyranine) by pH-zone-refining counter-current chromatography | |
| CN107515256A (zh) | 一种鉴别枣花蜜、荆条蜜、洋槐蜜和龙眼蜜的方法 | |
| Li et al. | Determination of 20 free amino acids in asparagus tin by high-performance liquid chromatographic method after pre-column derivatization | |
| CN102288687B (zh) | 一种门冬氨酸鸟氨酸杂质的分析检测方法 | |
| CN101726552B (zh) | 一种氨基化合物高效液相色谱柱前衍生化试剂及其检测方法 | |
| CN107037150A (zh) | 一种同时测定食品中多种防腐剂、甜味剂和着色剂的方法 | |
| CN110849980A (zh) | 一种l-丙氨酸异丙酯中对映异构体含量的检测方法 | |
| CN103197022A (zh) | 一种检测食醋中所含氨基酸的方法 | |
| CN105223280A (zh) | 一种乌鸡增乳制剂中氨基酸含量的测定方法 | |
| CN104833744A (zh) | 一种食品中4-甲基咪唑的检测方法 | |
| CN104155378A (zh) | 一种快速分析氨基酸混合物的方法 | |
| CN104215721A (zh) | 邻苯二甲酸在氨基酸分析中的应用 | |
| CN103278586A (zh) | 乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法 | |
| CN106841473B (zh) | 一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法 | |
| CN103063792B (zh) | 小儿化痰止咳颗粒的检测方法 | |
| CN112798713B (zh) | 一种中药复方抑菌凝胶剂的鉴定和含量测定方法 | |
| Qiao et al. | Application of capillary electrophoresis for assessing amino acids composition of Jujube from different geographical origins. | |
| CN106324116B (zh) | 一种短穗兔耳草的hplc特征图谱检测方法及图谱 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160330 Termination date: 20200312 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |