CN103412066B - 一种微波水解-hplc法测定蚕蛹中氨基酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微波消解-HPLC法测定蚕蛹中氨基酸含量的方法，利用微波消解仪对蚕蛹样品进行酸水解，采用高效液相色谱仪对蚕蛹水解样品进行氨基酸含量测定。包括步骤：（1）样品微波消解预处理；（2）色谱条件及标准曲线制备；（3）供试品溶液衍生化反应；（4）蚕蛹中氨基酸含量测定。根据氨基酸标准品溶液测得峰面积和浓度制定标准曲线，采用高效液相色谱仪对蚕蛹水解样品测定峰面积，由标准曲线计算出样品中氨基酸的含量。本发明具有微波消解预处理过程简单、样品消解快速完全、试剂用量少、操作安全、环境污染小等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种蚕蛹中氨基酸含量的测定分析方法，尤其是涉及一种采用微波水解-高效液相液相色谱仪（HPLC）检测技术测定蚕蛹中氨基酸含量的分析方法。
背景技术
蚕蛹为蚕蛾科家蚕(Bombyx mori L.)的蛹。自古就作为滋补强身，和脾胃，长肌肉的食物和药物。《日用本草》称其为“小蜂儿”，《食物本草》称其为“蚕女”，《本草品汇精要》称其为“蚕蛹子”。蚕蛹最早见于《日华子本草》，称其能“治风及劳瘦。又研敷蚕瘑恶疮等”。《本草纲目》记载蚕蛹“为未饮服，治小儿疳瘦，长肌，退热，除蛔虫；煎汁饮，止消渴”。《医林篡要》称蚕蛹能“和脾胃，去风湿，长阳气”。《随息居饮食谱》中还记载蚕蛹“甘温。补气，止渴，杀虫。治疳积，童劳，助痘浆，乳汁”。另外，《本草品汇精要》、《本草害利》、《脉药联珠》等本草学著作中都有蚕蛹作药用的记载，现代的本草学著作如《中药大辞典》、《中药志》、《中华药海》、《中药辞海》等都将蚕蛹收录，作为补益药物，用于治疗疳积、劳瘵等营养不良病症，在民间应用比较广泛。
现代科学研究证实蚕蛹营养价值极高。干蚕蛹中含粗脂肪25%～30%，粗蛋白55%～60%，肝糖2%～4%，甲壳质2%～3%，灰分3%～5%，其他3%～4%。还含有多种蛋白激素，微量元素和维生素等。通过药理学试验证实具有较高的营养作用并有提高免疫功能，护肝和抗肿瘤等功能。中国是丝绸大国，桑蚕资源十分丰富，蚕丝产量占世界的4/5，而浙江省又是国内主要桑蚕产区，产丝量占全国的1/4。为保证药材的来源准确和药材的质量，我们主要对浙江省内蚕桑产区并兼顾外省的产蚕区收集到的蚕蛹进行氨基酸含量指标的测定。对今后蚕蛹复合氨基酸生产的原料采购有一定指导意义。
蚕蛹蛋白系全价蛋白，是理想的天然优质氮源，蚕蛹蛋白水解后含有人体生长发育、新陈代谢所需要的多种氨基酸，包括不能在体内合成的8种必需氨基酸。为能更好控制蚕蛹提取物中复合氨基酸的质量，以确保作为高附加值药品、保健食品、化妆品的原料资源，需对蚕蛹中各个氨基酸的含量做出准确可靠的分析。水解蛋白质测定氨基酸的传统方法是在6mol/LHCl中，110℃下加热24h。冯娅等在160℃、不同微波功率和时间的条件下对蛋白质进行水解，并与传统的水解方法进行比较；穆军等采用正交实验方法以H2SO4为水解介质，选用微波功率、H2SO4浓度、水解时间作为3个考察因素研究蛋白质的水解。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种微波消解-HPLC法测定蚕蛹中氨基酸含量的方法，利用微波消解仪对蚕蛹样品进行酸水解，采用高效液相色谱仪对蚕蛹水解样品进行氨基酸含量测定，其目的在于克服目前蚕蛹在常规条件下水解的各种弊端，具有操作简便、水解快速，高效节能，环境污染小，分析准确和精密度高等优点。
为了达到上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种微波水解-HPLC法测定蚕蛹中氨基酸含量的方法，包括以下步骤：
（1）样品微波消解预处理：取待测蚕蛹样品粉末0.15～0.25g于微波消解罐中，加入3～4.0ml的5～6mol/L盐酸溶液，旋紧盖子，放上防爆裂膜，固定于保护套中，置微波消解仪内，消解采用程序升温，设置温度110～130℃，保持15～25分钟，待温度显示至室温时，打开微波消解仪，取出消解罐，转移样品至100ml容量瓶中，用0.1mol/L NaHCO3溶液稀释至满刻度，待用；
（2）色谱条件及标准曲线制备：
（a）色谱条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，梯度洗脱液由pH为6.0～6.8的25mM KH2PO4缓冲液和甲醇乙腈溶液组成，流速：1.0～1.5ml/min；检测波长：436nm；柱温：30～40℃；分析时间50～70min；
（b）标准曲线制备：
取氨基酸标准储备液，用0.1mol/LNaHCO3分别稀释成1、2、5、10、15、20nmol/ml的氨基酸标准液，各精密吸取200μl，置2mL离心管中，加DABS-Cl乙腈液100～300μL，盖紧摇匀，放入50～70℃恒温水浴中，保温10～25min，取出离心管，加入适量衍生反应终止液，定容至1.0ml，振荡混匀，转速8000r/min离心10min，精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线；
（3）供试品溶液衍生化反应：取稀释后消解液20ml置蒸发皿中水浴蒸干，固体用0.1mol/LNaHCO3溶液溶解定溶于5ml容量瓶中，精密吸取200μl置2mL离心管中，加DABS-Cl乙腈液100～300μL，盖紧摇匀，放入50～70℃恒温水浴中，保温10～25min，取出离心管，加入适量衍生反应终止液，定容至1.0ml，振荡混匀，转速8000r/min离心10min，备用；
（4）蚕蛹中氨基酸含量测定：精密吸取衍生化后供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积，根据标准曲线计算蚕蛹中氨基酸的含量。
蚕蛹样品中氨基酸含量计算式为：
公式中，X由工作曲线方程算出的氨基酸含量，ng/ml；
C-蚕蛹中各氨基酸含量，ng/g；
m-表示称取测定蚕蛹样品质量；
n1-表示样品液稀释倍数，n1=V浓缩后取样体积/V浓缩后总体积
n2-表示消解体积变化率，n2=V消解液取样体积/V消解液总体积
所述衍生剂溶液的制备：精密称取4-二甲胺基苯偶氮磺酰氯(以下简称：DABS-Cl)48.57mg，置于10ml容量瓶中，用乙腈超声溶解，并定容至满刻度，摇匀，即得15nmol/ml的DABS-CL乙腈液（衍生剂），低温避光保存。
作为优选，所述步骤（1）样品微波消解预处理：取待测蚕蛹样品粉末0.2g于微波消解罐中，加入3.0ml的6mol/L盐酸溶液，旋紧盖子，放上防爆裂膜，固定于保护套中，置微波消解仪内，设置温度120℃，保持20分钟，然后冷却至室温，打开微波消解仪，取出消解罐，转移消解液至100ml容量瓶中，用0.1mol/L NaHCO3溶液稀释至满刻度，待用。
作为优选，所述步骤（2）中：
（a）色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A是pH为6.6的25mM KH2PO4缓冲液，流动相B是甲醇乙腈溶液，甲醇乙腈溶液体积比为：甲醇:乙腈=70:30，流速：1.5ml/min；检测波长：436nm；柱温：30℃；分析时间60min；梯度洗脱程序以如下体积浓度进行：
0～4min，80%流动相A，20%流动相B；
4～14min，75%流动相A，25%流动相B；
14～15min，68%流动相A，32%流动相B；
15～21min，68%流动相A，32%流动相B；
21～28min，60%流动相A，40%流动相B；
28～37min，40%流动相A，60%流动相B；
37～45min，25%流动相A，75%流动相B；
45～50min，25%流动相A，75%流动相B；
50～52min，80%流动相A，20%流动相B；
52～60min，80%流动相A，20%流动相B；
（b）标准曲线制备：取氨基酸标准储备液，用0.1mol/LNaHCO3分别稀释成1、2、5、10、15、20nmol/ml的氨基酸标准液，各精密吸取200μl，置2mL离心管中，加DABS-Cl乙腈液200μL，盖紧摇匀，放入70℃恒温水浴中，保温20min，取出离心管，加入600μL衍生反应终止液，振荡混匀，转速8000r/min离心10min，精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线。
作为优选，所述步骤（3）供试品溶液衍生化反应：取稀释后消解液20ml置蒸发皿中水浴蒸干，固体用0.1mol/LNaHCO3溶液溶解定溶于5ml容量瓶中，精密吸取200μl置2mL离心管中，加DABS-Cl乙腈液200μL，盖紧摇匀，放入70℃恒温水浴中，保温20min，取出离心管，加入600μL衍生反应终止液，振荡混匀，转速8000r/min离心10min，备用。
作为优选，所述步骤（4）氨基酸出峰顺序为：1、门冬氨酸；2、谷氨酸；3、丝氨酸；4、精氨酸；5、苏氨酸；6、甘氨酸；7、丙氨酸；8、脯氨酸；9、缬氨酸；10、甲硫氨酸；11、异亮氨酸；12、亮氨酸；13、苯丙氨酸；14、胱氨酸；15、赖氨酸；16、组氨酸；17、酪氨酸。
柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸由于具有分析时间较短、灵敏度高等优点，近年来被越来越多地用于氨基酸分析，而衍生剂的选择是这种方法的关键。常用的衍生剂有邻苯二甲醛(OPA)、萘-2,3-二甲醛(NDA)、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)、异硫氰酸苯酯(PITC)、丹酰氯(Dansyl-Cl)、4二甲胺基苯偶氮磺酰氯(DABS-Cl)和6-氨基奎啉-N-羟基琥珀酰亚胺碳酸盐(AQC)等。不同的衍生剂都有各自的不足，如OPA不能与仲氨酸反应，FMOC需用戊烷萃取衍生完成后过剩的FMOC，使操作繁琐。而本发明选用4,4-二甲胺基偶氮苯-4′-磺酰氯(DABS-Cl)作为衍生剂，具有成本低、衍生产物稳定、操作简便等优点。
本发明由于采用了以上的技术方案，将微波水解和衍生相结合研究了蚕蛹蛋白微波水解以及水解后蚕蛹氨基酸的衍生反应，考察了实验条件对微波水解和蚕蛹氨基酸衍生的影响，建立了快速测定蚕蛹中氨基酸的方法，显著缩短了蚕蛹氨基酸分析时间。传统的蚕蛹氨基酸分析样品前处理水解时间比较长，需要加酸、抽真空、拉管、封管、110℃水解等步骤，不仅步骤繁琐，而且耗时长，处理过程中部分氨基酸易损失。微波是一种频率范围为300～300,000GHz的电磁波，水、酸等极性物质在微波场的作用下，使分子产生高速碰撞和摩擦，从而产生高热，使样品表面层搅动、破裂，直至样品消解完全。微波消解炉结合高压消解和微波快速加热两方面的性能，具有样品消解快、试剂耗用少、空白低、减少损失、回收完全、节能、省时、污染少等突出优点。在氨基酸分析的样品处理中，本发明通过各项实验条件摸索，找到了适合氨基酸分析样品微波前处理方法及衍生条件，得到了比较满意的结果。
本发明利用微波消解仪对蚕蛹样品进行酸水解预处理，采用高效液相色谱仪对蚕蛹水解样品进行氨基酸含量测定，其具有以下优点：
（1）提出以微波消解来替代传统水解蚕蛹中氨基酸，从而实现了操作简便，水解完全快速，环境污染小的样品预处理方法。
（2）采用灵敏度高、干扰小的高效液相色谱仪进行氨基酸含量分析，提高了分析速度和测定精度，且分析成本较低。
（3）整个分析过程简单、快速、灵敏、准确，广泛适用于蚕蛹中氨基酸含量的测定，可准确评价蚕蛹的质量优劣。
（4）本发明显示蚕蛹中含有丰富的氨基酸，包括人体必需氨基酸：甲硫氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸，并含有其他氨基酸如：门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、组氨酸、酪氨酸。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。
一种微波水解-HPLC法测定蚕蛹中氨基酸含量的方法，包括以下步骤：
（1）样品微波消解预处理：取待测蚕蛹样品粉末0.15～0.25g于微波消解罐中，加入3～4.0ml的5～6mol/L盐酸溶液，旋紧盖子，放上防爆裂膜，固定于保护套中，置微波消解仪内，消解采用程序升温，设置温度110～130℃，保持15～25分钟，待温度显示至室温时，打开微波消解仪，取出消解罐，转移样品至100ml容量瓶中，用0.1mol/L NaHCO3溶液稀释，定容至满刻度，待用；
（2）色谱条件及标准曲线制备：
（a）色谱条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，梯度洗脱液由pH为6.0～6.8的25mM KH2PO4缓冲液和甲醇乙腈溶液组成，流速：1.0～1.5ml/min；检测波长：436nm；柱温：30～40℃；分析时间50～70min；
（b）标准曲线制备：
取氨基酸标准储备液，用0.1mol/LNaHCO3分别稀释成1、2、5、10、15、20nmol/ml的氨基酸标准液，各精密吸取200μl，置2mL离心管中，加DABS-Cl乙腈液100～300μL，盖紧摇匀，放入50～70℃恒温水浴中，保温10～25min，取出离心管，加入适量衍生反应终止液，定容至1.0ml，振荡混匀，转速8000r/min离心10min，精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线；
（3）供试品溶液衍生化反应：取稀释后消解液20ml置蒸发皿中水浴蒸干，固体用0.1mol/LNaHCO3溶液溶解定溶于5ml容量瓶中，精密吸取200μl置2mL离心管中，加15nmol/mL DABS-Cl乙腈液100～300μL，盖紧摇匀，放入50～70℃恒温水浴中，保温10～25min，取出离心管，加入适量衍生反应终止液，定容至1.0ml，振荡混匀，转速8000r/min离心10min，备用；
（4）蚕蛹中氨基酸含量测定：精密吸取衍生化后供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积，根据标准曲线计算蚕蛹中氨基酸的含量。
本实施例中，所述步骤（1）样品微波消解预处理：取待测蚕蛹样品粉末0.2g于微波消解罐中，加入3.0ml的6mol/L盐酸溶液，旋紧盖子，放上防爆裂膜，固定于保护套中，置微波消解仪内，设置温度120℃，保持20分钟，然后冷却至室温，打开微波消解仪，取出消解罐，转移消解液至100ml容量瓶中，用0.1mol/L NaHCO3溶液稀释，定容至满刻度，待用。
本实施例中，所述步骤（2）中：
（a）色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A是pH为6.6的25mM KH2PO4缓冲液，流动相B是甲醇乙腈溶液，甲醇乙腈溶液体积比为：甲醇:乙腈=70:30，流速：1.5ml/min；检测波长：436nm；柱温：30℃；分析时间60min；梯度洗脱程序以如下体积浓度进行：
0～4min，80%流动相A，20%流动相B；
4～14min，75%流动相A，25%流动相B；
14～15min，68%流动相A，32%流动相B；
15～21min，68%流动相A，32%流动相B；
21～28min，60%流动相A，40%流动相B；
28～37min，40%流动相A，60%流动相B；
37～45min，25%流动相A，75%流动相B；
45～50min，25%流动相A，75%流动相B；
50～52min，80%流动相A，20%流动相B；
52～60min，80%流动相A，20%流动相B；
（b）标准曲线制备：取氨基酸标准储备液，用0.1mol/LNaHCO3分别稀释成1、2、5、10、15、20nmol/ml的氨基酸标准液，各精密吸取200μl，置2mL离心管中，加DABS-Cl乙腈液200μL，盖紧摇匀，放入70℃恒温水浴中，保温20min，取出离心管，加入600μL衍生反应终止液，振荡混匀，转速8000r/min离心10min，精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线。
本实施例中，所述步骤（3）供试品溶液衍生化反应：取稀释后消解液20ml置蒸发皿中水浴蒸干，固体用0.1mol/LNaHCO3溶液溶解定溶于5ml容量瓶中，精密吸取200μl置2mL离心管中，加15nmol/ml DABS-Cl乙腈液200μL，盖紧摇匀，放入70℃恒温水浴中，保温20min，取出离心管，加入600μL衍生反应终止液，振荡混匀，转速8000r/min离心10min，备用。
本实施例中，所述步骤（4）蚕蛹中氨基酸含量测定：精密吸取衍生化后供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪，按照色谱测定条件测定蚕蛹中各个氨基酸的峰面积，根据标准曲线计算蚕蛹中氨基酸的含量，蚕蛹样品中的氨基酸在色谱图中的峰面积与其含量呈线性关系。蚕蛹样品中氨基酸含量计算式为：
公式中，X由工作曲线方程算出的氨基酸含量，ng/ml；
C-蚕蛹中各氨基酸含量，ng/g；
m-表示称取测定蚕蛹样品质量；
n1-表示样品液稀释倍数，n1=V浓缩后取样体积/V浓缩后总体积
n2-表示消解体积变化率，n2=V消解液取样体积/V消解液总体积
本实施例中，所述步骤（4）氨基酸出峰顺序为：1、门冬氨酸；2、谷氨酸；3、丝氨酸；4、精氨酸；5、苏氨酸；6、甘氨酸；7、丙氨酸；8、脯氨酸；9、缬氨酸；10、甲硫氨酸；11、异亮氨酸；12、亮氨酸；13、苯丙氨酸；14、胱氨酸；15、赖氨酸；16、组氨酸；17、酪氨酸。
下面结合具体的实验条件对本发明做进一步的说明：
仪器和试剂：
EXCEL全功能微波消解仪-上海屹尧微波化学技术有限公司
Prostar高效液相色谱仪-美国Varian公司
Bp211D电子分析天平-德国赛多利斯
HANNA PH201酸度计-意大利HANNA仪器有限公司
KQ3200DB超声波清洗器-昆山市超声仪器有限公司
2K82-J真空干燥箱-上海实验仪器厂
DK-S24型电热恒温水浴锅-嘉兴市中新医疗仪器有限公司
YXJ-2型离心机-常州电讯电器厂
氨基酸标准品（Waters公司）；磺酰氯二甲胺偶氮苯（SUPECOL公司，下简称DABS-Cl）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国默克公司）；磷酸二氢钾；氢氧化钠；碳酸氢钠；丙酮；乙醇等均为分析纯；水为超纯水。
高效液相色谱测定条件：
YMC-Pack ODS-A柱(C18，250×4.6mm，5μm)；流动相A：（25mM KH2PO4、pH=6.6）；流动相B（乙腈：甲醇=70：30）；梯度程序：0～4min，80%A；4～14min，75%A；14～15min，68%A；15～21min，68%A；21～28min，60%A；28～37min，40%A；37～45min，25%A；45～50min，25%A；50～52min，80%A；52～60min，80%A；流速：1.5mL/min，检测波长：436nm；柱温：35℃；运行时间：60min。
一、蚕蛹微波消解法条件考察
取待测蚕蛹样品粉末约0.2g于微波消解罐中，加入2～4.0ml的1～6mol/L盐酸溶液，旋紧盖子，放上防爆裂膜，固定于保护套中，置微波消解仪内，消解采用程序升温，设置温度90～130℃，保持10～30分钟，待温度显示至室温时，打开微波消解仪，取出消解罐，转移样品至100ml容量瓶中，用0.1mol/LNaHCO3溶液稀释。
1、微波消解盐酸浓度考察
精密称取蚕蛹样品粉末约0.20g置于微波消解管中，共六份，分别加入1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L HCL溶液3ml，固定盖子，放入微波消解仪中，设置温度120℃，运行20分钟后停止微波消解，待降温至室温时，取出，用纯水稀释定容至100ml容量瓶中，过滤后，取滤液20ml水浴蒸干，固体用0.1mol/LNaHCO3溶液溶解定溶于1ml容量瓶中，得到供试品溶液，分别测定供试品溶液中的总氨基酸含量，结果见表1。
表1盐酸浓度对蚕蛹总氨基酸消解的影响
以上结果可以看出，随着盐酸浓度的升高，消解得到的总氨基酸含量逐渐增大，当盐酸浓度大于5mol/L时蚕蛹消解后总氨基酸含量变化不大，为保证蚕蛹氨基酸水解完全，选择盐酸浓度为6mol/L。
2、微波消解盐酸用量考察
精密称取蚕蛹样品粉末约0.20g置于微波消解管中，共四份，分别加入6mol/L盐酸溶液1ml、2ml、3ml、4ml，固定盖子，放入微波消解仪中，设置温度120℃，运行20分钟后停止微波消解，待降温至室温时，取出，用纯水稀释定容至100ml容量瓶中，过滤后，取滤液20ml水浴蒸干，固体用0.1mol/LNaHCO3溶液溶解定溶于1ml容量瓶中，得到供试品溶液，分别测定供试品溶液中的总氨基酸含量，结果见表2。
表2 盐酸用量积对蚕蛹氨基酸消解的影响
以上结果可以看出，随着盐酸体积的增加，消解得到的总氨基酸含量逐渐增大，当盐酸的加入量大于3.0ml时，即固液比为1：15时，所测得的总氨基酸含量已无明显变化，可见加酸3.0ml时就可完全水解出0.20g蚕蛹中的氨基酸，因此，消解时加入6mol/L盐酸3.0ml即可。
3、微波消解温度考察
精密称取蚕蛹样品粉末约0.20g置于微波消解管中，共五份，分别加入6mol/L HCL溶液3ml，固定盖子，放入微波消解仪中，分别设置温度100℃、110℃、120℃、130℃、140℃，运行20分钟后停止微波消解，待降温至室温时，取出，用纯水稀释定容至100ml容量瓶中，过滤后，取滤液20ml水浴蒸干，固体用0.1mol/LNaHCO3溶液溶解定溶于1ml容量瓶中，得到供试品溶液，分别测定供试品溶液中的总氨基酸含量，结果见表3。
表3消解温度对蚕蛹总氨基酸含量的影响
以上结果可以看出，随着消解温度的升高，消解得到的总氨基酸含量逐渐增大，当温度至130℃时，总氨基酸含量有下降趋势，可能是因为部分氨基酸遭到破坏，表明温度设置120℃，已能充分消解完蚕蛹中的氨基酸。故选择120℃为该微波消解的最佳温度。
4、微波消解时间考察
精密称取蚕蛹样品粉末约0.20g置于微波消解管中，共五份，分别加入6mol/L HCL溶液3ml，固定盖子，放入微波消解仪中，设置温度120℃，分别运行10、15、20、25、30分钟后停止微波消解，待降温至室温时，取出，用纯水稀释定容至100ml容量瓶中，过滤后，取滤液20ml水浴蒸干，固体用0.1mol/LNaHCO3溶液溶解定溶于1ml容量瓶中，得到供试品溶液，分别测定供试品溶液中的总氨基酸含量，结果见表4。
表4消解时间对蚕蛹总氨基酸含量的影响
以上结果可以看出，随着消解时间的增加，消解得到的总氨基酸含量逐渐增大，当消解时间大于25分钟时，所测得的总氨基酸含量有下降趋势，可能是由于部分氨基酸受到破坏。故选择消解时间为20分钟。
综合以上微波消解方法条件考察，得出微波消解的最佳条件为：称取约0.20g蚕蛹样品粉末，缓缓加入6mol/L盐酸溶液3.0ml，120℃微波水解20分钟，考虑到直接升温至120℃会引起反应过烈，故增加90℃保持1分钟，110℃保持1分钟，120℃保持20分钟的程序，确保微波消解反应的安全进行。
二、氨基酸衍生化条件考察
1、衍生剂用量对氨基酸衍生反应的影响
在衍生化条件考察过程中发现氨基酸与衍生剂DABS-Cl乙腈液的反应并非按照1:1反应进行，DABS-Cl乙腈液的用量往往需要过量，为了使氨基酸能完全衍生化，必需要加入足够量的衍生剂，但用量过大又会使副产物增多，影响氨基酸的定量分析。本试验固定总氨基酸量，精密吸取20nmol/ml的氨基酸标准液200μl，分别加入浓度为15nmol/ml DABS-Cl乙腈液100μl、150μl、200μl、300μl进行衍生化反应，加入衍生终止液，分别定容至1.0ml，注入液相色谱仪，分析色谱图，从结果可看出脯氨酸峰面积在衍生剂用量为100μl时最大，谷氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸峰面积在衍生剂用量为150μl时为最大；精氨酸、甘氨酸、胱氨酸峰面积在衍生剂用量为200μl时达最大，衍生剂用量为300μl时，丝氨酸，苏氨酸峰面积达最大，但其峰面积较衍生剂用量为200μl时变化不大，且有谷氨酸，脯氨酸，缬氨酸，赖氨酸等个别氨基酸峰面积减小，由此可以看出，衍生反应剂量并不是越大越好，吸取20nmol/ml的氨基酸标准液200μl，加入浓度为15nmol/ml DABS-Cl乙腈液200μl已能使氨基酸充分衍生化。
2、衍生时间和温度对氨基酸衍生物生成的影响
在实验过程中，发现衍生反应温度和反应时间对衍生物的产生均有一定影响，故对衍生时间和衍生温度进行了考察，试验中固定同一样品溶液，精密吸取200μL，加入浓度为15nmol/ml DABS-Cl乙腈液200μl。设计正交试验，见表5，表6。
表5因素水平表
表6正交试验及结果
经过直观分析和实验数据比较，确定了A1B2C3为最佳反应条件，即反应时间20min，温度70℃为最佳反应条件。
3、综合方差分析，结果见表7.
表7综合方差分析表
综合方差分析结果可看出，衍生反应温度有显著性影响，说明衍生时温度不能太低，否则衍生反应不够完全，本试验选择70℃为反应温度，同时，反应时间对衍生化也产生一定的影响，反应时间增加，反应就越完全，但时间过长，反而降低衍生物的产生，本试验选择反应20分钟为宜。
4、验证试验
精密吸取同一浓度的样品溶液200μl，加入浓度为15nmol/ml DABS-Cl乙腈液200μl，在70℃水浴中反应20分钟后，用反应终止液定容至1.0ml，过0.45μm滤膜后，注入高效液相色谱仪，测定各氨基酸的峰面积并计算总氨基酸含量，平行试验3次，结果3次的测定结果总氨基酸含量分别为604.6mg/g、608.8mg/g、605.1mg/g，以上结果表明，在该衍生条件下，各氨基酸与衍生剂已能充分衍生。
5结论
综合以上衍生方法条件考察，得出氨基酸衍生的最佳条件为：精密吸取消解处理后的蚕蛹水解液200μl（如发现蚕蛹中总氨基酸浓度较高，可适当稀释），加入浓度为15nmol/ml DABS-Cl乙腈液200μl，在70℃水浴中反应20分钟后，用反应终止液定容至1.0ml，即可。
三、色谱条件的考察
1、检测波长的选择
对衍生后的氨基酸进行全波长扫描，结果发现，在436nm处，各氨基酸衍生物的响应值均较高，故选择436nm为检测波长。
2、流动相pH值对氨基酸分离的影响
氨基酸的分离效率与流动相pH值有直接的关系。故我们选择不同pH值（6.2、6.4、6.6、6.8、7.0）的流动相时对图谱进行比较（其它色谱条件不变）。直观分析：当磷酸二氢钾缓冲液pH为6.6时，17种氨基酸分离效果最好，pH=6.4和pH=6.8时分离度次之，pH=6.2和pH=7.0时，分离度欠佳。因此选择磷酸缓冲液pH=6.6。
3、流动相流速对氨基酸分离的影响
流动相流速的大小是色谱峰分离至关重要的因素，一般来说流速越小，柱压越低，分离效果越好，但峰形会稍差，分析时间也较长，流速越大，柱压越高，峰形较好，但分离度欠佳，分析时间较短，所以必须选择一个合适的流动相流速，本试验选择流动相流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min、1.5ml/min时分别进样，对色谱图进行比较分析，结果表明，选择流动相流速为1.5ml/min，氨基酸分离度和峰形均较好，且能在60分钟内分析完成。
4、柱温对氨基酸分离的影响
柱子温度对色谱峰分离也有着一定的影响，柱温低，出峰时间会延后，柱温高，出峰时间提前，且随着温度的变化，色谱峰的分离度也会随之变化，从而影响色谱峰的定量分析，本试验选择柱子温度为20℃、30℃、40℃时分别进样，对色谱图进行比较分析，结果表明，当选择柱子温度为30℃时，各氨基酸出峰时间适中，分离度和峰形均良好。
四、方法学的考察
1、标准曲线绘制：
取氨基酸标准储备液（1000nmol/ml），用0.1mol/LNaHCO3分别稀释成1、2、5、10、15、20nmol/ml的氨基酸标准液，各精密吸取200μl，置2mL离心管中，加入浓度为15nmol/mL的DABS-Cl乙腈液200μL，盖紧摇匀，放入70℃恒温水浴中，保温20min，取出离心管，冷却后，加入600μL衍生反应终止液，振荡混匀，离心10min(转速8000r/min)，精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线。结果见表8。
表8氨基酸工作曲线、相关系数及线性范围
工作曲线中：Y表示峰面积，X表示进样浓度，ng/ml
以上结果表明，各氨基酸进样浓度与峰面积均呈良好的线性关系。
2、精密度试验
精密吸取衍生后的氨基酸标准品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积，计算各氨基酸RSD值，结果见表9。
表9精密度试验（峰面积）
以上结果表明，仪器精密度良好。
3、稳定性试验
按照标准曲线制备项下的方法衍生标准品，取衍生后的氨基酸标准品，精密吸取10μl，按上述方法分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h时进样，测定各氨基酸峰面积，并计算相应RSD值，结果见表10。
表10稳定性试验（峰面积）
以上结果表明，氨基酸衍生物在48h内均比较稳定。
4、加样回收率试验：取已知各氨基酸含量的蚕蛹粉末样品0.1g，精密称定，加入浓度为0.1mmol/ml氨基酸标准品溶液0.3ml，共制备6份，按供试品处理方法进行微波消解和衍生化反应，处理后样品注入液相色谱仪，测定各氨基酸含量，并计算各氨基酸回收率及RSD值，结果见表11。
表11加样回收率试验结果
由表11可知：各氨基酸的加样回收率在97.48%～102.10%之间，相对标准偏差RSD值低于2.91%。本方法适合用于蚕蛹中总氨基酸含量的测定。
5、不同来源蚕蛹中氨基酸含量测定
将不同来源的蚕蛹样品经最佳条件微波消解，进行衍生化处理后，注入液相色谱仪，记录各氨基酸峰面积，并计算各氨基酸的含量。测定结果见表12。
表12不同来源产地蚕蛹中氨基酸含量(n=3) 单位：mg/g
以上结果显示：来源于浙江桐乡的蚕蛹总氨基酸含量达612.50mg/g，江苏吴中产的蚕蛹总氨基酸含量达588.57mg/g，山东平度产的蚕蛹总氨基酸含量达561.77mg/g，陕西安康产的蚕蛹总氨基酸含量达523.00mg/g，相比较而言，浙江桐乡和江苏吴中产的蚕蛹总氨基酸含量较高，山东平度产的蚕蛹总氨基酸含量次之，陕西安康产的蚕蛹总氨基酸含量相对较低。通过微波消解-高效液相色谱法测定蚕蛹中氨基酸含量的方法，客观的反映出不同来源蚕蛹中的氨基酸含量，为准确评价蚕蛹质量的优劣提供一种有效手段。
需要强调的是：以上仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (2)
1.一种微波水解-HPLC法测定蚕蛹中氨基酸含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)样品微波消解预处理：取待测蚕蛹样品粉末0.20g于微波消解罐中，加入3.0ml的6mol/L盐酸溶液，旋紧盖子，放上防爆裂膜，固定于保护套中，置微波消解仪内，消解采用程序升温，90℃保持1分钟，110℃保持1分钟，120℃保持20分钟，待冷却至室温时，打开微波消解仪，取出消解罐，转移样品至100ml容量瓶中，用0.1mol/L NaHCO3溶液稀释至满刻度，待用；
(2)色谱条件及标准曲线制备：(a)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A是pH为6.6的25mM KH2PO4缓冲液，流动相B是甲醇乙腈溶液，甲醇乙腈溶液体积比为：甲醇:乙腈＝70:30，流速：1.5ml/min；检测波长：436nm；柱温：30℃；分析时间60min；梯度洗脱程序以如下体积浓度进行：
0～4min，80％流动相A，20％流动相B；
4～14min，75％流动相A，25％流动相B；
14～15min，68％流动相A，32％流动相B；
15～21min，68％流动相A，32％流动相B；
21～28min，60％流动相A，40％流动相B；
28～37min，40％流动相A，60％流动相B；
37～45min，25％流动相A，75％流动相B；
45～50min，25％流动相A，75％流动相B；
50～52min，80％流动相A，20％流动相B；
52～60min，80％流动相A，20％流动相B；
(b)标准曲线制备：取氨基酸标准储备液，用0.1mol/LNaHCO3分别稀释成1、2、5、10、15、20nmol/ml的氨基酸标准液，各精密吸取200μl，置2mL离心管中，加DABS-Cl乙腈液200μL，盖紧摇匀，放入70℃恒温水浴中，保温20min，取出离心管，加入600μL衍生反应终止液，振荡混匀，转速8000r/min离心10min，精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线；
(3)供试品溶液衍生化反应：取稀释后消解液20ml置蒸发皿中水浴蒸干，固体用0.1mol/LNaHCO3溶液溶解定溶于5ml容量瓶中，精密吸取200μl置2mL离心管中，加DABS-Cl乙腈液200μL，盖紧摇匀，放入70℃恒温水浴中，保温20min，取出离心管，加入600μL衍生反应终止液，振荡混匀，转速8000r/min离心10min，备用；
(4)蚕蛹中氨基酸含量测定：精密吸取衍生化后供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积，根据标准曲线计算蚕蛹中氨基酸的含量。
2.根据权利要求1所述的一种微波水解-HPLC法测定蚕蛹中氨基酸含量的方法，其特征在于：所述步骤(4)氨基酸出峰顺序为：1、门冬氨酸；2、谷氨酸；3、丝氨酸；4、精氨酸；5、苏氨酸；6、甘氨酸；7、丙氨酸；8、脯氨酸；9、缬氨酸；10、甲硫氨酸；11、异亮氨酸；12、亮氨酸；13、苯丙氨酸；14、胱氨酸；15、赖氨酸；16、组氨酸；17、酪氨酸。
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