CN107515256A

CN107515256A - 一种鉴别枣花蜜、荆条蜜、洋槐蜜和龙眼蜜的方法

Info

Publication number: CN107515256A
Application number: CN201710315049.XA
Authority: CN
Inventors: 曹炜; 程妮; 孙政; 杨万锁
Original assignee: SHAANXI BEE PRODUCT ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER; Northwest University
Current assignee: SHAANXI BEE PRODUCT ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER; Northwest University
Priority date: 2017-05-08
Filing date: 2017-05-08
Publication date: 2017-12-26

Abstract

本发明公开了一种鉴别枣花蜜、洋槐蜜、荆条蜜和龙眼蜜四种蜂蜜的方法。首先测定了不同产地的四种的总蛋白质含量，超滤法提取蜂蜜中的蛋白质，酸法水解后，高效液相色谱法测定蛋白质水解氨基酸含量，判别分析法处理蛋白质水解氨基酸数据，建立判别模型。本发明设计合理，所选分析仪器灵敏度高，可行性强，可准确鉴别枣花蜜、洋槐蜜、荆条蜜和龙眼蜜四种蜂蜜，为这四种蜂蜜的花源鉴别提供可靠依据。

Description

一种鉴别枣花蜜、荆条蜜、洋槐蜜和龙眼蜜的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别枣花蜜、荆条蜜、洋槐蜜和龙眼蜜的方法，特别是基于蛋白质水解氨基酸含量鉴别四种蜂蜜花源的方法，属于食品科学领域。

背景技术

蜂蜜（honey）是一种富含多种营养物质的天然甜味剂，花源植物是影响蜂蜜营养价值和市场价格的最主要因素。枣花蜜、荆条蜜、洋槐蜜和龙眼蜜是我国产量较大，品质较好的四种蜂蜜。枣花蜜（Ziziphus jujuba Mlii）呈琥珀色、深色，蜜汁透明或略浊，有光泽，质地粘稠，气味浊香，有特殊的枣花香味。荆条蜜（vitex negundo L）呈半透明琥珀状，结晶细腻乳白，口感甜而不腻。洋槐蜜（Robinin pseudoacacia L.）呈水白色，透名状，具有槐花香味，不易结晶，为上等蜂蜜。龙眼蜜（Dimocarpus longan Lour.）呈琥珀色，食味甘甜，不易结晶，具有龙眼的浓烈香气，是蜜中上品。

蛋白质是蜂蜜中一类重要的营养物质。目前对蜂蜜中蛋白质的研究多集中于蛋白质电泳、酶活性和蛋白质免疫特性三个方面，但是蛋白质电泳很难提供精确的数据，而酶活性和蛋白质免疫特性的研究又需要精密仪器。基于不同蜂蜜中蛋白质种类和含量的不同，研究蛋白质水解氨基酸含量间的差异，是研究蜂蜜蛋白质的一个新方向。

发明内容

本发明目的是提供一种基于蛋白质水解氨基酸鉴别四种蜂蜜花源的方法。

本发明实现过程如下：

一种基于蛋白质水解氨基酸鉴别四种蜂蜜花源的方法，主要通过超滤法提取蜂蜜中的蛋白质，将蛋白质酸式水解后，利用高效液相色谱串联二极管阵列检测器测定蛋白质水解氨基酸含量，结合化学计量学方法对进行花源鉴别的方法。

具体来说包括以下步骤：

（1）采集不同产地的荆条蜜、洋槐蜜、枣花蜜和龙眼蜜样品各10个作为研究对象，将蜂蜜样品加蒸馏水溶解、定容，采用考马斯亮蓝法测定蜂蜜样品的总蛋白质含量；

（2）采用超滤法分别提取四种蜂蜜中的蛋白质，-20℃冷冻干燥，收集蛋白粉末，酸法水解蛋白质，使用waters Accq·Tag试剂盒衍生蛋白质水解氨基酸，配制成供试样品；

（3）使用HPLC-DAD测定样品中蛋白质水解氨基酸含量；

（4）以18种蛋白质水解氨基酸含量为变量，运用化学计量学中Fisher判别分析方法对蜂蜜样品进行分析，四种蜂蜜能够按花源准确分类。

上述18种蛋白质水解氨基酸为：天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。

上述液相色谱条件为：色谱柱：waters Accq·Tag 氨基酸分析柱(150mm × 3.9mm, 5 µm)；流动相：乙腈，超纯水和waters Accq·Tag 缓冲液；流动相流速：1.0 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱；检测波长：248nm；柱温：37℃。

本发明的优点与积极效果：（1）本发明建立了一种基于蛋白质水解氨基酸鉴别蜂蜜花源的新方法；（2）本发明选择研究蜂蜜中的蛋白质水解氨基酸相比其它蛋白质研究更加简便快捷；（3）本发明结合化学计量学方法中的判别分析建立了一种花源判别准确率达100%的判别模型。

附图说明

图1 为蜂蜜样品判别分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例作进一步的说明。

本发明方法使用超滤法提取蜂蜜中的蛋白质，冷冻干燥浓缩，酸式水解法将蛋白质水解为氨基酸，使用waters Accq·Tag试剂盒衍生蛋白质水解氨基酸，高效液相色谱串联二极管阵列检测器(HPLC−DAD)测定蛋白质水解氨基酸含量，结合化学计量学方法鉴别四种蜂蜜。

具体来说步骤如下：

准确称取四种蜂蜜包括枣花蜜、洋槐蜜、荆条蜜和龙眼蜜各5g，溶于10mL由蒸馏水：PBS溶液=1:1配制的溶液中。吸取1.00mL样品溶液和5.00mL考马斯亮蓝溶液于比色管中摇匀，放置5min，在595nm处测定吸光度。根据标准曲线计算蜂蜜中总蛋白质浓度。

分别称取四种蜂蜜包括枣花蜜、洋槐蜜、荆条蜜和龙眼蜜各20g，200mL左右蒸馏水充分溶解。将样品溶液到倒入装有孔径为1KDa的超滤膜的超滤杯内，N₂加压超滤至溶液剩余10mL左右。将剩余溶液收集至不锈钢的铁盘中，-20℃冷冻干燥，收集蛋白粉末，-20℃保存备用。

精确称取0.5g蛋白质粉末于蛋白质水解管内，加入6mol/L HCl溶液10~15mL，苯酚3~4滴，通氮2~3min除氧，马上封好水解管。将水解管置于112~116℃的干燥箱中加热24h。待水解管冷却至室温后，用12mol/L的氢氧化钠将水解溶液的调pH至中性，蒸馏水定容至25mL，得到蛋白质水解氨基酸的待测溶液，0.45μm滤膜过滤备用。

将waters Accq·Tag 试剂盒中衍生剂稀释液2B lmL加入到衍生粉末2A中，配成衍生剂。吸取10μL 样品溶液于6×50mm 样品管底部，加入70μL AccQ Flour 1涡旋混合，加20μL配制好的衍生剂涡旋混合，室温放置1 min，55℃加热10min，备用。

HPLC−DAD分析中，色谱柱为waters Accq·Tag 氨基酸分析柱(150mm × 3.9 mm,5 µm)；流动相A为乙腈，B为超纯水和C为waters Accq·Tag 缓冲液；流动相流速为1.0 mL/min；检测波长为248nm；柱温为37℃；进样量为10μL。梯度洗脱程序如下：0min-0.5min C100%；0.5min-18min A 5%,C 95%；18min-19min A 5%-9%，C 95%-91%；19min-29min A 9%-17%，C 91%-83%；29min-38min A 17%-60% B 0%-40% C 83%-0%；38min-40min A 60%-0%，B40%-0%，C 0%-100%。

因超滤法提取蛋白质和冷冻干燥均会使蛋白质含量损失，所以本方法结合蜂蜜中总蛋白质含量和色谱法测得的蜂蜜中每种水解氨基酸的百分含量计算每千克蜂蜜中含每种蛋白质水解氨基酸的含量。以蛋白质水解氨基酸含量为变量，应用Fisher判别分析方法鉴别蜂蜜花源，结果参见图1。

根据上述方法，四种蜂蜜可以准确分离。因此，本发明适用于鉴别枣花蜜、洋槐蜜、荆条蜜和龙眼蜜四种蜂蜜。

Claims

1.一种基于蛋白质水解氨基酸鉴别四种蜂蜜花源的方法，其特征在于包括以下步骤：

（3）使用HPLC-DAD测定样品中蛋白质水解氨基酸含量；

2.根据权利要求1所述的基于蛋白质水解氨基酸鉴别四种蜂蜜花源的方法，其特征在于：步骤（3）中，液相色谱条件为：色谱柱：waters Accq·Tag 氨基酸分析柱；流动相：乙腈，超纯水和waters Accq·Tag 缓冲液；流动相流速：1.0 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱；检测波长：248nm；柱温：37℃。

3.根据权利要求1所述的基于蛋白质水解氨基酸鉴别四种蜂蜜花源的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述18种蛋白质水解氨基酸为：天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。