CN114088848A - 一种鉴别蜂蜜产地来源的方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蜂蜜检测技术领域,具体公开了一种鉴别蜂蜜产地来源的方法与应用。本发明的鉴别蜂蜜产地来源的方法,通过将待鉴定蜂蜜中的蛋白质中的碳稳定同位素比值与各产地的蜜源植物的雄蕊中的碳稳定同位素比值进行皮尔逊相关性分析,从而鉴别所述待鉴定蜂蜜的产地来源;所述蜜源植物根据所述待鉴定蜂蜜的种类确定。本发明可以为蜂蜜产地溯源提供一种快速、准确、稳定和可靠的方法。
Description
技术领域
本发明涉及蜂蜜检测技术领域,具体地说,涉及一种鉴别蜂蜜产地来源的方法与应用。
背景技术
蜂蜜是一种不含添加剂或防腐剂的甜而粘稠的物质,是蜜源植物的花蜜或植物活体分泌物或在植物活体上吮吸的蜜源昆虫排泄物经由蜜蜂采集、加工和浓缩后形成。蜂蜜因其独特的滋味、气味和营养价值而深受消费者喜爱,受利益的驱使,蜂蜜很容易掺假或标签混识以获得巨大的市场利润,这引起了公众对蜂蜜质量和来源真实性的广泛关注。
目前,用于鉴定蜂蜜真实性的常规分析方法包括化学分析、物理特性、感官参数和花粉分析,但这些方法有一定的局限性。因此,各种仪器方法如红外光谱、拉曼光谱、核磁共振、气相色谱、液相色谱和稳定同位素质谱等已被开发用于蜂蜜的真实性识别。其中,稳定同位素质谱法被认为能够提供更加准确、可靠的溯源信息而在蜂蜜真实性识别研究中得到了广泛应用。稳定同位素溯源是指利用不同地区植物中稳定同位素的自然丰度的差异来实现识别植物生长环境的目的。
蜂蜜富含多种化学成分,其品质特性与地理来源和花蜜植物密切相关,特别是其外观、口感和营养特征往往由蜜源植物决定。目前,利用碳稳定同位素技术对蜂蜜进行产地溯源和品质分析的研究表明蜂蜜的一些成分与植物的花粉和花蜜有关,这些研究主要集中在成熟蜜中,未见对碳稳定同位素从花、雄蕊、花蜜到蜂蜜及其组分中的分馏规律研究。
目前,利用同位素技术鉴定蜂蜜来源常结合建立模型,需要样品量大,数据处理复杂,且模型的准确度易受多种因素影响,会影响蜂蜜来源判定的准确度。因此,仍需进一步找寻更有效的蜂蜜来源判断方法。
发明内容
为解决蜂蜜来源不明现象,本发明提供了一种利用稳定同位素技术与相关性分析方法相结合的快速鉴定蜂蜜产地来源的方法。
为了实现该目的,本发明的技术方案如下:
一种鉴别蜂蜜产地来源的方法,其通过将待鉴定蜂蜜中的蛋白质中的碳稳定同位素比值与各产地的蜜源植物的雄蕊中的碳稳定同位素比值进行皮尔逊相关性分析,从而鉴别所述待鉴定蜂蜜的产地来源;所述蜜源植物根据所述待鉴定蜂蜜的种类确定。
碳是植物的关键组成成分,其组成和比例是研究稳定同位素分馏的重要指标。不同植物的碳稳定同位素存在一定的差异,除了植物的生物学特性外,还受到地域、年份、物种、具体部位和器官等多种因素的显著影响。蜜蜂采集植物的花蜜或者蜜露经酿造形成蜂蜜的过程也会存在碳稳定同位素分馏现象。本发明通过获得并分析植物和蜂蜜及其组分中的碳稳定同位素比值规律,提出了一种新的蜂蜜可追溯性方法。
本发明研究时首次将花和雄蕊分开,测定并获得从花、雄蕊、花蜜到蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值,并首次将植物、蜂蜜及其组分蛋白质、二糖、葡萄糖和果糖中的碳稳定同位素比值同时进行皮尔逊相关性分析,确定了蜂蜜及其组分和其植物来源之间存在相关性。相较于其他方法,本发明方法简化了数据处理步骤,直接将植物雄蕊和蜂蜜中蛋白的碳稳定同位素比值进行皮尔逊相关性分析,无需建模便可根据植物样本和蜂蜜蛋白的碳稳定同位素比值之间的相关性确定蜂蜜的产地来源,并且所需样本数量少。本发明方法还简化了测定指标,只需测定植物雄蕊和蜂蜜蛋白样品的碳稳定同位素即可。
本发明方法中,当所述待鉴定蜂蜜中的蛋白质中的碳稳定同位素比值与某一产地的蜜源植物的雄蕊中的碳稳定同位素比值之间,经皮尔逊相关性分析后存在相关性大于0.5的情况,则判定所述待鉴定蜂蜜来自于所述产地,若不存在相关性大于0.5的情况,则判定所述待鉴定蜂蜜并非来自于所述产地。
本发明方法中,碳稳定同位素比值的计算公式为:
δ13C (‰) =(R 样品-R 标准)/R 标准× 1000;
其中,R 样品和R 标准分别为样品和标准品的13C/12C比值。
本发明方法中,通过EA-IRMS方法分析测定所述蜜源植物的雄蕊中的碳稳定同位素,以及所述待鉴定蜂蜜中的蛋白质中的碳稳定同位素。
本发明方法中,所述蜜源植物的雄蕊在进行分析测定前,先经过-70~-80℃真空冷冻干燥至恒重,真空度为0-10 Pa。
本发明在研究时发现,若将所述蜜源植物的雄蕊通过普通烘箱进行干燥,会破坏样品成分,对实验测定结果造成影响。
本发明中,通过EA-IRMS方法分析测定时,载气为氦气,流速为90-110 mL/min,氧化柱温度:1350-1400℃,还原柱温度:550-650℃。
优选,通过EA-IRMS方法分析测定时,载气为氦气,流速为100 mL/min,氧化柱温度:1380℃,还原柱温度:600℃。
本发明在研究时,蜜源植物的花和花蜜也采用上述方法进行测定。所述待鉴定蜂蜜中的二糖、葡萄糖和果糖中的碳稳定同位素通过HPLC-IRMS方法分析测定。
HPLC-IRMS方法分析测定时,色谱柱为Phenomenex Rezek RCM(Ca2+),流动相为去离子水,流速为0.2-0.5 mL/min;质谱条件:离子源为EI源,参考气为CO2,氧化柱温度:80-120℃。
优选,通过HPLC-IRMS方法分析测定时,流速为0.3 mL/min;质谱条件:离子源为EI源,参考气为CO2,氧化柱温度:100℃。
本发明还提供一种上述方法在进行蜂蜜品质检测中的应用。
本发明的有益效果至少在于:
本发明利用植物雄蕊与蜂蜜中的蛋白质的碳稳定同位素比值的皮尔逊相关性结果进行蜂蜜产地来源的鉴定,所需样品量小,无需建立模型,直接对雄蕊和蜂蜜中的蛋白质的碳稳定同位素比值进行皮尔逊相关性分析,减少数据处理量,具有分析快速、准确的优点。能为蜂蜜的可追溯性和真实性提供科学、准确和技术上的手段,同时为蜂蜜产地溯源同位素数据库构建和蜂蜜产地来源甄别分析提供科学依据。
附图说明
图1为本发明研究方法技术路线示意图。
图2为实施例1中2017年湖北油菜植物和蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析结果。
图3为实施例1中2017年青海油菜植物和蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析结果。
图4为实施例1中2018年湖北油菜植物和蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析结果。
图中,*代表在0.05级别(双尾),皮尔逊相关性分析结果相关性显著,**代表在0.01级别(双尾),皮尔逊相关性分析结果相关性极显著,Rape flower为油菜花,Stamen为雄蕊,Nectar为花蜜,Honey为蜂蜜,Protein为蜂蜜的蛋白,Disaccharide为蜂蜜的二糖,Fructose为蜂蜜的果糖,Glucose为蜂蜜的葡萄糖,虚线圆圈位置表示图2、图3和图4在此位置都存在一样的相关性规律。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的,并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下,可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
油菜是人工种植的油料植物,是大宗、分布广和具有代表性的蜜源,富含蜜蜂和其它野生传粉者所需的花蜜和花粉。本发明实施例采用EA-IRMS和HPLC-IRMS方法,测定了从油菜花到雄蕊、花蜜和油菜蜜及其组分蛋白质、二糖、葡萄糖和果糖中的碳稳定同位素比值,同时,直接对油菜花、雄蕊、花蜜和油菜蜜及其组分蛋白质、二糖、葡萄糖和果糖的碳稳定同位素比值进行皮尔逊相关性分析,阐明其在植物和蜂蜜及其组分之间的关联,以期为蜂蜜的可追溯性和真实性提供科学、准确和技术上的手段,同时为蜂蜜产地溯源同位素数据库构建和蜂蜜产地来源甄别分析提供科学依据。
本发明中油菜植物(油菜花、雄蕊和花蜜)和油菜蜂蜜样品分别从全国各个不同蜂场及周边蜜源植物生产地直接采集,确保实验样品的真实性。本发明研究方法技术路线见图1,具体如下:
1. 油菜植物和蜂蜜样品的采集
从养蜂场附近的蜜源植物生长地采集了油菜花、雄蕊、花蜜(三者为植物样本)。为了防止植物蒸腾作用的影响,并确保在花蜜流量最高的时候进行采样,所有的油菜花、雄蕊和花蜜样本均在上午9-11点采集。每个样品点的油菜花样本取自约50朵油菜花,放于250mL棕色瓶中;雄蕊样品约3 mL,保存在10 mL离心管中;花蜜样品约20 μL,放入1 mL样品瓶中。同时,为了避免引入其他碳源,在取样过程中佩戴一次性尼龙手套。
油菜蜜样品(蜂蜜样本)直接从蜂箱中采集。在同一个蜂箱里有多个蜂巢,利用注射器从每个蜂巢吸取油菜蜜样本,并储存在250 mL棕色瓶子中。所有蜂蜜样品在分析前均保存在-18℃冰箱中。
本实施例中样品分别采自2017年湖北省钟祥市(湖北17年)、2017年青海省海北藏族自治州刚察县(青海17年)和2018年湖北省钟祥市(湖北18年),其中湖北17年油菜蜂蜜样本14个、青海17年油菜蜂蜜样本14个、湖北18年油菜蜂蜜样本41个。
2. 试剂
二水合钨酸钠(Na2WO4·2H2O)和硫酸(H2SO4)由Sigma-Aldrich(德国,慕尼黑)提供。正磷酸(99%)和过氧二硫酸钠(99%)由Sigma-Aldrich(德国,慕尼黑)供应。去离子化水(18.2 MΩ/cm)来自Milli-Q系统(美国,密理孔雷,贝德福德)。所有化学品和试剂均为分析纯度。果糖和葡萄糖标准品由百威科技有限公司(中国,北京)提供。采用的国际标准物质:IAEA-CH-7(δ13C:-32.15±0.05‰),IAEA-CH-6(δ13C:-10.45±0.04‰),蔗糖IAEA-CH-6(δ13C:-10.449±0.033‰),由国际原子能机构(奥地利,维也纳)提供。
3. 样品前处理方法
油菜花和雄蕊晾干后,于-75℃真空冷冻干燥45 h至恒重,真空度为0 Pa。粉碎后过100目筛,置于进样瓶中密封备用。上机前采用万分之一天平分别称取油菜花、雄蕊粉末和蜂蜜各2.0 mg;油菜蜜蛋白质按AOAC998.12方法提取,经干燥粉碎后,称取2.0 mg;油菜花蜜和蜂蜜样品直接称量2.0 mg。将上述称量完毕的样品用锡纸杯包裹紧密,待EA-IRMS分析测定。
油菜蜜经蒸馏水稀释,过0.45 μm滤膜后,取1.0 mL于进样瓶中并利用HPLC-IRMS进行二糖、葡萄糖和果糖的碳稳定同位素的分析测定。
4. 仪器分析
EA-IRMS仪器条件:
载气(He:纯度≥99.999%)流速为100 mL/min。氧化柱温度:1380℃,还原柱温度:600℃。
HPLC-IRMS仪器条件:
色谱条件:色谱柱为Phenomenex Rezek RCM(Ca2+),流动相为100%去离子水,流速为0.3 mL/min,通过isolink接口连接色谱与稳定同位素仪。
质谱条件:离子源为EI源,参考气为CO2(纯度≥99.999%),氧化柱温度:100℃。
5. 数据处理及统计分析
将油菜花、雄蕊、花蜜和蜂蜜及其组分蛋白质、二糖、葡萄糖和果糖中的碳稳定同位素测定结果根据下列公式进行碳稳定同位素比值计算:
δ13C (‰) =(R 样品-R 标准)/R 标准× 1000;
其中,R 样品和R 标准分别为样品和标准品(VPDB)的13C/12C比值。δ13C糖(二糖、葡萄糖和果糖)测定精度:±<0.2‰,其余组分δ13C测定精度:±<2‰。
同时,应用SPSS统计软件对植物和蜂蜜及其组分样品碳稳定同位素比值结果进行皮尔逊相关性分析。
6. 结果分析
EA-IRMS和HPIC-IRMS系统仪器的测量结果稳定可靠,线性范围良好,可满足分析要求。
2017年湖北油菜植物及油菜蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析见图2,由其可知蜂蜜中的蛋白质和植物雄蕊的碳稳定同位素比值之间的皮尔逊相关性大于0.5。
2017年青海油菜植物及油菜蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析见图3,由其可知蜂蜜中的蛋白质和植物雄蕊的碳稳定同位素比值之间的皮尔逊相关性大于0.5。
2018年湖北油菜植物及油菜蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析见图4,由其可知蜂蜜中的蛋白质和植物雄蕊的碳稳定同位素比值和之间的皮尔逊相关性大于0.5。
对湖北的油菜植物和青海的蜂蜜及其组分的碳稳定同位素的比值进行皮尔逊相关性分析,以及对青海的油菜植物和湖北的蜂蜜及其组分的碳稳定同位素的比值进行皮尔逊相关性分析,结果见表1-表8。
表1 湖北17年油菜植物和青海17年蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析结果-1
表2 湖北17年油菜植物和青海17年蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析结果-2
*在0.05级别(双尾),皮尔逊相关性分析结果相关性显著。**在0.01级别(双尾),皮尔逊相关性分析结果相关性极显著。画横线数据表示植物和蜂蜜及其组分分别来自不同产地,下表同。
表3 青海17年油菜植物和湖北17年蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析结果-1
表4 青海17年油菜植物和湖北17年蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析结果-2
表5 湖北18年油菜植物和青海17年蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析结果-1
表6 湖北18年油菜植物和青海17年蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析结果-2
表7 青海17年油菜植物和湖北18年蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析结果-1
表8 青海17年油菜植物和湖北18年蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性分析结果-2
由表1-表8中划横线的数据可知,湖北的植物和青海的蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值不相关,青海的植物和湖北的蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值不相关(不满足显著性要求)。结合上述可知,只有湖北的植物和湖北的蜂蜜及其组分,青海的植物和青海的蜂蜜及其组分的碳稳定同位素比值存在相关性。本发明可通过上述记载的方法,仅对蜜源植物雄蕊和蜂蜜蛋白的碳稳定同位素比值进行测定,并对结果进行皮尔逊相关性分析,若蜂蜜中的蛋白质和雄蕊之间的碳稳定同位素比值皮尔逊相关性大于0.5,则判断蜂蜜与所测蜜源植物来源于同一产地。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种鉴别蜂蜜产地来源的方法,其特征在于,通过将待鉴定蜂蜜中的蛋白质中的碳稳定同位素比值与各产地的蜜源植物的雄蕊中的碳稳定同位素比值进行皮尔逊相关性分析,从而鉴别所述待鉴定蜂蜜的产地来源;所述蜜源植物根据所述待鉴定蜂蜜的种类确定。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,当所述待鉴定蜂蜜中的蛋白质中的碳稳定同位素比值与某一产地的蜜源植物的雄蕊中的碳稳定同位素比值之间,经皮尔逊相关性分析后存在相关性大于0.5的情况,则判定所述待鉴定蜂蜜来自于所述产地,若不存在相关性大于0.5的情况,则判定所述待鉴定蜂蜜并非来自于所述产地。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,碳稳定同位素比值的计算公式为:
δ 13C (‰) =(R 样品-R 标准)/R 标准× 1000;
其中,R 样品和R 标准分别为样品和标准品的13C/12C比值。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于,通过EA-IRMS方法分析测定,所述蜜源植物的雄蕊中的碳稳定同位素,以及所述待鉴定蜂蜜中的蛋白质中的碳稳定同位素。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述蜜源植物的雄蕊在进行分析测定前,先经过-70~-80℃真空冷冻干燥至恒重,真空度为0-10 Pa。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,通过EA-IRMS方法分析测定时,载气为氦气,流速为90-110 mL/min,氧化柱温度:1350-1400℃,还原柱温度:550-650℃。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,通过EA-IRMS方法分析测定时,载气为氦气,流速为90-110 mL/min,氧化柱温度:1350-1400℃,还原柱温度:550-650℃。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于,通过EA-IRMS方法分析测定时,载气为氦气,流速为100 mL/min,氧化柱温度:1380℃,还原柱温度:600℃。
9.权利要求1-8任一项所述的方法在进行蜂蜜品质检测中的应用。
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