CN114324676A - 鉴别不同食粮所产蜂王浆的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鉴别不同食粮所产蜂王浆的方法，将蜂王浆样品用锡杯包裹后，置于元素分析仪‑稳定同位素比值质谱仪的氧化柱中，测定其δ¹³C、δ¹⁵N和δ¹⁸O值，根据δ¹³C和δ¹⁸O/δ¹⁵N数值判断蜂王浆的来源。本发明首次利用稳定同位素仪测定不同食粮来源（天然蜜粉源、糖水和代用花粉）所产蜂王浆的碳、氮和氧稳定同位素值，弥补了鉴别采食不同食粮所产蜂王浆差异的技术空白。本发明提供一种简单、快速的鉴别蜂王浆来源方法，对于快速鉴别不同食粮所产的蜂王浆、促进蜂产品产业化以及养蜂行业健康和可持续发展有重要意义。

Description

鉴别不同食粮所产蜂王浆的方法

技术领域

本发明属于食品检验与分析技术领域，具体地说，涉及一种鉴别不同食粮所产蜂王浆的方法。

背景技术

蜂王浆（Royal Jelly）又名蜂皇浆、蜂皇乳等，是由蜜蜂蜂群中的哺育蜂头部上颚腺和咽下腺分泌的一种淡黄色或者乳白色的乳块状物质，是工蜂饲喂蜂王以及蜜蜂幼虫的一种食物，对于蜜蜂的级型分化有着重要的作用。国内外大量的研究表明，蜂王浆中含有丰富的活性物质，是适宜人类的天然保健食品，具有抗菌消炎、抗氧化、调节血压血脂等作用。其中，蜂王浆中的多种生物活性物质与蜜蜂食用的食粮密切相关，因而饲喂不同食粮所产蜂王浆的品质差别较大。与此同时，由于蜂王浆的高价值以及不同食粮所生产的蜂王浆在品质上的差异，导致不法分子为了追求高额利润，在生产蜂王浆时给蜜蜂饲喂相对便宜的糖水和代用花粉，这对蜂王浆市场造成了极大的负面影响，损害了广大消费者的利益，也引起了公众对蜂王浆来源真实性的广泛关注。

传统检测方法（如花粉鉴别、感官鉴别和理化指标鉴别）能在一定程度上鉴别蜂王浆真实性，但存在一定局限性。目前，仪器分析法是蜂产品真实性识别的核心，新兴技术的应用为蜂产品品质研究提供了便利，核磁共振、气相色谱、液相色谱和稳定同位素质谱等技术在蜂王浆研究中得到应用。其中稳定同位素质谱法被认为能够提供更加准确、可靠的溯源信息而在蜂产品真实性识别研究中得到了广泛应用。迄今为止，尚无鉴别不同食粮所产蜂王浆的有关报道。而蜂王浆富含多种生物活性成分，其品质特性与蜜蜂食用的食粮密切相关，因此，建立简单、快速和准确的方法，从而实现不同食粮所产蜂王浆的区分是十分必要的。近年来，稳定同位素技术由于操作简单、无需样品前处理、环境友好和分析时间短等优点在食品鉴别上发挥了重要的作用，但目前尚未发现该技术鉴别不同食粮饲喂下所产蜂王浆差异的相关研究。此外，由于环境因素如：温度、降水量等变化，使得由单一同位素测得的结果会出现较大的误差，无法确定数据的真实性。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别不同食粮所产蜂王浆的方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种鉴别不同食粮所产蜂王浆的方法，将0.1~0.5 mg蜂王浆样品用锡杯（8 mm×5 mm）包裹后，置于元素分析仪-稳定同位素比值质谱仪的氧化柱中，测定其δ¹³C、δ¹⁵N和δ¹⁸O值，经显著性分析后可根据数值判断蜂王浆的来源：δ¹³C在-27.97‰~-27.56‰范围内，可以鉴别为采食天然蜜粉源（油菜花粉）所产的蜂王浆；δ¹⁸O/δ¹⁵N值在-32.34~-9.64范围内，可以鉴别为饲喂糖水（市售白糖，主要成分为蔗糖；糖水比例为1 g：1.5 mL）所产的蜂王浆；δ¹⁸O/δ¹⁵N值在-94.29~-51.37范围内，可以鉴别为饲喂代用花粉（市售代用花粉，主要成分为大豆粉）所产的蜂王浆。

进一步地，碳和氮稳定同位素测定条件为：

反应管温度：960~1000℃；色谱柱温度：65~70℃；氦气（纯度≥99.999%）载气流速：100~110 mL/min；氧气流速：250~280 mL/min；注氧时间：3~4 s。

氧稳定同位素测定条件为：

反应管温度：1380~1400℃；色谱柱温度：85~90℃；氦气（纯度≥99.999%）载气流速：100~120 mL/min。

本发明中，碳、氮和氧稳定同位素的测定结果按照以下公式计算：

δX (‰) = (R _样品-R _标准)/R _标准×1000

其中，R _样品和R _标准分别代表样品和标准品的稳定同位素比值。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

（一）本发明首次利用稳定同位素仪测定不同食粮来源（天然蜜粉源、糖水和代用花粉）所产蜂王浆的碳、氮和氧稳定同位素值，弥补了鉴别采食不同食粮所产蜂王浆差异的技术空白。

（二）相较其他鉴别蜂王浆的方法，本方法所需样品量和数据处理步骤较少，且无需建立模型便可根据蜂王浆的碳、氮和氧稳定同位素之间的差异性（直接分析数据即可）来确定蜂王浆的食粮来源。

（三）蜂王浆样品无需任何前处理过程，操作简单且避免了外来溶剂干扰。

（四）本发明提供一种简单、快速的鉴别蜂王浆来源方法，对于快速鉴别不同食粮所产的蜂王浆、促进蜂产品产业化以及养蜂行业健康和可持续发展有重要意义。

附图说明

图1为本发明方法技术路线示意图。

图2为本发明不同食粮所产的蜂王浆碳稳定同位素柱状图。图中小写字母不同表示差异极显著（p＜0.01），小写字母相同表示无显著性差异。

图3为本发明不同食粮所产的蜂王浆氧和氮稳定同位素比值柱状图。图中***表示差异极显著（p＜0.01）。

具体实施方式

本发明提供一种基于同位素比质谱仪对不同食粮（天然蜜粉源、糖水、代用花粉）所产蜂王浆快速鉴别的技术。通过直接用锡杯将蜂王浆样品包裹紧密后，放在具有纯氧脉冲及催化剂存在的在线式全自动燃烧管中燃烧，经化学纯化及分离后，用稳定同位素质谱仪测定其δ¹³C、δ¹⁵N和δ¹⁸O值。此外，利用Origin软件绘制柱状图，结果表明不同食粮所产蜂王浆的δ¹³C值和δ¹⁸O/δ¹⁵N值能得到很好地区分，证明该方法可用于鉴别蜂王浆的来源。本发明提供的鉴别方法所需样品量小，无需建立模型，直接利用蜂王浆的稳定同位素进行分析，减少数据处理量，具有操作简单、分析快速的优点。

本发明采用如下技术方案：

将蜂王浆样品直接应用于稳定同位素仪器中并获得碳、氮和氧稳定同位素，通过分析数据之间的差异来鉴别不同食粮（天然蜜粉源、糖水和代用花粉）所产蜂王浆。技术路线图见图1。

1. 蜂王浆样品的采集

从湖北省钟祥市的蜂场采集不同食粮（天然蜜粉源、糖水和代用花粉）所产蜂王浆。为确保采样的准确性，实验期间对不同处理的蜂箱分开放置，且进行编号标记。采集蜂种为意大利浆蜂，蜂王均是同源繁殖而来，蜂群群势良好无病虫害。蜂王浆储存在500 mL的塑料瓶中。所有样品在分析前均保存在-18℃冰箱中。

2. 稳定同位素标准物质

C、N同位素测定：USGS40（δ¹³C_VPDB = -26.39‰; δ¹⁵N_AIR = -4.52‰）。

O同位素测定：USGS54（δ¹⁸O_VSMOW = 17.79‰）、USGS55（δ¹⁸O_VSMOW = 19.12‰）、USGS56（δ¹⁸O_VSMOW = 27.23‰）。

USGS系列标准品均为美国地质勘探局Reston稳定同位素实验室研制。

3. 仪器分析

称取0.1~0.5 mg蜂王浆样品，用锡杯（8 mm×5 mm）紧密包裹样品后，放入96孔的盘中（酶联免疫板），通过自动进样器进入元素分析仪-稳定同位素比值质谱仪（EA-IRMS，Flash HT2000-MAT 253，美国赛默飞世尔公司）的氧化柱中，进行分析测定。

碳和氮稳定同位素仪器测定条件为：

反应管温度：960~1000℃；色谱柱温度：65~70℃；氦气（纯度≥99.999%）载气流速：100~110 mL/min；氧气流速：250~280 mL/min；注氧时间：3~4 s。

氧稳定同位素仪器测定条件为：

反应管温度：1380~1400℃；色谱柱温度：85~90℃；氦气（纯度≥99.999%）载气流速：100~120 mL/min。

4. 数据处理及统计分析

碳、氮和氧稳定同位素测定结果按照以下公式进行计算：

δX (‰) = (R _样品-R _标准)/R _标准×1000

其中，R _样品和R _标准分别代表样品和标准品的稳定同位素比值。

δ¹³C测定精度：±＜2‰；δ¹⁵N测定精度：±＜0.2‰；δ¹⁸O测定精度：±＜0.2‰。

数据分析软件采用SPSS 26.0版本进行方差分析，采用Origin 2017版本绘制柱状图。

5. 结果分析

EA-IRMS仪器的测量结果稳定可靠，可满足分析要求。基于稳定同位素技术对蜂王浆进行鉴别研究，不同食粮所产蜂王浆δ¹³C值的柱状图分析见图2，δ¹⁸O/δ¹⁵N值的柱状图分析见图3。不同食粮所产的蜂王浆在δ¹³C值和δ¹⁸O/δ¹⁵N值上出现极显著性差异（p＜0.01）。根据数值判断蜂王浆的来源：δ¹³C在-27.97‰~-27.56‰范围内，可以鉴别出采食天然蜜粉源所产的蜂王浆；δ¹⁸O/δ¹⁵N值在-32.34~-9.64范围内，可以鉴别出饲喂糖水所产的蜂王浆；δ¹⁸O/δ¹⁵N值在-94.29~-51.37范围内，可以鉴别出饲喂代用花粉所产的蜂王浆。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中用于产蜂王浆的蜜蜂品种为意大利蜂。

实施例1 鉴别不同食粮所产蜂王浆的方法

从湖北省钟祥市采集天然蜜粉源（油菜花粉）所产的蜂王浆500 mL于塑料瓶中，-18℃冷冻保存。称取0.1 mg蜂王浆样品，用锡杯（8 mm×5 mm）紧密包裹样品后，放入96孔的盘中（酶联免疫板），通过自动进样器进入元素分析仪-稳定同位素比值质谱仪（EA-IRMS，Flash HT2000-MAT 253，美国赛默飞世尔公司）的氧化柱中，进行分析测定。

碳和氮稳定同位素仪器测定条件为：

反应管温度：960℃；色谱柱温度：65℃；氦气（纯度≥99.999%）载气流速：100 mL/min；氧气流速：250 mL/min；注氧时间：3 s。

氧稳定同位素仪器测定条件为：

反应管温度：1380℃；色谱柱温度：85℃；氦气（纯度≥99.999%）载气流速：100 mL/min。

实验结果为：δ¹³C = -27.61‰，δ¹⁵N = 2.54‰，δ¹⁸O = 29.81‰。结果在上述范围以内，因此证明该方法可以鉴别采食天然蜜粉源所产蜂王浆。

实施例2 鉴别不同食粮所产蜂王浆的方法

从湖北省钟祥市采集饲喂糖水（蔗糖和水的比例为1 g：1.5 mL）所产的蜂王浆500mL于塑料瓶中，-18℃冷冻保存。测其碳、氮和氧稳定同位素的方法步骤同实施例1。实验结果为：δ¹³C = -18.81‰，δ¹⁵N = -0.84‰，δ¹⁸O = 27.03‰，δ¹⁸O/δ¹⁵N=-32.17，结果在上述范围以内，因此证明该方法可以鉴别饲喂糖水所产蜂王浆。

实施例3 鉴别不同食粮所产蜂王浆的方法

从湖北省钟祥市采集饲喂代用花粉（主要成分为大豆粉）所产的蜂王浆500 mL于塑料瓶中，-18℃冷冻保存。测其碳、氮和氧稳定同位素的方法步骤同实施例1。实验结果为：δ¹³C = -23.87‰，δ¹⁵N = -0.42‰，δ¹⁸O = 23.91‰，δ¹⁸O/δ¹⁵N=-56.93，结果在上述范围以内，因此证明该方法可以鉴别饲喂代用花粉所产蜂王浆。

对比例：

从湖北省钟祥市采集饲喂代用花粉所产的蜂王浆500 mL于塑料瓶中，-18℃冷冻保存。测其碳和氮稳定同位素的方法步骤同实施例1。实验结果为：δ¹³C = -23.09‰，δ¹⁵N =-0.69‰。根据该结果，只能区分出该蜂王浆不是天然蜜粉源所产的，却无法区分是饲喂糖水还是代用花粉所产的。因此必须测定蜂王浆中碳、氮和氧三种稳定同位素，才能区分不同食粮（天然蜜粉源、糖水和代用花粉）所产蜂王浆。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.鉴别不同食粮所产蜂王浆的方法，其特征在于，将0.1~0.5mg蜂王浆样品用锡杯包裹后，置于元素分析仪-稳定同位素比值质谱仪的氧化柱中，测定其δ¹³C、δ¹⁵N和δ¹⁸O值，经显著性分析后可根据数值判断蜂王浆的来源：δ¹³C在-27.97‰~-27.56‰范围内，可以鉴别为采食天然蜜粉源所产的蜂王浆；δ¹⁸O/δ¹⁵N值在-32.34~-9.64范围内，可以鉴别为饲喂糖水所产的蜂王浆；δ¹⁸O/δ¹⁵N值在-94.29~-51.37范围内，可以鉴别为饲喂代用花粉所产的蜂王浆；

所述糖水为蔗糖和水按1 g：1.5 mL比例混合而成；所述天然蜜粉源为油菜花粉；所述代用花粉为大豆粉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，碳和氮稳定同位素测定条件为：

反应管温度：960~1000℃；色谱柱温度：65~70℃；氦气载气流速：100~110 mL/min；氧气流速：250~280 mL/min；注氧时间：3~4 s；

氧稳定同位素测定条件为：

反应管温度：1380~1400℃；色谱柱温度：85~90℃；氦气载气流速：100~120 mL/min。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，碳、氮和氧稳定同位素的测定结果按照以下公式计算：

δX = (R _样品-R _标准)/R _标准×1000

其中，R _样品和R _标准分别代表样品和标准品的稳定同位素比值。

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