CN118010892A - 一种基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品医药检测技术领域，提供一种基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法，利用80%乙腈‑水溶液（含0.1%甲酸）从蜂王浆样品中提取金雀异黄酮，然后对其进行定性和定量分析，根据不同饲喂方式下蜜蜂所生产的蜂王浆中金雀异黄酮的含量差异来鉴别是否饲喂豆粕饲料。该方法根据饲料中的蛋白质源进行蜂王浆的鉴别，对原有根据饲料中的碳水化合物源进行鉴别的方法进行了补充。
Description
技术领域
本发明属于食品医药检测技术领域，具体地说，涉及一种基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法。
背景技术
蜂王浆（royal jelly）又称蜂皇浆，是年轻工蜂出生后第5至14天由咽下腺和上颚腺分泌的浆状物质，是工蜂幼虫和蜂王一生的食物，短暂食用蜂王浆的工蜂寿命约为35天，而终生食用蜂王浆的蜂王寿命可达1-5年[1]。蜂王浆中水含量约为60%-70%，粗蛋白质含量约为12%-15%，总糖含量约为10%-16%，脂类含量约为3%-6%，另外还有维生素、盐、成熟氨基酸等物质[2]。蜂王浆具有多种生物学活性，是一种适宜人类保健的天然食品[3]。大量研究表明，蜂王浆具有免疫调节作用，有助于延缓天然免疫衰老[4]，蜂王浆中特有的脂肪酸10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)对于免疫低下的治疗具有潜在作用并且能有效增强抗原特异性免疫应答[5,6]。另外，蜂王浆还有较强的抗菌活性及抗衰老作用[7]。与此同时，蜂王浆处理可显著改善由高脂饮食引起的葡萄糖稳态失调和炎症反应，具有抗糖尿病，抗肥胖活性[8]。
蜜蜂吸食花蜜和花粉来制造蜂王浆，当外界气候条件或蜜粉源条件不利时，蜂农们通常使用人工饲料给蜂群提供营养，常用的饲料包括蔗糖、豆粉、花粉等。同时，使用人工饲料喂养也可以提高产量，降低饲养成本[9]。国际化标准组织（ISO）发布的《蜂王浆》国际标准将经不同饲喂方式所生产的蜂王浆分为两类：类型1蜜蜂仅食用天然食物（花粉、花蜜和蜂蜜）；类型2蜜蜂食用天然食物和其它营养物质（蛋白质、碳水化合物等）并指出两种类型蜂王浆的δ13C值（C13/C12同位素比值）、蔗糖、吡喃糖基蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖指标存在差异，并做了分类要求[10]。目前已有的研究报道中鉴别不同饲喂方式所生产蜂王浆的方法主要为糖含量的分析测定和δ13C值的测定。Marine Wytrychowski等人[11]研究发现基于甘蔗或玉米淀粉水解物喂养产生的蜂王浆糖含量和δ13C值均与非饲喂的蜂王浆具有显著差异。此外，通过研究喂食蜜蜂人造糖和蛋白质对蜂王浆糖成分和δ13C值的影响，发现当蜂蜜被喂食蔗糖或玉米水解物（无论是否喂食蛋白质）时生产的蜂王浆δ13C值高达-17‰，麦芽糖、麦芽三糖、蔗糖和吡喃葡糖基蔗糖的含量也显著增加[12]。
现有的研究报道中鉴别饲喂蜂王浆的方法为糖含量的分析测定和δ13C值的测定。这两种方法主要针对外源糖饲喂蜂王浆的鉴别，而蜜蜂饲料中不仅含有碳水化合物，还包括蛋白质，目前主要应用的蛋白质源为豆粉。Wytrychowski Marine等人[11]的研究表明，外源糖饲喂蜂王浆的蔗糖、吡喃糖基蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖的含量以及δ13C值均高于天然饲喂蜂王浆。其中甘蔗或甜菜饲喂获得的蜂王浆蔗糖含量最高可达7.7%，吡喃糖基蔗糖含量高达1.7%，谷物和玉米淀粉水解物饲喂获得的蜂王浆麦芽糖含量为1.4%-5.5%，麦芽三糖含量为0.3%-1.7%；蔗糖或玉米水解物饲喂获得的蜂王浆δ13C值高达-17‰。糖含量的分析测定和δ13C值的测定仅能鉴别是否饲喂碳水化合物，而饲喂蛋白质对测定结果没有影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法，采用含0.1 v/v %甲酸的80%乙腈水溶液提取蜂王浆样品中的金雀异黄酮，以金雀异黄酮-氘4为内标物质，利用液相色谱串联质谱法对其进行定性和定量分析，根据不同饲喂方式下蜜蜂所生产的蜂王浆中金雀异黄酮的含量差异来鉴别是否给蜜蜂饲喂了豆粉饲料。
本发明中，金雀异黄酮（4',5,7-三羟基异黄酮）的结构式见图1A，金雀异黄酮-氘4的结构式见图1B。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
S1.标准溶液配制：用甲醇配制以下系列的含内标物质的金雀异黄酮标准工作液：0.5 µg/L、1 µg/L、5 µg/L、10 µg/L、20 µg/L、50µg/L；标准工作液中内标物质的含量为10µg/L。
S2.供试品溶液制备：取1g蜂王浆，加入1µg/mL的内标中间液200µL，加入2mL 0.1v/v %甲酸水溶液，涡旋1-5min（优选1min）后加入8mL含0.1% v/v甲酸的乙腈，涡旋5-10min（优选5min），将混合溶液置于50mL离心管中，4℃下8000r/min离心5-8min（优选5min）；取3mL上清液转移至EMR过滤柱中，重力作用下自然洗脱流出，收集全部洗脱液；取1mL洗脱液加入装有1mL水的离心管中，充分涡旋混合均匀，过0.2µm滤膜，得到供试品溶液；
S3.液相色谱串联质谱检测：取系列金雀异黄酮标准工作液、供试品溶液分别进样，以色谱峰面积为纵坐标，以系列金雀异黄酮标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线，用标准曲线对样品进行定量。
本发明中，EMR过滤柱内含专有的脂质去除吸附剂，能够在保留目标分析物的情况下实现脂质去除。例如，购自美国Agilent公司型号为5982-1010的EMR小柱。
在本发明的一个具体实施方式中，液相色谱串联质谱的检测条件为：
液相色谱条件如下：流动相A为0.1v/v%甲酸水溶液，流动相B为甲醇；洗脱条件见表1；Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱，2.1 mm×100 mm，2.7 µm，柱温为35℃；流速为0.3 mL/min；进样量为5.0 µL；
表1 液相梯度洗脱表
质谱条件如下：电喷雾离子源；正离子扫描方式；多反应监测模式；雾化器温度290℃，雾化器流速11 L/min，雾化器压力40 psi，毛细管电压3500 V，鞘流气温度350℃，鞘流气流速12 L/min。
进一步地，质谱检测的金雀异黄酮的母离子为270.9，定量离子为153.0（碰撞能量为35V），定性离子为91（碰撞能量为45V），驻留时间为3ms，传输电压为380V。内标物质金雀异黄酮-氘4的母离子为274.3，定量离子为219.0（碰撞能量为30V），定性离子为154.0（碰撞能量为30V），驻留时间为3ms，传输电压为380V。
本发明中，金雀异黄酮的回收率为61.92-105.83%，相对标准偏差小于14.37%，检测限为0.16µg/kg，定量限为0.47µg/kg。
鉴别方法：非饲喂和饲喂蜂王浆样品中金雀异黄酮含量如表2所示，非饲喂蜂王浆样品中均未检出金雀异黄酮，饲喂蜂王浆样品中金雀异黄酮含量为43.2811-278.7793µg/kg。因此，可以用金雀异黄酮的含量差异鉴别饲喂蜂王浆，含量大于方法定量限（0.47µg/kg）即为饲喂（豆粕）蜂王浆。图2A~图2D为本发明实例中测定的蜂王浆中金雀异黄酮的特征离子质量色谱图（MRM）。图3A~图3D为金雀异黄酮-氘4的特征离子质量色谱图（MRM）。
表2 非饲喂和饲喂蜂王浆样品中金雀异黄酮含量
注：＜LOQ表示小于方法定量限。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
（一）本发明以80%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）作为提取溶剂从蜂王浆样品中提取金雀异黄酮，并以金雀异黄酮-氘4为内标，利用液相色谱-串联质谱仪对其进行定性和定量分析。通过对提取溶剂进行优化，结果表明选用80%乙腈-水溶液作为提取溶剂，并添加0.1%甲酸能够获得最高的提取效率。
（二）本发明采用液相色谱-串联质谱联用技术是以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，经提取和纯化后的样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化，经由检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性，高灵敏度及能够提供相对分子量和结构信息的优点。
（三）本发明根据金雀异黄酮的含量可以鉴别饲喂蜂王浆，该方法的优点是简单，快速，准确，稳定，对已有的鉴别方法进行了补充，使鉴别结果更具有说服力。
（四）本发明提供了鉴别饲喂蜂王浆的新方法，对于相关部门对蜂王浆产品质量的监督有着重要的意义，同时也便于消费者根据自己的喜好选择适宜的产品。
附图说明
图1A为金雀异黄酮的结构式；图1B为金雀异黄酮-氘4的结构式。
图2A~图2D为本发明较佳实例中通过液相色谱串联质谱测定的蜂王浆中的金雀异黄酮的特征离子质量色谱图（MRM）。其中，图2A表示定性离子/定量离子相对丰度比；图2B表示金雀异黄酮标准溶液（50μg/L）特征离子质量色谱图（MRM）；图2C表示定量离子（270→153.0）质量色谱图；图2D表示定性离子（270→91.0）质量色谱图。
图3A~图3D为本发明较佳实例中通过液相色谱串联质谱测定的蜂王浆中的金雀异黄酮-氘4的特征离子质量色谱图（MRM）。其中，图3A表示定性离子/定量离子相对丰度比；图3B表示金雀异黄酮-氘4标准溶液（50μg/L）特征离子质量色谱图（MRM）；图3C表示定量离子（275→219.0）质量色谱图；图3D表示定性离子（275→154.0）质量色谱图。
图4A为本发明较佳实例中饲喂（豆粕）蜂王浆中特征物金雀异黄酮的一级母离子谱图；图4B为特征物金雀异黄酮的二级子离子谱图。
具体实施方式
本发明提供一种基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法，利用80%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）从蜂王浆样品中提取金雀异黄酮，然后对其进行定性和定量分析，根据不同饲喂方式下蜜蜂所生产的蜂王浆中金雀异黄酮的含量差异来鉴别是否饲喂豆粕饲料。该方法根据饲料中的蛋白质源进行蜂王浆的鉴别，对原有根据饲料中的碳水化合物源进行鉴别的方法进行了补充。
本发明采用如下技术方案：
本发明以蜂王浆为研究对象，采用80%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）提取蜂王浆中的金雀异黄酮，以金雀异黄酮-氘4为内标物质，利用液相色谱-串联质谱法对其进行准确的定性和定量分析，根据分析结果鉴别蜂王浆的饲喂方式。
标准贮备液（1000 µg/mL）的配制：准确称取金雀异黄酮标准品（折合目标化合物1mg），溶于色谱纯甲醇中，定容至1mL得到浓度为1000 µg/mL的标准贮备液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存6个月。内标贮备液（100 µg/mL）的配制：准确称取金雀异黄酮-氘4标准品（折合目标化合物1mg）溶于色谱纯甲醇中，定容至10mL得到浓度为100 µg/mL的内标贮备液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存6个月。标准中间液（10µg/mL）的配制：准确移取标准贮备液100µL，用色谱纯甲醇稀释至10mL，得到浓度为10 µg/mL的标准中间液，该溶液在 -20 ℃冰箱中避光可保存3个月。内标中间液（1µg/mL）的配制：准确移取内标贮备液100µL，用色谱纯甲醇稀释至10mL，得到浓度为1µg/mL的内标中间液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存3个月。标准工作液的配制：取适量10 µg/mL 标准中间液于 10 mL 容量瓶中，加入一定量的内标中间液，用色谱纯甲醇依次稀释定容，配制成以下系列标准工作液：0.5 µg/L、1µg/L、5 µg/L、10 µg/L、20 µg/L、50µg/L，标准工作液中内标物质的含量为10 µg/L。使用前现用现配。
蜂王浆样品前处理方法：称取1g蜂王浆，加入1µg/mL的内标中间液200µL，加入2mL0.1%甲酸-水溶液，涡旋1-5min后加入8mL 0.1%甲酸-乙腈，涡旋5-10min，将混合溶液置于50mL离心管中，4℃下8000r/min离心5-8min；取3mL上清液转移至EMR小柱中，重力作用下自然洗脱流出，收集全部洗脱液。取1mL洗脱液加入装有1mL水的离心管中，充分涡旋混合均匀，过0.2µm滤膜，待上机。
液相色谱-串联质谱条件：流动相为0.1%甲酸-水（A），甲醇（B）；洗脱条件见表1；Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.1×100 mm，2.7 µm），柱温为35℃；流速为0.3mL/min；进样量为5.0 µL；电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描方式；多反应监测（MRM）模式；雾化器温度：290 ℃，雾化器流速：11 L/min，雾化器压力40 psi，毛细管电压：3500 V，鞘流气温度：350 ℃，鞘流气流速：12 L/min。标准物质金雀异黄酮母离子为270.9，定量离子为153.0（碰撞能量为35V），定性离子为91（碰撞能量为45V），驻留时间为3ms，传输电压为380V。内标物质金雀异黄酮-氘4母离子为274.3，定量离子为219.0（碰撞能量为30V），定性离子为154.0（碰撞能量为30V），驻留时间为3ms，传输电压为380V。
具体测定方法如下：
定性测定：根据蜂王浆试样溶液中待测物质的含量，选择峰面积相近的标准工作液和样品溶液等体积参插进样。通过色谱保留时间与质谱选择离子共同定性。样品中待测物质与标准物质的保留时间相对偏差不大于1%，而且其选择离子的相对丰度的差异不大于10%。
定量测定：配制标准物质金雀异黄酮和内标物金雀异黄酮-氘4的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将已知浓度的金雀异黄酮-氘4加入蜂王浆样品中，进样后测得金雀异黄酮和金雀异黄酮-氘4的定量参数，进行计算。标准工作液及试样液中待测物质的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。
结果：标准曲线相关系数大于0.998，金雀异黄酮的回收率范围在61.92-105.83%之间，相对标准偏差小于14.37%，检测限为0.16µg/kg，定量限为0.47µg/kg。
鉴别方法：非饲喂和饲喂蜂王浆样品中金雀异黄酮含量如表2所示，非饲喂蜂王浆样品中均未检出金雀异黄酮，饲喂蜂王浆样品中金雀异黄酮含量为95.7387-278.7793µg/kg。所以可以用金雀异黄酮含量差异鉴别饲喂蜂王浆，含量大于方法定量限（0.47µg/kg）即为饲喂（豆粕）蜂王浆。
本发明中，蜂王浆试样溶液在利用液相色谱-串联质谱仪分析前需使用水稀释，否则产生色谱图不对称导致定量不准确。
液相色谱的流动相中需要加入0.1%甲酸，为待测物提供酸性环境，提供质子，提高离子化效率。
在分析蜂王浆试样溶液过程中，只有含两个子离子，且相对丰度的差异不大于10%。保留时间相对偏差不大于1%情况下才认定含有待测物金雀异黄酮。
市售蜜蜂饲料中金雀异黄酮含量如表3所示。
表3 市售蜜蜂饲料中金雀异黄酮含量
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法
标准贮备液（1000 µg/mL）的配制：准确称取金雀异黄酮标准品（折合目标化合物1mg），溶于色谱纯甲醇中，定容至1mL得到浓度为1000 µg/mL的标准贮备液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存6个月。内标贮备液（100 µg/mL）的配制：准确称取金雀异黄酮-氘4标准品（折合目标化合物1mg）溶于色谱纯甲醇中，定容至10mL得到浓度为100 µg/mL的内标贮备液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存6个月。标准中间液（10µg/mL）的配制：准确移取标准贮备液100µL，用色谱纯甲醇稀释至10mL，得到浓度为10 µg/mL的标准中间液，该溶液在 -20 ℃冰箱中避光可保存3个月。内标中间液（1µg/mL）的配制：准确移取内标贮备液100µL，用色谱纯甲醇稀释至10mL，得到浓度为1µg/mL的内标中间液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存3个月。标准工作液的配制：取适量10 µg/mL 标准中间液于 10 mL 容量瓶中，加入一定量的内标中间液，用色谱纯甲醇依次稀释定容，配制成以下系列标准工作液：0.5 µg/L、1µg/L、5 µg/L、10 µg/L、20 µ/L、50µg/L，使用前现用现配。标准工作液中内标物质的含量为10µg/L。
蜂王浆样品前处理方法：称取1g蜂王浆，加入1µg/mL的内标中间液200µL，加入2mL0.1%甲酸-水溶液，涡旋3min后加入8mL 0.1%甲酸-乙腈，涡旋10min，将混合溶液置于50mL离心管中，4℃下8000r/min离心5min；取3mL上清液转移至EMR小柱中，重力作用下自然洗脱流出，收集全部洗脱液。取1mL洗脱液加入装有1mL水的离心管中，充分涡旋混合均匀，过0.2µm滤膜，待上机。
液相色谱-串联质谱条件：流动相为0.1%甲酸-水（A），甲醇（B）；洗脱条件见表1；Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.1×100 mm，2.7 µm），柱温为35℃；流速为0.3mL/min；进样量为5.0 µL；电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描方式；多反应监测（MRM）模式；雾化器温度：290 ℃，雾化器流速：11 L/min，雾化器压力40 psi，毛细管电压：3500 V，鞘流气温度：350 ℃，鞘流气流速：12 L/min。标准物质金雀异黄酮（4',5,7-三羟基异黄酮）母离子为270.9，定量离子为153.0（碰撞能量为35V），定性离子为91（碰撞能量为45V），驻留时间为3ms，传输电压为380V。内标物质金雀异黄酮-氘4母离子为274.3，定量离子为219.0（碰撞能量为30），定性离子为154.0（碰撞能量为30V），驻留时间为3ms，传输电压为380V。
测定方法：配制标准物质金雀异黄酮和内标物金雀异黄酮-氘4的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将已知浓度的金雀异黄酮-氘4加入蜂王浆样品中，进样后测得金雀异黄酮和金雀异黄酮-氘4的定量参数，进行计算。标准工作液及试样液中待测物质的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。
结果：标准曲线相关系数为0.998，金雀异黄酮的回收率范围在71.23-75.68%之间，相对标准偏差小于2.23%，检测限为0.16µg/kg，定量限为0.47µg/kg。
鉴别方法：选取群势及蜂王年龄基本一致的意大利蜜蜂10箱进行试验，随机分为两组。其中一组饲喂豆粕粉，另一组自行采食花粉。饲喂3天后取样进行检测，其中饲喂（豆粕）蜂王浆中金雀异黄酮含量为43.28-89.18µg/kg，而以天然花粉为蜜粉源的非饲喂样品中均未检出。因此可以用金雀异黄酮含量鉴别饲喂（豆粕）蜂王浆。
实施例2 基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法
标准贮备液（1000 µg/mL）的配制：准确称取金雀异黄酮标准品（折合目标化合物1mg），溶于色谱纯甲醇中，定容至1mL得到浓度为1000 µg/mL的标准贮备液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存6个月。内标贮备液（100 µg/mL）的配制：准确称取金雀异黄酮-氘4标准品（折合目标化合物1mg）溶于色谱纯甲醇中，定容至10mL得到浓度为100 µg/mL的内标贮备液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存6个月。标准中间液（10µg/mL）的配制：准确移取标准贮备液100µL，用色谱纯甲醇稀释至10mL，得到浓度为10 µg/mL的标准中间液，该溶液在 -20 ℃冰箱中避光可保存3个月。内标中间液（1µg/mL）的配制：准确移取内标贮备液100µL，用色谱纯甲醇稀释至10mL，得到浓度为1µg/mL的内标中间液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存3个月。标准工作液的配制：取适量10 µg/mL 标准中间液于 10 mL 容量瓶中，加入一定量的内标中间液，用色谱纯甲醇依次稀释定容，配制成以下系列标准工作液：0.5 µg/L、1µg/L、5 µg/L、10 µg/L、20 µ/L、50µg/L，使用前现用现配。标准工作液中内标物质的含量为10 µg/L。
蜂王浆样品前处理方法：称取1g蜂王浆，加入1µg/mL的内标中间液200µL，加入2mL0.1%甲酸-水溶液，涡旋1min后加入8mL 0.1%甲酸-乙腈，涡旋5min，将混合溶液置于50mL离心管中，4℃下8000r/min离心5min；取3mL上清液转移至EMR小柱中，重力作用下自然洗脱流出，收集全部洗脱液。取1mL洗脱液加入装有1mL水的离心管中，充分涡旋混合均匀，过0.2µm滤膜，待上机。
液相色谱-串联质谱条件：流动相为0.1%甲酸-水（A），甲醇（B）；洗脱条件见表1；Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.1×100 mm，2.7 µm），柱温为35℃；流速为0.3mL/min；进样量为5.0 µL；电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描方式；多反应监测（MRM）模式；雾化器温度：290 ℃，雾化器流速：11 L/min，雾化器压力40 psi，毛细管电压：3500 V，鞘流气温度：350 ℃，鞘流气流速：12 L/min。标准物质金雀异黄酮（4',5,7-三羟基异黄酮）母离子为270.9，定量离子为153.0（碰撞能量为35V），定性离子为91（碰撞能量为45V），驻留时间为3ms，传输电压为380V。内标物质金雀异黄酮-氘4母离子为274.3，定量离子为219.0（碰撞能量为30），定性离子为154.0（碰撞能量为30V），驻留时间为3ms，传输电压为380V。
测定方法：配制标准物质金雀异黄酮和内标物金雀异黄酮-氘4的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将已知浓度的金雀异黄酮-氘4加入蜂王浆样品中，进样后测得金雀异黄酮和金雀异黄酮-氘4的定量参数，进行计算。标准工作液及试样液中待测物质的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。
结果：标准曲线相关系数为0.993，金雀异黄酮的回收率范围在71.23-75.68%之间，相对标准偏差小于2.23%，检测限为0.16µg/kg，定量限为0.47µg/kg。
鉴别方法：选取群势及蜂王年龄基本一致的意大利蜜蜂10箱进行试验，随机分为两组。其中一组饲喂豆粕粉，另一组自行采食花粉。饲喂12天后取样进行检测，其中饲喂（豆粕）蜂王浆中金雀异黄酮含量为89.69-127.51µg/kg，而以天然花粉为蜜粉源的非饲喂样品中均未检出。因此可以用金雀异黄酮含量鉴别饲喂（豆粕）蜂王浆。
实施例3 基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法
标准贮备液（1000 µg/mL）的配制：准确称取金雀异黄酮标准品（折合目标化合物1mg），溶于色谱纯甲醇中，定容至1mL得到浓度为1000 µg/mL的标准贮备液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存6个月。内标贮备液（100 µg/mL）的配制：准确称取金雀异黄酮-氘4标准品（折合目标化合物1mg）溶于色谱纯甲醇中，定容至10mL得到浓度为100 µg/mL的内标贮备液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存6个月。标准中间液（10µg/mL）的配制：准确移取标准贮备液100µL，用色谱纯甲醇稀释至10mL，得到浓度为10 µg/mL的标准中间液，该溶液在 -20 ℃冰箱中避光可保存3个月。内标中间液（1µg/mL）的配制：准确移取内标贮备液100µL，用色谱纯甲醇稀释至10mL，得到浓度为1µg/mL的内标中间液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存3个月。标准工作液的配制：取适量10 µg/mL 标准中间液于 10 mL 容量瓶中，加入一定量的内标中间液，用色谱纯甲醇依次稀释定容，配制成以下系列标准工作液：0.5 µg/L、1µg/L、5 µg/L、10 µg/L、20 µ/L、50µg/L，使用前现用现配。标准工作液中内标物质的含量为10 µg/L。
蜂王浆样品前处理方法：称取1g蜂王浆，加入1µg/mL的内标中间液200µL，加入2mL0.1%甲酸-水溶液，涡旋1min后加入8mL 0.1%甲酸-乙腈，涡旋5min，将混合溶液置于50mL离心管中，4℃下8000r/min离心5min；取3mL上清液转移至EMR小柱中，重力作用下自然洗脱流出，收集全部洗脱液。取1mL洗脱液加入装有1mL水的离心管中，充分涡旋混合均匀，过0.2µm滤膜，待上机。
液相色谱-串联质谱条件：流动相为0.1%甲酸-水（A），甲醇（B）；洗脱条件见表1；Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.1×100 mm，2.7 µm），柱温为35℃；流速为0.3mL/min；进样量为5.0 µL；电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描方式；多反应监测（MRM）模式；雾化器温度：290 ℃，雾化器流速：11 L/min，雾化器压力40 psi，毛细管电压：3500 V，鞘流气温度：350 ℃，鞘流气流速：12 L/min。标准物质金雀异黄酮（4',5,7-三羟基异黄酮）母离子为270.9，定量离子为153.0（碰撞能量为35V），定性离子为91（碰撞能量为45V），驻留时间为3ms，传输电压为380V。内标物质金雀异黄酮-氘4母离子为274.3，定量离子为219.0（碰撞能量为30），定性离子为154.0（碰撞能量为30V），驻留时间为3ms，传输电压为380V。
测定方法：配制标准物质金雀异黄酮和内标物金雀异黄酮-氘4的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将已知浓度的金雀异黄酮-氘4加入蜂王浆样品中，进样后测得金雀异黄酮和金雀异黄酮-氘4的定量参数，进行计算。标准工作液及试样液中待测物质的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。
结果：标准曲线相关系数为0.998，金雀异黄酮的回收率范围在61.92-68.62%之间，相对标准偏差小于3.00%，检测限为0.16µg/kg，定量限为0.47µg/kg。
鉴别方法：选取群势及蜂王年龄基本一致的意大利蜜蜂10箱进行试验，随机分为两组。其中一组饲喂豆粕粉和蔗糖，另一组饲喂天然花粉和蔗糖。饲喂18天后取样进行检测，其中饲喂豆粕粉和蔗糖的蜂王浆中金雀异黄酮含量为95.74-257.99µg/kg，而饲喂天然花粉和蔗糖的样品中均未检出。因此可以用金雀异黄酮含量鉴别饲喂（豆粕）蜂王浆。
实施例4 基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法
标准贮备液（1000 µg/mL）的配制：准确称取金雀异黄酮标准品（折合目标化合物1mg），溶于色谱纯甲醇中，定容至1mL得到浓度为1000 µg/mL的标准贮备液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存6个月。内标贮备液（100 µg/mL）的配制：准确称取金雀异黄酮-氘4标准品（折合目标化合物1mg）溶于色谱纯甲醇中，定容至10mL得到浓度为100 µg/mL的内标贮备液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存6个月。标准中间液（10µg/mL）的配制：准确移取标准贮备液100µL，用色谱纯甲醇稀释至10mL，得到浓度为10 µg/mL的标准中间液，该溶液在 -20 ℃冰箱中避光可保存3个月。内标中间液（1µg/mL）的配制：准确移取内标贮备液100µL，用色谱纯甲醇稀释至10mL，得到浓度为1µg/mL的内标中间液，该溶液在-20℃冰箱中避光可保存3个月。标准工作液的配制：取适量10 µg/mL 标准中间液于 10 mL 容量瓶中，加入一定量的内标中间液，用色谱纯甲醇依次稀释定容，配制成以下系列标准工作液：0.5 µg/L、1µg/L、5 µg/L、10 µg/L、20 µ/L、50µg/L，使用前现用现配。标准工作液中内标物质的含量为10 µg/L。
蜂王浆样品前处理方法：称取1g蜂王浆，加入1µg/mL的内标中间液200µL，加入2mL0.1%甲酸-水溶液，涡旋1min后加入8mL 0.1%甲酸-乙腈，涡旋5min，将混合溶液置于50mL离心管中，4℃下8000r/min离心5min；取3mL上清液转移至EMR小柱中，重力作用下自然洗脱流出，收集全部洗脱液。取1mL洗脱液加入装有1mL水的离心管中，充分涡旋混合均匀，过0.2µm滤膜，待上机。
液相色谱-串联质谱条件：流动相为0.1%甲酸-水（A），甲醇（B）；洗脱条件见表1；Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.1×100 mm，2.7 µm），柱温为35℃；流速为0.3mL/min；进样量为5.0 µL；电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描方式；多反应监测（MRM）模式；雾化器温度：290 ℃，雾化器流速：11 L/min，雾化器压力40 psi，毛细管电压：3500 V，鞘流气温度：350 ℃，鞘流气流速：12 L/min。标准物质金雀异黄酮（4',5,7-三羟基异黄酮）母离子为270.9，定量离子为153.0（碰撞能量为35V），定性离子为91（碰撞能量为45V），驻留时间为3ms，传输电压为380V。内标物质金雀异黄酮-氘4母离子为274.3，定量离子为219.0（碰撞能量为30），定性离子为154.0（碰撞能量为30V），驻留时间为3ms，传输电压为380V。
测定方法：配制标准物质金雀异黄酮和内标物金雀异黄酮-氘4的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将已知浓度的金雀异黄酮-氘4加入蜂王浆样品中，进样后测得金雀异黄酮和金雀异黄酮-氘4的定量参数，进行计算。标准工作液及试样液中待测物质的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。
结果：标准曲线相关系数为0.998，金雀异黄酮的回收率范围在61.92-68.62%之间，相对标准偏差小于3.00%，检测限为0.16µg/kg，定量限为0.47µg/kg。
鉴别方法：选取群势及蜂王年龄基本一致的意大利蜜蜂10箱进行试验，随机分为两组。其中一组饲喂豆粕粉，另一组饲喂蔗糖。饲喂15天后取样进行检测，其中饲喂豆粕粉的蜂王浆中金雀异黄酮含量为131.37-254.77µg/kg，而饲喂蔗糖的样品中均未检出。因此可以用金雀异黄酮含量鉴别饲喂（豆粕）蜂王浆。
实施例5 蜂王浆样品前处理、液相色谱及质谱条件的优化
1、提取阶段的优化
提取溶剂的选择要遵循不与溶质发生反应，不与原来的溶剂互溶或者发生反应，溶质在提取溶剂中的溶解度大于在原溶剂中的溶解度三个原则。本发明对比了70%乙腈-水溶液、80%乙腈-水溶液、70%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）、80%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）四种提取溶剂的提取效果。结果显示，在10μg/L的添加浓度下，使用四种提取溶剂提取金雀异黄酮的回收率分别为36.65%、36.85%、34.55%和62.60%，因此最终选择使用80%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）作为提取溶剂。
2、净化阶段的优化
蜂王浆中含有丰富的蛋白质、脂质和有机酸，对待测物的提取具有干扰作用。本发明选用Agilent公司开发的两种商品化净化包，均购自美国Agilent公司。通过金雀异黄酮的回收率以及回收率的稳定性来对比其净化效果。两种净化包分别为：
a）5982-5158（400 mg PSA（N-丙基乙二胺）+400 mg C18EC+1200 mg MgSO4），去除极性有机酸、某些糖类、多数脂类；
b）5982-1010（EMR），专有的脂质去除吸附剂，创新的吸附剂能够在保留目标分析物的情况下实现脂质去除。
结果显示，两种净化包对10μg/L添加浓度下金雀异黄酮的回收率分别为56.39%和62.60%，因此最终选择5982-1010（EMR）净化包。
3、色谱条件的优化
实验选择了安捷伦Poroshell 120 EC-C18作为液相分离色谱柱。其粒径为2.7 μm，由1.7 μm直径的实心核和0.5 μm厚的多孔外层构成。这种小粒径填料具有与亚2 μm柱类似的高柱效，但柱反压低40%-50%。这种高柱效、高分离度色谱柱可以用于任何类型的液相色谱。多孔层和实心核限制了扩散距离，提高了分离速度，而窄粒径分布提高了柱效和分离度。该柱支持高压，可以采用多柱串联实现最高的分离度和柱效。
流动相的组成不但会影响目标化合物的保留时间、响应值及峰形，还会影响目标化合物的离子化效率和所加和离子的类型。本发明对流动相的组成进行了优化，正模式下，比较了纯水-乙腈，0.1%甲酸水-乙腈和0.1%纯水-甲醇作为流动相时目标化合物的保留和峰形，由于甲酸能够提供丰富的H+，因此在水相中甲酸后，化合物的响应值明显提高，峰形尖锐，且甲醇作为流动相可以有效提高化合物的分离度。因此最终选择0.1%甲酸水-甲醇作为流动相。
4、质谱条件的优化
为了在MRM模式下获得最佳响应值，本实验对驻留时间、气体温度、干燥气体流速、雾化器压力、毛细管电压、鞘气温度、鞘气流量、喷嘴电压和碰撞能量等参数进行了优化。其中，碰撞能量在10-60V之间进行优化，由于最适于各个离子裂解的能量各不相同，因此针对不同离子选择了不同的碰撞能量。
实施例6 标志物金雀异黄酮的确定
为进一步确定差异物，本实验选取了天然蜂王浆和饲喂豆粕粉蜂王浆进行分析。利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用(UHPLC-Q-ExactiveOrbitrap MS)技术进行非靶向小分子活性物质筛查。正模式下，通过比对数据库可获取并确定饲喂（豆粕）蜂王浆的特征标志物除黄豆苷元（Daidzein）外，还有金雀异黄酮（Genistein）。图4A为特征物金雀异黄酮（Genistein）的一级母离子谱图；图4B为特征物金雀异黄酮的二级子离子谱图。
为确认差异物来源，利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用(UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS)技术对豆粕粉饲料成分进行分析。实验结果表明，饲料中含有上述标志物金雀异黄酮（Genistein）。
在对天然蜂王浆和饲喂豆粕粉进行差异成分筛查时，发现差异成分金雀异黄酮（Genistein），金雀异黄酮相较于黄豆苷元含量更高，且在未饲喂蜂王浆中未有检出，相较于黄豆苷元具有更强的特异性和灵敏度。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (5)
1.一种基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法，其特征在于，采用含0.1 v/v%甲酸的80%乙腈水溶液提取蜂王浆样品中的金雀异黄酮，以金雀异黄酮-氘4为内标物质，利用液相色谱串联质谱法对其进行定性和定量分析，根据不同饲喂方式下蜜蜂所生产的蜂王浆中金雀异黄酮的含量差异来鉴别是否给蜜蜂饲喂了豆粉饲料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.标准溶液配制：用甲醇配制以下系列的含内标物质的金雀异黄酮标准工作液：0.5µg/L、1 µg/L、5 µg/L、10 µg/L、20 µg/L、50µg/L；标准工作液中内标物质的含量为10µg/L；
S2.供试品溶液制备：取1g蜂王浆，加入1µg/mL的内标中间液200µL，加入2mL 0.1 v/v%甲酸水溶液，涡旋1-5min后加入8mL含0.1% v/v甲酸的乙腈，涡旋5-10min，将混合溶液置于50mL离心管中，4℃下8000r/min离心5-8min；取3mL上清液转移至EMR过滤柱中，重力作用下自然洗脱流出，收集全部洗脱液；取1mL洗脱液加入装有1mL水的离心管中，充分涡旋混合均匀，过0.2µm滤膜，得到供试品溶液；
S3.液相色谱串联质谱检测：取系列金雀异黄酮标准工作液、供试品溶液分别进样，以色谱峰面积为纵坐标，以系列金雀异黄酮标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线，用标准曲线对样品进行定量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，液相色谱串联质谱的检测条件为：
液相色谱条件如下：流动相A为0.1v/v%甲酸水溶液，流动相B为甲醇；洗脱条件见表1；Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱，2.1 mm×100 mm，2.7 µm，柱温为35℃；流速为0.3mL/min；进样量为5.0 µL；
表1 液相梯度洗脱表
；
质谱条件如下：电喷雾离子源；正离子扫描方式；多反应监测模式；雾化器温度290℃，雾化器流速11 L/min，雾化器压力40 psi，毛细管电压3500 V，鞘流气温度350℃，鞘流气流速12 L/min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，质谱检测的金雀异黄酮的母离子为270.9，定量离子为153.0，定性离子为91。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，金雀异黄酮的回收率为61.92-105.83%，检测限为0.16µg/kg，定量限为0.47µg/kg。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant |