CN111999410A

CN111999410A - 一种同时测定瓜蒌药材中核苷和黄酮类成分的方法及其应用

Info

Publication number: CN111999410A
Application number: CN202010896929.2A
Authority: CN
Inventors: 赵恒强; 崔莉; 闫慧娇; 张敏敏; 王岱杰; 赵志国; 王晓
Original assignee: Shandong Analysis and Test Center
Current assignee: Shandong Analysis and Test Center
Priority date: 2020-08-31
Filing date: 2020-08-31
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2040-08-31
Also published as: CN111999410B

Abstract

本发明提供一种同时测定瓜蒌药材中核苷和黄酮类成分的方法及其应用，属于检测分析技术领域。本发明成功建立了一种超声辅助提取结合ZIC‑HILIC‑DAD技术同时定性、定量测定瓜蒌中核苷和黄酮类成分的方法。该方法快速、简便，可以实现瓜蒌中核苷和黄酮类成分的同时测定。含量测定结果表明，山东和河北产区的瓜蒌中两类成分含量存在一定差异，其中山东产区瓜蒌中核苷类成分含量明显高于河北产区。结合主成分分析和系统聚类分析实现了两个产区的样本的整体区分。研究结果为保障瓜蒌药材种植、加工的质量控制水平提供了分析方法支持，因此上述技术方案具有良好的实际应用之价值。

Description

一种同时测定瓜蒌药材中核苷和黄酮类成分的方法及其应用

技术领域

本发明属于检测分析技术领域，具体涉及一种同时测定瓜蒌药材中核苷和黄酮类成分的方法及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

瓜蒌为葫芦科植物栝楼Trichmanthes kiriloxvii Maxim.或双边栝楼Trichosanthes rosthornii Harms的干燥成熟果实。其性甘，味微苦寒，具有清热涤痰，宽胸散结，润燥滑肠的作用，中医临床常用于治疗肺热咳嗽，痰浊黄稠，胸痹心痛，结胸痞满，乳痈，肺痈，肠痈，大便秘结等疾病。作为常用中药，瓜蒌在临床应用中需求量较大。我国瓜蒌种植面积广泛，主要集中在中国北部，如山东，河南，河北等地。山东产瓜蒌历史悠久，东晋郭璞注解《诗经》时即已指出：“今齐人呼之为天瓜”,另据山东地方县志记载瓜蒌在山东的种植历史已有一百多年，是瓜蒌的道地产区。河北目前也是瓜蒌的一个重要产区，全国药材市场流通的瓜蒌药材很大一部分产自河北。

现代研究表明，瓜蒌中含有核苷，饱和脂肪醇，类黄酮，多糖，氨基酸等多种化学成分。其中，核苷化合物被证明具有抗血小板聚集，抗心律不齐，免疫调节，抗肿瘤，抗氧化剂等多种生物学活性。黄酮类化合物在扩张冠状动脉、抗氧化、抗炎、抗菌和抗肿瘤，等多方面起重要作用。因此核苷类和黄酮类化合物是许多中药饮片的重要指标成分。发明人发现，目前，《中国药典》对瓜蒌的质量控制仅针对瓜蒌籽中3,29-二苯甲酰基桔楼仁三醇的含量进行测定，不能全面反应瓜蒌药材的整体质量。瓜蒌药材的现有含量测定研究多集中在某一类成分，同时针对瓜蒌中核苷类和黄酮类这两类重要生物活性成分的检测研究少有报道。因此，开展瓜蒌中的核苷类和黄酮类化合物的同时快速分析方法研究，对全面地评价瓜蒌药材的质量，确保瓜蒌药材市场流通和临床应用的质量监管具有重要意义。

发明内容

为了克服上述技术问题，本发明提供一种同时测定瓜蒌药材中核苷和黄酮类成分的方法及其应用，本发明利用ZIC-HILIC-DAD技术同时测定瓜蒌中9种化学成分(2'-脱氧腺苷，腺苷，腺嘌呤，尿苷，胞嘧啶，胞嘧啶核苷，木犀草苷，异槲皮苷和芦丁)，并结合化学计量学方法对来自山东和河北两个重要产区的瓜蒌样本进行多指标定量测定和质量评价，本发明研究结果为瓜蒌药材质量标准提提供了方法和技术支持，因此具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种同时测定瓜蒌药材中核苷和黄酮类成分的方法，所述核苷成分为2'-脱氧腺苷、腺苷、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶和胞嘧啶核苷，所述黄酮类成分为木犀草苷、异槲皮苷和芦丁，所述方法包括：采用超声提取法同时提取瓜蒌中核苷类和黄酮类成分，然后基于HILIC-DAD和/或HILIC-ESI-MS进行检测分析。

所述方法还包括对通过上述方法获得的9种化合物含量测定结果进行统计分析。

所述统计分析方法包括但不限于化学成分对比分析、PCA分析和CA分析。

本发明的第二个方面，提供上述方法在如下任意一种或多种中的应用：

1)瓜蒌药材产地溯源；

2)瓜蒌药材的质量控制；

3)瓜蒌药材的品质评价；

4)瓜蒌药材的鉴定。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：

上述技术方案成功建立了一种超声辅助提取结合ZIC-HILIC-DAD技术同时定性、定量测定瓜蒌中核苷和黄酮类成分的方法。该方法快速、简便，可以实现瓜蒌中核苷和黄酮类成分的同时测定。

含量测定结果表明，山东和河北产区的瓜蒌中两类成分含量存在一定差异，其中山东产区瓜蒌中核苷类成分含量明显高于河北产区。结合主成分分析和系统聚类分析实现了两个产区的样本的正确区分。研究结果为保障瓜蒌药材种植、加工的质量控制水平提供了分析方法支持，因此上述技术方案具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中瓜蒌样本中所含化合物标准品和瓜蒌样品的HILIC图谱；其中，A为瓜蒌样本中所含化合物标准品；B为瓜蒌样品的HILIC图谱；(1.2-脱氧腺苷；2.腺苷；3.腺嘌呤；4.尿苷；5.胞嘧啶；6.木犀草苷；7.胞苷；8.异槲皮苷；9.芦丁)；

图2为本发明实施例中山东和河北两个产区瓜蒌不同成分的箱线图；

图3为本发明实施例中瓜蒌样本的PCA三维图谱；

图4为本发明实施例中瓜蒌样本的CA图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，目前，《中国药典》对瓜蒌的质量控制仅针对瓜蒌籽中3,29-二苯甲酰基桔楼仁三醇的含量进行测定，不能全面反应瓜蒌药材的整体质量。瓜蒌药材的现有含量测定研究多集中在某一类成分，同时针对瓜蒌中核苷类和黄酮类这两类重要生物活性成分的检测研究少有报道。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种同时测定瓜蒌药材中核苷和黄酮类成分的方法，所述核苷成分为2'-脱氧腺苷、腺苷、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶和胞嘧啶核苷，所述黄酮类成分为木犀草苷、异槲皮苷和芦丁，其结构式见下：

本发明的又一具体实施方式中，所述方法包括：采用超声提取法同时提取瓜蒌中核苷类和黄酮类成分，然后基于HILIC-DAD和/或HILIC-ESI-MS进行检测分析。

本发明的又一具体实施方式中，所述“采用超声提取法同时提取瓜蒌中核苷类和黄酮类成分”步骤具体方法包括：

将瓜蒌粉粹过筛后加入有机溶剂进行超声提取，过滤干燥后加入复溶溶剂复溶后即得待测液。

其中，粉碎过筛目数为50～80目，优选为60目；

有机溶剂可以是甲醇或乙腈，优选为甲醇；进一步优选为80％甲醇；

所述超声提取具体方法为：在40～50℃条件下超声提取30～50min，优选为45℃超声提取40min。超声波提取法具有装置简单，提取时间短和提取率高等优点，适用于瓜蒌中多个成分的同时提取。瓜蒌中成分复杂多样，不同类别化合物所需的提取溶剂不同，本发明通过筛选优化相关工艺参数，从而获得上述最适提取条件。

瓜蒌粉末与有机溶剂的质量体积比为1g：80～120mL，优选为1g：100mL。

所述复溶溶剂为乙腈、甲醇和水的混合物；优选的，所述乙腈、甲醇和水的体积比为7～10：1～4：2～5，优选为9：3：4。复溶溶剂是供试品制备过程中的重要影响因素。根据瓜蒌中成分的特性和亲水色谱柱的特性，本发明经过试验证明，乙腈、甲醇和水(9：3：4，v/v/v)为复溶溶剂时可以保留最大量的目标成分。

瓜蒌粉末与复溶溶剂的质量体积比为1g：3～8mL，优选为1g：5mL。

其中，HILIC-DAD检测具体方法包括：

HILIC色谱柱，150×2.1mm，3.5μm；流动相：A：乙腈/水(30：70)，B：乙腈；梯度洗脱；流速：0.4mL/min；柱温：20～40℃，优选为35℃，选择35℃的柱温时，各色谱峰分离度高、对称性较好；进样量：5.0μL；梯度洗脱。

由于流动相的pH和离子强度也会影响亲水柱中目标化合物的保留性和选择性，本发明研究了向流动相A中添加不同浓度乙酸和乙酸铵(0.2％乙酸，0.4％乙酸，0.6％乙酸和10mM乙酸铵，20mM乙酸铵)对色谱分离的改善作用，发现0.2％乙酸和10mM的乙酸铵可以较好地改善色谱分离峰型，同时适中的缓冲盐浓度可以减小对仪器系统的影响。因此，本发明的又一具体实施方式中，所述流动相A中还含有乙酸和乙酸铵；其中，乙酸含量为0.2％～0.6％，优选为0.2％；乙酸铵浓度为10～20mM；优选为10mM。

具体的，所述梯度洗脱程序：0-15min,97-95％B；15-30min,95-90％B；30-35min,90-87％B；35-40min,87-86.5％B。

检测波长：260nm。

HILIC-ESI-MS定性分析具体方法包括：

液相分析条件同HILIC-DAD检测；

质谱条件为：干燥气温度：250℃；干燥气流速：8.0L/min；毛细管电压：3500V。扫描范围：50-1500m/z。

本发明的又一具体实施方式中，所述方法还包括对通过上述方法获得的9种化合物含量测定结果进行统计分析。

本发明的又一具体实施方式中，所述统计分析方法包括但不限于化学成分对比分析、PCA分析和CA分析。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法在如下任意一种或多种中的应用：

1)瓜蒌药材产地溯源；

2)瓜蒌药材的质量控制；

3)瓜蒌药材的品质评价；

4)瓜蒌药材的鉴定。

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明。以下各实施例中所用的原料都可通过商购获得，所用的设备均为现有设备。

实施例

1.仪器与试剂

1.1仪器

1.2材料与试剂

标准对照品2-脱氧腺苷(批号：1090580，阿拉丁)，腺苷(批号：F20110315，国药集团)，腺嘌呤(批号：65000160，国药集团)，尿苷(批号：65012581，国药集团)，胞嘧啶(批号：LJ0127B5010J，BIO BASIC INC.)和胞苷(批号：MM0316YA12，源叶生物)，木犀草苷(批号：MUST-15071711，曼思特生物)，异槲皮苷(批号：MUST-11121801，曼思特生物)和芦丁(批号：Y06J8S37439，源叶生物)；色谱纯乙腈和甲醇购于德国默克公司(达姆施塔特，德国)；超纯水通过Millipore Milli Q-Plus系统自制(马萨诸塞州，美国).

十二批瓜蒌样本均购于济南各大药房(其中，六批产地为河北(H1～H6)，L另外六批产地为山东(S1～S6))，由山东省分析测试中心王晓研究员鉴定为葫芦科植物栝楼Trichmanthes kiriloxvii Maxim.或双边栝楼Trichosanthes rosthornii Harms的干燥成熟果实。

精密称定标准对照品2-脱氧腺苷，腺苷，腺嘌呤，尿苷，胞嘧啶，胞苷，木犀草苷，异槲皮苷和芦丁1.0mg置于1.0mL容量瓶中，用乙腈，甲醇和水(9：3：4，v/v/v)定容后过0.22μM滤膜备用。

2方法与结果

2.1待测样制备

将瓜蒌样本粉碎后过60目筛备用，精密称定瓜蒌粉末1.0g，置于具塞锥形瓶中，加入100mL 80％甲醇45℃下超声提取40min。过滤后将滤液低温旋蒸至干，加入5.0mL复溶溶剂(乙腈，甲醇和水(9：3：4，v/v/v))超声复溶后过0.22μM滤膜备用。

2.2HILIC-DAD检测

赛默飞U3000双三元液相色谱系统，默克

HILIC色谱柱(150×2.1mm,3.5μm)用于本研究的目标物的分析检测。流动相：A：乙腈/水(30：70，含0.2％乙酸和10mM乙酸铵)，B:乙腈。梯度洗脱程序：0-15min,97-95％B；15-30min,95-90％B；30-35min,90-87％B；35-40min,87-86.5％B；流速：0.4mL/min；柱温：35℃，进样量：5.0μL,检测波长：260nm。将混合标准品溶液和样品提取液按以上液相条件进样分析，得到图1。

2.3HILIC-ESI-MS定性分析

安捷伦G6320离子肼质谱仪联合安捷伦1260HPLC系统和默克

HILIC色谱柱(150×2.1mm,3.5μm)用于瓜蒌样本中各化合物的质谱鉴定。液相分析条件同2.3中液相条件。质谱条件：干燥气温度：250℃；干燥气流速：8.0L/min；毛细管电压：3500V。扫描范围：50-1500m/z。

按照以上液质方法进样分析，得到瓜蒌样本的液质分析结果，见表2。

表2瓜蒌中所含核苷类和黄酮类化合物

2.4线性关系

2.4.1标准曲线

将标准对照品储备液稀释成六个不同的浓度按照2.3中液相条件进样分析。以对照品样品浓度(μg/mL)为横坐标，各化合物峰面积为纵坐标建立9个化合物的标准曲线。

2.4.2检出限与定量限

将各标准品溶液稀释后进样分析，检出限(LOD)为3倍信噪比(S/N)，定量限(LOQ)为10倍信噪比，结果见表3。

表3瓜蒌中各化合物的线性关系，检出限与定量限

2.5方法学考察

2.5.1重复性实验

将6份瓜蒌样本按照2.2中样本处理方法处理后按照2.3中样本HPLC条件进样分析，计算各化合物的峰面积的相对标准偏差(RSD)值即为重复性值。计算结果显示2-脱氧腺苷，腺苷，腺嘌呤，尿苷，胞嘧啶，胞苷，木犀草苷，异槲皮苷和芦丁峰面积的RSD值分别为：1.89％，0.92％，1.01％，1.95％，2.38％，2.15％，1.74％，2.08％，1.66％，表明该方法重复性良好。

2.5.2精密度实验

选取其中一个待测样本按照2.3中液相条件连续进样6次，计算各化合物的峰面积的相对标准偏差(RSD)值即为精密度。计算结果显示2-脱氧腺苷，腺苷，腺嘌呤，尿苷，胞嘧啶，胞苷，木犀草苷，异槲皮苷和芦丁峰面积的RSD值分别为：0.69％，0.82％，0.59％，0.52％，0.85％，0.77％，1.04％，0.61％和0.88％，表明仪器精密度良好。

2.5.3稳定性实验

将同一待测样本按照0h，2h，4h，8h，16h和24h进样分析，计算各化合物的峰面积的相对标准偏差(RSD)，计算结果显示2-脱氧腺苷，腺苷，腺嘌呤，尿苷，胞嘧啶，胞苷，木犀草苷，异槲皮苷和芦丁峰面积的RSD值分别为：2.13％，2.01％，1.63％，1.29％，1.52％，1.91％，2.32％，1.94％和1.66％，表明样品在24h内稳定性良好。

2.5.4加标回收率

精密称取适量标准对照品加入到瓜蒌样品中，按照2.1中样品处理方法处理后进样分析，测定各化合物含量计算各化合物的加标回收率分别为2-脱氧腺苷98.13％，腺苷102.03％，腺嘌呤101.27％，尿苷98.69％，胞嘧啶102.68％，胞苷102.01％，木犀草苷96.13％，异槲皮苷97.28％和芦丁98.21％，各化合物加标回收率均在95％-105％之间，符合要求。

2.6含量测定

将分别来自山东和河北的12批瓜蒌样本处理后，进样分析。记录样本中各化合物的峰面积，按照2.5中标准曲线计算可得各样本中所测化合物的含量，结果见表4。

表4山东，河北两个重要产区产瓜蒌中6个核苷类化合物，3个黄酮类化合物的含量

表4中可以看出，核苷类化合物的含量主要以2-脱氧腺苷，腺嘌呤和尿苷三种为主约占六种核苷类化合物总量的77.5％，黄酮类化合物则以芦丁含量为主，约占三种黄酮类化合物总量的76.9％。河北和山东产区瓜蒌中所含化合物的含量存在一定差异。其中，山东产区瓜蒌中所含核苷类化合物明显高于河北产瓜蒌。

3讨论

3.1提取条件优化

超声波提取法具有装置简单，提取时间短和提取率高等优点，适用于瓜蒌中多个成分的同时提取。瓜蒌中成分复杂多样，不同类别化合物所需的提取溶剂不同，为了获得最佳的提取效率，本研究对提取取条件包括萃取溶剂(100％，80％和60％甲醇/水(v/v))，料液比(1：50、1：100、1：150)，提取时间(30min，40min，50min)进行优化。结果表明，料液比为1：100时以80％甲醇超声提取40min为最适提取条件。

复溶溶剂是供试品制备过程中的重要影响因素。根据瓜蒌中成分的特性和亲水色谱柱的特性，本研究对比了乙腈，甲醇和水(9：3：4，v/v/v)，乙腈和水(75：25，v/v)，乙腈和甲醇(75：25，v/v)以及甲醇和水(75：25，v/v)等不同的复溶溶剂配比，结果表明，乙腈，甲醇和水(9：3：4，v/v/v)为复溶溶剂时可以保留最大量的目标成分。

3.2HILIC色谱条件优化

色谱柱是液相条件优化中的首要环节，选择合适的色谱柱对样本中目标化合物的分离具有较大的影响。本研究中，分别考察了三根不同的反相色谱柱(ZORBAX SB-C₁₈(4.6×250mm,5μm)柱,Agilent Eclipse XDB-C₁₈(4.6×250mm,5μm)和Waters XBridge^TM C₁₈(2.1×150mm,3.5μm))和两根不同的亲水色谱柱(Merck

HILIC(150×2.1mm I.D.,3.5μm)色谱柱和Waters Xbridge^TM HILIC(150×2.1mm I.D.,3.5μm))色谱柱对分离效果的影响。结果表明，两根亲水色谱柱对目标化合物的分离效果均好于反相色谱柱，其中Merck

HILIC(150×2.1mm I.D.,3.5μm)色谱柱的色谱分离效果较好，峰型较为尖锐，因此选择该色谱柱用于瓜蒌中目标化合物的色谱分离。

流动相作为色谱分离中的重要因素对目标化合物的分离具有重要作用。本研究中，研究了不同比例乙腈水体系对目标物的分离效果。结果表明当30％乙腈-水体系为流动相A，以乙腈为流动相B时对瓜蒌提取物中各成分分离效果较好。流动相的pH和离子强度也会影响亲水柱中目标化合物的保留性和选择性。本研究考察了添加不同浓度乙酸和乙酸铵(0.2％乙酸，0.4％乙酸，0.6％乙酸和10mM乙酸铵，20mM乙酸铵)对色谱分离的改善作用，发现0.2％乙酸和10mM的乙酸铵可以较好地改善色谱分离峰型，同时适中的缓冲盐浓度可以减小对仪器系统的影响。

色谱柱柱温是色谱分离过程中的又一重要因素，尤其是对亲水色谱柱的分离效果影响较大。本研究依次对比了5个不同的柱温(20℃,25℃,30℃,35℃,40℃)对色谱分离的影响，结果显示,选择35℃的柱温时，各色谱峰分离度高、对称性较好。

3.3不同产地瓜蒌药材的区分

利用SPSS数据分析系统等数据分析软件以不同瓜蒌样本中9个化合物的含量测定结果对样本进行含量对比分析，PCA和CA分析，以综合评析这两个重要产区瓜蒌的差异性。3.3.1山东、河北产区瓜蒌化学成分对比分析

对两个产区的瓜蒌样本中含有的多个化学成分进行含量测定，以测定结果为依据进行不同产地对比分析。表4中结果表明同一瓜蒌样本中不同化合物的含量差距较大即各个特征值数量级差异较大，因此同时用这些含量测定结果对不同样本进行综合对比分析时会使较小的数被淹没导致结果偏差较大。本研究引入P值分析，可以更好的评价各个产区样本所含化合物间的质量波动并保证结果不受各个特征值之间差异较大的影响。参数P值的计算方法如下：P＝W/W_AVE，其中W代表各成分含量，W_AVE代表同一产区各成分含量均值。P值越小，代表数据波动越小，即同一产区内样品质量稳定性越好。经过箱线图处理后波动范围在0.75(下四分位数)-1.25(上四分位数)之间均可视为正常。分别对两个产区样本进行分析，结果见图2。由图2可知，各个化合物含量在不同样本之间虽有波动，但均处于合理范围之内说明各个样本的质量稳定性均合理。两个产区对比发现，山东产区样本中各个化合物的含量波动较河北产区大，说明研究所用山东产瓜蒌样本间质量差异较大。

3.3.2PCA分析

通过SPSS数据处理系统对山东，河北的12个瓜蒌样本中的9个成分进行PCA处理，以此为依据对两个瓜蒌重要产区的瓜蒌药材经行综合评析。因子分析结果见表5，表明，第一，二，三主成分的特征值均大于1，前三主成分累积方差值为79.953％满足主成分分析条件，以三个主成分为参数可以得到所有样本的PCA图谱，见图3。由图3可以看出，河北瓜蒌(H)和山东瓜蒌(S)之间可以明显的区分，河北瓜蒌的聚集性要强于山东瓜蒌。

根据瓜蒌主成分矩阵结果，建立瓜蒌质量评价模型，线性关系如下：

X₁＝0.193H₁+0.197H₂+0.122H₃+0.198H₄-0.041H₅+0.185H₆+0.084H₇+0.177H₈+0.124H₉；

X₂＝-0.038H₁-0.006H₂-0.030H₃-0.120H₄+0.576H₅+0.098H₆+0.537H₇-0.157H₈+0.195H₉；

X₃＝-0.117H₁-0.227H₂+0.605H₃+0.137H₄-0.248H₅-0.279H₆+0.166H₇-0.274H₈+0.343H₉

X₁，X₂，X₃表示三个主成分，H₁……H₉表示准化后变量。每个样本的综合评价得分公式为X_综合得分＝(50.582X₁+15.647X₂+13.724X₃)/79.953。按照以上公式计算每个样本的综合评价得分分别为：河北样本H1(-0.92)，H2(-0.61)，H3(-0.50)，H4(-0.64)，H5(-0.38)，H6(-0.26)；山东样本S1(0.74)，S2(0.49)，S3(0.13)，S4(-0.16)，S5(1.18)，S6(0.93)。通过综合评价得分对比可以看出山东瓜蒌样本的综合评分均高于河北瓜蒌，但是山东瓜蒌样本评分差异较大即质量波动较大，河北瓜蒌样本评分差异较小即质量波动较小。

表5主成分特征值

3.3.3CA分析

系统聚类分析可以明显的区分各个样本间的相似关系，利用数据处理系统对12个样本进行系统聚类分析，见图4。由图4可以看出河北瓜蒌的六个样本和山东瓜蒌的6个样本分别先交汇后再呈交汇状态。河北瓜蒌样本间的距离较短说明河北样本间的相似性较大，山东瓜蒌样本间的距离较河北瓜蒌样本的较长说明山东样本间的相似性较小。以上得出的分析结果与PCA分析结果一致，说明这两种方式均能较好地实现不同来源瓜蒌的质量评析。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.提供一种同时测定瓜蒌药材中核苷和黄酮类成分的方法，所述核苷成分为2'-脱氧腺苷、腺苷、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶和胞嘧啶核苷，所述黄酮类成分为木犀草苷、异槲皮苷和芦丁，其特征在于，所述方法包括：采用超声提取法同时提取瓜蒌中核苷类和黄酮类成分，然后基于HILIC-DAD和/或HILIC-ESI-MS进行检测分析。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述“采用超声提取法同时提取瓜蒌中核苷类和黄酮类成分”步骤具体方法包括：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，粉碎过筛目数为50～80目，优选为60目；

有机溶剂是甲醇或乙腈，优选为甲醇；进一步优选为80％甲醇。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述超声提取具体方法为：在40～50℃条件下超声提取30～50min，优选为45℃超声提取40min；

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述复溶溶剂为乙腈、甲醇和水的混合物；优选的，所述乙腈、甲醇和水的体积比为7～10：1～4：2～5，优选为9：3：4；

优选的，瓜蒌粉末与复溶溶剂的质量体积比为1g：3～8mL；优选为1g：5mL。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，HILIC-DAD检测具体方法包括：

HILIC色谱柱，150×2.1mm，3.5μm；流动相：A：乙腈/水(30：70)，B：乙腈；梯度洗脱；流速：0.4mL/min；柱温：20～40℃，优选为35℃；进样量：5.0μL；梯度洗脱；

优选的，所述流动相A中还含有乙酸和乙酸铵；进一步优选的，乙酸含量为0.2％～0.6％，优选为0.2％；乙酸铵浓度为10～20mM；优选为10mM。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序：0-15min,97-95％B；15-30min,95-90％B；30-35min,90-87％B；35-40min,87-86.5％B；或，

检测波长：260nm。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，HILIC-ESI-MS定性分析具体方法包括：

优选的，所述流动相A中还含有乙酸和乙酸铵；进一步优选的，乙酸含量为0.2％～0.6％，优选为0.2％；乙酸铵浓度为10～20mM；优选为10mM；

优选的，所述梯度洗脱程序：0-15min,97-95％B；15-30min,95-90％B；30-35min,90-87％B；35-40min,87-86.5％B；

质谱条件为：干燥气温度：250℃；干燥气流速：8.0L/min；毛细管电压：3500V；扫描范围：50-1500m/z。

9.如权利要求1-8任一项所述方法，其特征在于，还包括对所述方法获得的9种化合物含量测定结果进行统计分析；

优选的，所述统计分析方法包括但不限于化学成分对比分析、PCA分析和CA分析。

10.权利要求1-9任一项所述方法在如下任意一种或多种中的应用：

1)瓜蒌药材产地溯源；

2)瓜蒌药材的质量控制；

3)瓜蒌药材的品质评价；

4)瓜蒌药材的鉴定。