CN113009015A - 一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法。该包括如下步骤：步骤一、抗氧化活性成分提取采用恒温振荡‑超声有机溶剂提取联合固相萃取；步骤二、将步骤一得到的样品提取液采用HPLC进行检测，检测条件如下：色谱柱为Dikma ODS C18色谱柱；柱温30‑40℃；流动相A/B：流动相A为0.02％‑0.05％乙酸铵，其中流动相A中含有0.1％‑0.2％抗氧剂，流动相B为乙腈；洗脱方式为梯度洗脱。本发明提供的方法对18种抗氧化活性成分在0.5μg/mL‑50.0μg/mL质量浓度范围内呈现良好线性关系，R2≥0.9996；具有优异的可靠性和精确度。

Description

一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法。
背景技术
天然抗氧化活性物质能够有效清除人体自由基、延缓衰老。有关自由基生命科学的大量研究证实：自由基作用影响人类生理性衰老和某些病理过程，自由基脂质过氧化作用与自由基清除剂活性同机体衰老程度密切相关。要降低自由基对人体的危害，除了依靠体内自由基清除系统外，还要寻找和发掘外源性自由基清除剂，利用清除剂与自由基结合，以阻断外界自由基攻击，保护人体免受伤害。通过合理服用抗氧化剂，可有效预防人体因氧化失衡而引起的各种疾病如癌症、心脏病、过早衰老和老年痴呆症等。
植物类食品和中药材中广泛存在丰富的天然抗氧化成分，食品中常见天然抗氧化成分主要为胡萝卜素、类胡萝卜素和多酚等，如β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、玉米黄素、虾青素等；中药材抗氧化成分主要为多酚，包括黄酮(如木犀草素、芹菜素)、黄烷酮(二氢黄酮，如橙皮素、柚皮素)、黄酮醇(如槲皮素、山奈酚、杨梅素)等。从自然界中寻找安全、高效、廉价、低毒的天然抗氧化剂是目前中药食品领域抗氧化产业的发展趋势。研究植物类天然抗氧化活性成分有效提取与含量检测，为发现可能含有抗氧化成分的物质并合理选择研制天然抗氧化剂及其配方提供了科学思路，对新型功能性抗氧化剂的利用和开发具有重要意义，对人类健康和延缓衰老提供新的线索和希望。
但是由于天然抗氧化活性成分易受环境介质影响，尤其是多数类胡萝卜素在光、氧、热等因素下不稳定，给样品前处理和上机分析测定造成困难。且大多数有关HPLC等仪器测定方法仅仅用于分析单一或少数几种抗氧化活性成分，而针对食品和中药材中抗氧化活性成分的多组分测定的相关文献和专利报道，尤其是针对植物中的类胡萝卜素、多酚类、黄酮类、异黄酮类等天然抗氧化活性成分的快速高效提取、批量精准筛选和同时在线检测方法则鲜有报道。因此，亟需开发适用于食品和中药材的高效快速前处理方法和高通量多组分同时在线测定技术。
在提取方法上，目前常见的有溶剂提取法(Solvent extraction,SE)，超声波提取法(Ultrasonic extraction,UE)，微波提取法(Microwave extraction,MAE)，超临界流体提取法(Supercritical fluid extraction,SFE)，加速溶剂提取法(Accelerated solventextraction,ASE)等等。但MAE法多适于多糖类、皂苷类和生物碱类的提取，SFE和ASE自动化程度高、对仪器设备要求高、温度压力条件苛刻；SE和UE凭借其设备简单、操作简便、适用性广、分离性强等特点而较常在实验室中使用。在仪器检测上，目前常见的是紫外可见分光光度法(Ultraviolet-visible spectrophotometry,UV-Vis)，气相色谱法(Gaschromatography,GC)，高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)等仪器检测技术，但是UV-Vis一般测定某一成分的顺反异构体总含量，无法实现分离检测，GC不能用于热不稳定成分分析，只能分析挥发性抗氧化物质；HPLC则可以实现对几乎所有物质的不同同系物或者同一类物质不同同分异构体的有效分离测定，很大程度上优于UV-Vis和GC等检测方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明旨在提供本发明利用一种恒温振荡-超声有机溶剂提取联合HPLC在线测定技术。该方法可以实现对食品(番茄、苹果等)及中药材(山楂、枸杞等)共计30种植物中18种天然抗氧化活性成分的提取与HPLC同时在线检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，其包括如下步骤：
步骤一、抗氧化活性成分提取
采用恒温振荡-超声有机溶剂提取联合固相萃取；
步骤二、将步骤一得到的样品提取液采用HPLC进行检测，检测条件如下：
色谱柱为Dikma ODS C18色谱柱；
柱温30-40℃；
流动相A/B：流动相A为0.02％-0.05％乙酸铵，其中流动相A中含有0.1％-0.2％抗氧剂，流动相B为乙腈；
洗脱方式为梯度洗脱；
所述样品选自如下物质中的一种：
食品：番茄、胡萝卜、草莓、苹果、洋葱、黄瓜、蛋黄、南瓜、芹菜、西蓝花、莴笋、豇豆；
中药材：山楂、枸杞，红花、陈皮、金银花、桑叶、槐米、垂盆草、侧柏叶、金钱草、槐花、山奈、盐杜仲、地锦草、枳椇子、蒲黄、怀菊花、蜂花粉；
所述抗氧活性物质为如下成分中的一种或多种：
胡萝卜素和类胡萝卜素类：β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、玉米黄素、角黄素、漆黄素、藏红花素；
多酚黄酮类：山奈酚、圣草酚、橙皮素、木犀草素、芹菜素、金合欢素、二氢杨梅素、杨梅素、槲皮素、异鼠李素、异槲皮素。
优选地，步骤一抗氧化活性成分提取步骤包括如下操作：
(1)将经粉碎的样品均质后加入有机溶剂恒温提取；
(2)加入氯化钠、硫酸镁、硫酸钠的至少两种的混合物，离心后提取有机相；
(3)过滤膜净化后进样。
优选地，步骤二中梯度洗脱的程序为：流动相A/B，0-5min：A/B＝5％/95％；5-10min：A/B＝10％-90％；10-20min：A/B＝30％/70％；20-30min：A/B＝50％/50％；30-40min：A/B＝80％/20％；40-50min：A/B＝5％/95％。
进一步优选地，所述样品为食品，步骤一的抗氧化活性成分提取步骤包括如下操作：
(1)将经粉碎的样品均质后加入抗氧化剂，然后加入有机溶剂避光恒温提取；
(2)加入氯化钠、硫酸镁的至少两种的混合物，离心后提取有机相；
(3)浓缩，溶剂稀释定容，过滤膜净化后进样。
进一步优选地，所述样品为食品，步骤(1)的有机溶剂为丙酮-乙酸乙酯-石油醚的混合溶剂，三者的体积比为1:3:1-1:4:2。
进一步优选地，所述样品为食品，步骤(1)中抗氧化剂为BHT、BHA和TBHQ中的一种或多种。
进一步优选地，所述样品为中药材，步骤一的抗氧化活性成分提取步骤包括如下操作：
(1)将经粉碎的样品均质后加入有机溶剂避光恒温提取；
(2)加入氯化钠、硫酸镁、硫酸钠的混合物，离心后提取有机相；从有机相中准确移取少量萃取液加入PSA吸附净化剂于萃取管中，涡旋充分分散并吸附色素和杂质，离心；
(3)过滤膜净化后进样。
进一步优选地，所述样品为中药材，步骤(1)的有机溶剂为体积分数为60％-80％乙醇与水的混合溶剂。
优选地，步骤(1)所述的恒温提取包括恒温振荡提取和恒温超声提取，提取时的温度为30-60℃，恒温提取的时间为60-120min。
与现有技术相比，本发明提供的恒温振荡-超声有机溶剂提取联合HPLC在线测定技术，实现了食品(番茄、苹果等)及中药材(山楂、枸杞等)共计30种植物中18种天然抗氧化活性成分的提取与HPLC同时在线检测方法。该法的优点是，在提取方法上，提取效率高、温度低、杂质少、设备简单、操作简便、有效成分易于分离、适用性广，在最佳提取条件下，对(类)黄酮类、多酚类和(类)胡萝卜素类等三大类抗氧化成分中极性、弱极性和非极性物质均可实现高效提取。在仪器检测上，在最优色谱条件下，对三大类抗氧化成分均可实现有效分离和高通量多组分同时在线检测。
本发明提供的方法对18种抗氧化活性成分在0.5μg/mL-50.0μg/mL质量浓度范围内呈现良好线性关系，R2≥0.9996；检出限为0.05-1.6μg/g，定量限为0.16-5.0μg/g，低、中、高三个不同浓度加标回收率分别为86.7％-103.2％、88.5％-95.1％和90.3％-98.7％，相对标准偏差(RSD％，n＝6)分别为2.4％-4.5％、2.5％-6.1％和2.0％-4.8％。具有优异的可靠性和精确度。
本发明为中药食品领域中的质量检测、医疗保健和安全评价提供了理论依据，亦可作为筛选具有抗氧化作用的食品中药提取物和天然抗氧化剂的新方法。
附图说明
图1为20μg/mL质量浓度下18种抗氧化活性成分混标的标准色谱图；
图2为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分槲皮素的标准色谱图；
图3为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分山奈酚的标准色谱图；
图4为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分异槲皮素的标准色谱图；
图5为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分二氢杨梅素的标准色谱图；
图6为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分圣草酚的标准色谱图；
图7为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分藏红花素的标准色谱图；
图8为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分番茄红素的标准色谱图；
图9为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分漆黄素的标准色谱图；
图10为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分β-胡萝卜素的标准色谱图；
图11为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分木犀草素的标准色谱图；
图12为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分橙皮素的标准色谱图；
图13为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分芹菜素的标准色谱图；
图14为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分异鼠李素的标准色谱图；
图15为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分杨梅素的标准色谱图；
图16为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分金合欢素的标准色谱图；
图17为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分叶黄素的标准色谱图；
图18为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分玉米黄素的标准色谱图；
图19为20μg/mL质量浓度下抗氧化活性成分角黄素的标准色谱图；
图20为蛋黄样品的液相色谱图；
图21为南瓜样品的液相色谱图；
图22为番茄样品的液相色谱图；
图23为红花样品的液相色谱图；
图24为陈皮样品的液相色谱图；
图25为怀菊花样品的液相色谱图；
图26为枸杞样品的液相色谱图；
图27为蜂花粉样品的液相色谱图；
其中图1中1-18号出峰分别代表：1.槲皮素；2.山奈酚；3.异槲皮素；4.二氢杨梅素；5.圣草酚；6.藏红花素；7.番茄红素；8.漆黄素；9.β-胡萝卜素；10.木犀草素；11.橙皮素；12.芹菜素；13.异鼠李素；14.杨梅素；15.金合欢素；16.叶黄素；17.玉米黄素；18.角黄素。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备。
实施例1
一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，其包括如下步骤：
1.抗氧化活性成分提取
食品：(1)取番茄、蛋黄和南瓜中的一种打浆均质，取2.0-5.0g于50mL离心管中，加入0.1mg BHT，加入20-40mL丙酮-乙酸乙酯-石油醚混合溶剂(体积比1:3:1)，60℃-80℃避光恒温振荡提取30-40min，30-45℃避光恒温超声提取40-50min；
(2)先加入1.0g氯化钠分层，后加入2.0g硫酸镁吸水，二者质量比1:2；
(3)使用高速离心机3000-4000rmp离心5-10min，提取上层有机相；
(4)30℃-45℃氮吹浓缩，1.0mL乙腈定容，过0.22μm滤膜进样(全程避光)。
2.抗氧化活性成分检测方法的建立
2.1标准溶液配制
1)通过系列稀释，将单一成分的抗氧化活性成分分别进行测定，建立各种抗化活性成分标准曲线，各抗氧化活性成分的标准曲线及检出限情况如下表1所示。
以目标物的色谱保留时间进行定性，以色谱峰的峰面积用标准曲线外标法进行定量。在优化的色谱条件下，18种抗氧化活性成分在0.5μg/mL-50.0μg/mL质量浓度范围内呈现良好线性关系，R2≥0.9996。分析低水平添加溶液的信噪比，计算18种抗氧化成分的检出限(S/N＝3)与定量限(S/N＝10)，检出限为0.05-1.6μg/g，定量限为0.16-5.0μg/g。
表1 18种抗氧化活性成分的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限和定量限
Figure BDA0002950388220000061
Figure BDA0002950388220000071
从表1可以看出，利用本发明建立的HPLC检测方法的检出限低于1.60μg/g，而食品中抗氧化活性成分的含量一般为4-5000μg/g，所以，可以满足绝大部分实验的需求。
2)分别配制质量浓度为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0μg/mL的混合标准溶液，绘制标准曲线，其中线性方程见表1，R2≥0.9996。
其中混合标准溶液的配制步骤如下：
单一标准工作液制备：万分之一天平称取0.005g固体溶于5mL乙醇，用棕色玻璃瓶配制成浓度1.0mg/mL单标溶液，现配现用。
混合标准工作液：每种单标移取50μL加入50μL乙醇定容至1.0mL，配制成质量浓度50μg/mL的混合标准工作液，涡旋混匀，现配现用。
对于质量浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0μg/mL的混合标准溶液，将质量浓度50μg/mL的混合标准工作液分别移取10，20，40，100，200，400μL加入乙醇990，980，960，900，800，600μL定容至1mL，现配现用。
2.2样品中抗氧化剂活性成分含量检测
色谱柱为Dikma ODS C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；
柱温30-40℃；
流动相A/B：流动相A为0.02％-0.05％乙酸铵含0.1％-0.2％BHT，流动相B为乙腈；
流速1.0mL/min；
进样体积20μL；
采用梯度洗脱进样分离，HPLC梯度洗脱条件为：流动相A/B，0-5min：A/B＝5％/95％；5-10min：A/B＝10％/90％；10-20min：A/B＝30％/70％；20-30min：A/B＝50％/50％；30-40min：A/B＝80％/20％；40-50min：A/B＝5％/95％；二极管阵列检测器波长设置为480nm。在分析样品组之前，注入空白溶剂乙腈以确保系统没有污染物或干扰峰。
如图1所示，为含有18种抗氧化活性剂标准品的HPLC色谱图，从图中可以看出，可以较好的将18种抗氧化活性成分进行分离。如图2-19所示，为各抗氧化活性成分的标准色谱图。
对于本实施例提供的番茄、蛋黄、南瓜三种食品样品中抗氧化活性成分的含量确定，取处理后的待测溶液按照最佳条件进样，外标法计算待测液中目标组分的质量浓度，按公式(1)计算实际样品中18种抗氧化活性成分的含量。
Figure BDA0002950388220000081
式中：
X：试样中抗氧化活性成分的含量，单位为微克每克，μg·g-1；
C：试样中抗氧化活性成分在标准曲线中对应的浓度，单位为微克每毫升，μg·mL-1；
V：试样提取液的体积，单位为毫升，mL；
m：试样称样量，单位为克，g；
f：提取液稀释因子；
经测定，蛋黄中的叶黄素含量为13.83ug/g，玉米黄素含量为7.06ug/g，角黄素含量为4.05ug/g；南瓜中的叶黄素含量为17.93ug/g，β-胡萝卜素含量为76.02ug/g；番茄中番茄红素含量为5.63ug/g，β-胡萝卜素含量为15.31ug/g。
方法学验证
回收率与精密度
食品中番茄的三个不同浓度(低、中、高)加标回收率分别为86.7％-103.2％、88.5％-95.1％和90.3％-98.7％，相对标准偏差(RSD％，n＝6)分别为2.4％-4.5％、2.6％-5.1％和2.0％-4.8％。具体数据见表2所示。
如图20-22所示，为蛋黄、南瓜、番茄三种食品的检测图谱。
实施例2
一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，其包括如下步骤：
1.抗氧化活性成分提取
(1)取红花、陈皮、怀菊花、枸杞和蜂花粉五种中药材样品中的一种于60-80℃真空干燥4-6h，晾干后高速粉碎机粉碎处理，粉末过筛(0.2-0.5mm筛孔)，四分法缩分，分别标号，-20℃储于密封样品瓶中；
(2)称取2.0-5.0g均质样品于50mL离心管中，加入20-40mL体积分数60％-80％乙醇-水萃取溶剂，室温浸泡60min，40℃恒温振荡提取40min，45℃恒温超声提取40min；
(3)加入8.0g含有氯化钠，硫酸钠，硫酸镁质量比1:2:2的萃取盐析包于提取管中，震荡涡旋1-2min，4000rpm离心6min，提取上层有机相；
(4)从有机相中准确移取2mL加入0.30g PSA吸附净化剂于萃取管中，涡旋1-2min，充分分散并吸附色素和杂质，6000rpm离心10min，过0.22μm有机相滤膜后待测。
2.抗氧化活性成分检测方法的建立
2.1标准液配制同实施例1
2.2样品中抗氧化剂活性成分含量检测
色谱柱为Dikma ODS C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；
柱温30-40℃；
流动相A/B：流动相A为0.02％-0.05％乙酸铵含0.1％-0.2％BHT，流动相B为乙腈；
流速1.0mL/min；
进样体积20μL；
采用梯度洗脱进样分离，HPLC梯度洗脱条件为：流动相A/B，0-5min：A/B＝5％/95％；5-10min：A/B＝10％/90％；10-20min：A/B＝30％/70％；20-30min：A/B＝50％/50％；30-40min：A/B＝80％/20％；40-50min：A/B＝5％/95％；二极管阵列检测器波长设置为480nm。在分析样品组之前，注入空白溶剂乙腈以确保系统没有污染物或干扰峰。
结果表明，红花中藏红花素含量为5606.16ug/g；陈皮中的橙皮素含量为474.33ug/g；怀菊花中的叶黄素含量为283.02ug/g，木犀草素含量为21.24ug/g，芹菜素含量为15.44ug/g，槲皮素含量为37.71ug/g；枸杞中玉米黄素含量为15.30ug/g，叶黄素含量为9.70ug/g，β-胡萝卜素含量为30.15ug/g；蜂花粉中叶黄素含量为7.37ug/g，β-胡萝卜素含量为158.46ug/g。
方法学验证
回收率与精密度
如表2所示，为采用本明的实施例2的方法对中药材枸杞中18种抗氧化活性成分的回收率(％)及精密度RSD(％)(n＝6)
进行加标回收率和相对标准偏差的测定，中药材枸杞样品的低中高三个加标质量浓度分别为1.0mg/kg，5.0mg/kg，10mg/kg。结果表明，枸杞的低、中、高三个不同浓度加标回收率分别为87.1％-99.4％、88.6％-95.0％和90.5％-98.4％，相对标准偏差(RSD％，n＝6)分别为2.4％-4.4％、2.5％-6.1％和2.0％-4.6％。
具体数据见表2。
表2
Figure BDA0002950388220000101
从表2可以看出，采用本发明提供的方法对抗氧化活性成分的平均回收率均大于86.7％，RSD小于6.1％，方法精度高，可靠性好。
如图23-27为五种中药材红花、陈皮、怀菊花、枸杞和蜂花粉的检测图谱。
对比例1
一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，其与实施例1的区别仅在于：
步骤(1)步骤如下：取番茄打浆均质，取2.0-5.0g于50mL离心管中，加入0.1mgBHT，加入20-40mL丙酮-乙酸乙酯-石油醚混合溶剂(体积比1:3:1)，混匀后3000-5000rpm离心，30℃-45℃氮吹浓缩，1.0mL乙腈定容，取上清液过0.22μm滤膜直接上机测定进样(全程避光)。
对比例2
一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，其与实施例1的区别仅在于：
将步骤(1)的提取温度由“60℃-80℃避光恒温振荡提取30-40min，30-45℃避光恒温超声提取40-50min”直接改为常温提取，即“常温20℃-25℃避光恒温振荡提取30-40min，常温20-25℃避光恒温超声提取40-50min。
对比例3
一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，其与实施例1的区别仅在于：
将步骤(1)的提取条件仅进行超声提取，即“30-45℃避光恒温超声提取40-50min”。
对比例4
一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，其与实施例1的区别仅在于：
将步骤(1)的提取条件仅进行震荡提取，即“60℃-80℃避光恒温振荡提取30-40min”。
对比例5
一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，其与实施例2的区别仅在于：
步骤(2)改为“称取2.0-5.0g均质样品于50mL离心管中，加入20-40mL体积分数60％-80％乙醇-水萃取溶剂，4000rpm离心6min，提取上层有机相2mL，过0.22μm有机相滤膜直接上机测定”。
对比例6
一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，其与实施例2的区别仅在于：
将步骤(2)的提取温度由“40℃恒温振荡提取40min，45℃恒温超声提取40min”改为“常温20-25℃恒温振荡提取40min，常温20-25℃恒温超声提取40min”。
对比例7
一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，其与实施例2的区别仅在于：
将步骤(2)进行超声提取，即仅进行“45℃恒温超声提取40min”。
对比例8
一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，其与实施例2的区别仅在于：
将步骤(2)进行震荡提取，即仅进行“40℃恒温振荡提取40min”。
检测方法的加标回收率及精密度结果如下：
食品：
对比例1-对比例4不同处理方法在番茄样品中质量浓度为5.0mg/kg的加标回收率分别为77.2％-116.9％、83.7％-90.4％、80.5％-94.2％和84.6％-93.1％，相对标准偏差(RSD％，n＝6)分别为5.5％-11.8％、4.1％-9.7％、4.7％-8.3％和5.2％-9.7％。
中药材：
对比例5-对比例8不同处理方法在枸杞样品中质量浓度为5.0mg/kg的加标回收率分别为枸杞的低、中、高三个不同浓度加标回收率分别为71.5％-109.7％、79.6％-88.2％、80.3％-91.5％和82.8％-94.1％，相对标准偏差(RSD％，n＝6)分别为5.3％-10.6％、4.0％-9.2％、4.8％-8.3％和4.2％-9.4％。
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，其包括如下步骤：
步骤一、抗氧化活性成分提取
采用恒温振荡-超声有机溶剂提取联合固相萃取；
步骤二、将步骤一得到的样品提取液采用HPLC进行检测，检测条件如下：
色谱柱为Dikma ODS C18色谱柱；
柱温30-40℃；
流动相A/B：流动相A为0.02％-0.05％乙酸铵，其中流动相A中含有0.1％-0.2％抗氧剂，流动相B为乙腈；
洗脱方式为梯度洗脱；
所述样品选自如下物质中的一种：
食品：番茄、胡萝卜、草莓、苹果、洋葱、黄瓜、蛋黄、南瓜、芹菜、西蓝花、莴笋、豇豆；
中药材：山楂、枸杞，红花、陈皮、金银花、桑叶、槐米、垂盆草、侧柏叶、金钱草、槐花、山奈、盐杜仲、地锦草、枳椇子、蒲黄、怀菊花、蜂花粉；
所述抗氧活性物质为如下成分中的一种或多种：
胡萝卜素和类胡萝卜素类：β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、玉米黄素、角黄素、漆黄素、藏红花素；
多酚黄酮类：山奈酚、圣草酚、橙皮素、木犀草素、芹菜素、金合欢素、二氢杨梅素、杨梅素、槲皮素、异鼠李素、异槲皮素。
2.根据权利要求1所述的天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，步骤二中梯度洗脱的程序为：流动相A/B，0-5min：A/B＝5％/95％；5-10min：A/B＝10％-90％；10-20min：A/B＝30％/70％；20-30min：A/B＝50％/50％；30-40min：A/B＝80％/20％；40-50min：A/B＝5％/95％。
3.根据权利要求1所述的天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，步骤一抗氧化活性成分提取步骤包括如下操作：
(1)将经粉碎的样品均质后加入有机溶剂恒温提取；
(2)加入氯化钠、硫酸镁、硫酸钠的至少两种的混合物，离心后提取有机相；
(3)过滤膜净化后进样。
4.根据权利要求3所述的天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，所述样品为食品，步骤(1)中均质后加入相当于样品重量1％-3％的抗氧化剂。
5.根据权利要求4所述的天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，所述抗氧化剂为BHT、BHA和TBHQ中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，步骤(1)所述的恒温提取包括恒温振荡提取和恒温超声提取，提取时的温度为30-60℃，恒温提取的时间为60-120min。
7.根据权利要求1所述的天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，所述样品为食品，步骤一的有机溶剂为丙酮-乙酸乙酯-石油醚的混合溶剂，三者的体积比为1:3:1-1:4:2。
8.根据权利要求1所述的天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，所述样品为中药材，步骤一的有机溶剂为体积分数为60％-80％乙醇与水的混合溶剂。
9.根据权利要求1所述的天然抗氧化活性物质的提取与检测方法，所述步骤二还包括标准曲线建立步骤，其包括系列混合标准溶液的配制步骤，所述系列混合标准溶液的质量浓度为0.5-50μg/mL。
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