CN104173400A - 一种雪菊提取物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种雪菊提取物及其在制备治疗高脂血症和抗氧化药物中的应用。该雪菊提取物的制备方法为取雪菊药材，用12～25倍30～75％乙醇回流提取2～3次，合并提取液，浓缩，得到提取浓缩液，将该提取浓缩液加水稀释，经AB-8大孔树脂精制，依次用水、10％乙醇、50～75％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，收集50～75％乙醇洗脱部位，浓缩，干燥，即得。该雪菊提取物中的主要成份包括10种黄酮类，其中马里苷和黄诺玛苷的总含量大于10％。动物体内试验表明该雪菊提取物具有一定调节血脂作用；体外抗自由基清除实验表明该雪菊提取物具有一定抗氧化作用，其中黄诺马苷、马里苷等是其主要抗氧化成分。

Description

一种雪菊提取物及其应用
技术领域
本发明涉及一种雪菊提取物及其应用，更具体的说是，涉及一种雪菊提取物及其在制备治疗高脂血症和抗氧化药物中的应用，属药品和保健食品领域。
背景技术
雪菊为菊科植物两色金鸡菊(Coreopsis tinctoria Nutt.)的花，该植物原产北美，在新疆和田地区昆仑山脉有分布，因而俗称为“雪菊”，又名血菊、高山寒菊、金鸡菊，维语称其为“古里恰依”。在1990年代，该地区民间将雪菊作为一种特色花茶饮用，认为具有降压、降糖及降脂的功效。随着人们对该药材功效的认识和普及，雪菊被誉为与天山雪莲齐名的新疆特产，并已进行规模化种植和推广应用。
关于雪菊的相关研究文献主要集中于我国。近年研究报道证明雪菊具有明确的降血糖、降压、降血脂、抗氧化损伤等多种功效[潘英等，金鸡菊属植物化学成分和药理活性研究进展，现代药物与临床，2012，27(5)：521]。梁淑红等采用高脂血症小鼠模型，研究金鸡菊总提物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物(剂量均为1.2g/kg)的调脂作用，结果显示各组均有不同程度降低总胆固醇(TC)、总甘油酯(TG)或升高高密度脂蛋白(HDL-C)的作用[梁淑红等，金鸡菊提取物降血脂作用的研究。中国实验方剂学杂志，2010，31(8):495]，提示金鸡菊提取物有较好的降血脂作用。张媛和屠鹏飞等报道[Biochemical Systematics and Ecology，2006，34(10)：766；中国中药杂志2012,37(23):3581]，雪菊中存在大量的黄酮、有机酸类等成分。
高脂血症是由于脂肪代谢或运转异常使血浆一种或多种脂质高于正常的代谢性疾病。大量的研究资料表明高脂血症是脑卒中、冠心病、心脏猝死的独立危险因素，有效控制高脂血症是防治心脑血管疾病的重要途径。随着人们生活水平的提高、饮食结构的改变，加之运动减少，导致高脂血症的发病率有明显增高趋势，高脂血症已经成为危害人类健康的公共卫生问题之一。治疗高脂血症药物主要有西药和中药，与西药相比，中药因其绿色天然、多靶点起效、安全性高而更适于长期服用以调节血脂。现有研究资料表明，雪菊具有较为确切的降血糖、降脂、降压等功效，这与雪菊的民间应用经验相符。目前的研究报道主要侧重对雪菊药理活性方面的研究和验证，一般采用雪菊提取物进行，缺乏对提取物中有效成分的分析和鉴定，因而难以保证雪菊提取物药理功效的稳定性和有效性，有待进一步深入研究。
发明内容
本发明目的是提供一种雪菊提取物及其应用，即在制备治疗高脂血症和抗氧化药物中的应用。同时提供了雪菊提取物的制备方法，通过该方法制备的雪菊提取物与现有技术相比，提取物化学组成稳定，药理有效成分纯度高、功效稳定，药物使用剂量小。
本发明的技术方案是：一种雪菊提取物，该提取物中马里苷和黄诺玛苷的总含量大于10％，其采用以下方法制备得到：
(1)选取雪菊药材，用12～25倍量的30～75％乙醇回流提取，每次0.5～1.5h，重复提取2～3次，合并提取液，浓缩，得到提取浓缩液；
(2)将上述提取浓缩液加水稀释，上样至预处理好的大孔树脂柱，依次用水、10％乙醇、50～75％乙醇梯度洗脱，收集50～75％乙醇洗脱部位，浓缩，干燥，即得。
进一步，优选的，所述大孔树脂为弱极性或非极性树脂。
进一步，所述步骤(1)中用于回流提取的乙醇选定为30～40％乙醇，并且最后得到的所述雪菊提取物中马里苷和黄诺玛苷的比例为1：1～2，总含量大于20％。
进一步，步骤(1)中用于回流提取的乙醇选定为45～75％乙醇，并且最后得到的所述雪菊提取物中马里苷和黄诺玛苷的比例为1：0.4～1，总含量大于20％。
进一步，优选的，所述12～25倍量的30～75％乙醇选定为16-20倍量的30-35％乙醇，所述回流提取时间每次为50-60min时，所述雪菊提取物中马里苷和黄诺玛苷含量大于35％。
上述一种雪菊提取物在制备治疗高脂血症药物及抗氧化药物中的应用。
本发明的优点是：本发明中的一种雪菊提取物可应用于制备治疗高脂血症和抗氧化药物。所述雪菊提取物与现有技术相比，提取物化学组成稳定，药理有效成分纯度高、功效稳定，药物使用剂量小。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为雪菊提取物高效液相色谱图
其中色谱峰1-3依次为黄诺马苷(1)、马里苷(2)和奥卡宁(3)。
图2为实施例7中雪菊提取物(XJE)、黄诺马苷(XJ01)、马里苷(XJ03)、3,4’,5,6,7-二氢槲皮素-O-己糖苷(XJ02)以及对照药芦丁(Rutin)抗DPPH自由基量效关系图。
图3为实施例7中雪菊提取物(XJE)、黄诺马苷(XJ01)、马里苷(XJ03)、3,4’,5,6,7-二氢槲皮素-O-己糖苷(XJ02)以及对照药芦丁(Rutin)抗ABTS自由基量效关系图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：雪菊提取物的制备
干燥的雪菊(Coreopsis tinctoria，产地：新疆达坂城，批次130501)花1.0kg，经20L30％乙醇水溶液回流提取2次，每次1h，合并两次的提取液，滤过，减压浓缩回收乙醇，加适量水稀释到3.0L；选用AB-8树脂柱(100cm×10cm i.d.，柱体积2.0L/BV)，上样后依次用水6BV，10％乙醇3BV，75％乙醇4BV，95％乙醇2BV洗脱，流速1.5～2BV/h；收集75％乙醇洗脱部位，浓缩，干燥，获得精制雪菊总黄酮提取物(XJE)115g。经HPLC检测，其具体实验条件同实施例5XJE中黄酮定性定量分析部分，XJE提取物中马里苷、黄诺玛苷的含量分别为17.1％、26.4％。
实施例2：雪菊提取物的制备
干燥的雪菊花1.0kg，经20倍50％乙醇水溶液回流提取2次，其余提取和精制方法同实施例1，获得精制雪菊总黄酮提取物(XJE)104g。经HPLC检测，其具体实验条件同实施例5XJE中黄酮定性定量分析部分，XJE提取物中马里苷、黄诺玛苷的含量分别为24.3％、18.7％。
实施例3：雪菊提取物的制备
干燥的雪菊花1.0kg，经20倍75％乙醇水溶液回流提取2次，其余提取和精制方法同实施例1，获得精制雪菊总黄酮提取物(XJE)104g。经HPLC检测，其具体实验条件同实施例5XJE中黄酮定性定量分析部分，XJE提取物中马里苷、黄诺玛苷的含量分别为26.1％、11.5％。
实施例4：雪菊提取物的提取工艺参数优化
(1)单因素实验：称取1.00g雪菊粉末，置于50mL圆底烧瓶中，以料液比1：20加入提取溶剂，回流提取2次，采用HPLC法测定提取液中指标成分马里苷和黄诺玛苷含量。固定其他条件，分别考察提取溶剂(水、30％、50％、75％、95％乙醇)、提取时间(30、50、60、70、90min)、料液比(1：8、1：12、1：16、1：20、1：25)的影响，分析总结最佳提取因素范围。研究结果表明，主要黄酮类成分在提取溶剂30％～75％乙醇之间提取率较高，在此范围外的溶剂提取率低。料液比在1：16和1：25之间提取率较高、成本较经济。提取时间(50～90min)的影响相对较小。
(2)星点设计实验：上述单因素实验研究结果表明，主要黄酮类成分在提取溶剂30％-75％乙醇之间提取率较高，本实验进一步应用响应面分析法，采用3因素5水平的旋转组合设计(见表1)，以黄酮类化合物马里苷(R1)和黄诺玛苷(R2)含量(按mg/g药材干重计)为响应值，用来测定雪菊提取物的最佳工艺参数(见表2)。
表1 响应面分析法试验因素水平及编码
编码 A溶剂 B时间 C料液比
-1.682 15 40 1/26
-1 30 50 1/20
0 52.5 65 1/15
1 75 80 1/12
1.682 90 90 1/10
表2 响应面试验设计及结果
序列 因素A 因素B 因素C R1(mg) R2(mg) R1+R2(mg)
1 0.00 0.00 1.68 32.41 20.24 52.65
2 0.00 -1.68 0.00 39.04 17.96 57.00
3 0.00 0.00 0.00 35.43 21.53 56.96
4 0.00 0.00 0.00 35.43 21.53 56.96
5 1.00 1.00 -1.00 47.81 14.21 62.02
6 0.00 1.68 0.00 33.61 25.64 59.25
7 0.00 0.00 0.00 35.43 21.53 56.96
8 1.00 -1.00 1.00 44.16 12.25 56.41
9 -1.00 1.00 1.00 14.16 33.58 47.74
10 0.00 0.00 0.00 35.43 21.52 56.96
11 -1.00 1.00 -1.00 19.27 41.03 60.30
12 0.00 0.00 0.00 35.43 21.53 56.96
13 1.68 0.00 0.00 44.51 9.467 53.98
14 -1.00 -1.00 -1.00 35.73 55.30 91.03
15 0.00 0.00 -1.68 43.63 29.80 73.43
16 0.00 0.00 0.00 35.43 21.53 56.96
17 1.00 -1.00 -1.00 53.67 12.42 66.09
18 -1.68 0.00 0.00 7.394 58.08 65.47
19 -1.00 -1.00 1.00 26.35 57.64 83.99
20 1.00 1.00 1.00 47.32 15.52 62.84
由Design Expert8.0软件对实验数据进行多元回归拟合，获得马里苷的回归方程：R1＝32.61+0.5701A-0.7770B-16.85C+9.611*10-3AB-1.497AC-6.645BC-5.474*10-3A2+3.983*10-3B2+5384C2，回归系数R2＝0.98。溶剂(A)对马里苷含量大小影响极为显著(P<0.0001)，以30-40％范围较优，30-35％最佳；料液比(C)与时间(B)对马里苷含量大小影响显著(P<0.05)。
黄诺马苷的回归方程：R2＝195.3-2.637A-1.648B-974.4C+0.01607AB-2.083AC+4.155BC+9.824*10-3A2+3.290*10-3B2+6763C2，回归系数R2＝0.9494。溶剂(A)对黄诺玛苷含量大小影响极为显著(P<0.0001)，以30-75％范围较优，45-75％最佳；料液比(C)与时间(B)对黄诺玛苷含量大小影响不显著。
以R1与R2含量总和为综合评价参数，确定了最佳条件为溶剂30％乙醇，时间50min，料液比1/20。在最佳提取工艺条件下重复三次试验得出马里苷的含量分别为34.19mg，35.74mg，34.68mg，平均值为34.78mg；黄诺玛苷的含量分别为61.95mg，62.51mg，61.96mg，平均值为62.14mg。在最优工艺下，雪菊中马里苷与黄诺玛苷的含量均较高，且总黄酮含量达到最优水平。根据马里苷和黄诺玛苷的回归方程进行计算分析，结合单因素考察结果，结果表明较优的提取工艺参数区间为16-20倍量的30-35％乙醇，回流提取时间为每次50-60min，提取次数为2次。
实施例5：雪菊提取物中化学成分组成分析
(1)取上述制备的雪菊提取物XJE10g，经CHP20树脂上样吸附，依次用水8BV，30％甲醇8BV，50％甲醇8BV，75％甲醇8BV，90％甲醇8BV洗脱；HPLC检测分析纯度，依次从30％甲醇部位得到XJ01和XJ04，50％甲醇部位得到XJ02，75％甲醇部位得到XJ03。各部位流分样品再经反相中压柱层析、LH20凝胶等多次柱层析纯化，获得3个黄酮成分XJ01、XJ03及1个混合物组分XJ02。经1H和13C-NMR、UV、MS波谱分析，确定各化合物依次为：黄诺马苷(XJ01)，马里苷(XJ03)和奥卡宁(XJ04)。
(2)XJE中黄酮定性定量分析：以马里苷(XJ02，0.8653mg/mL)为对照品，采用HPLC/PDA系统建立了雪菊提取物中的定性定量分析方法。色谱条件：Shimadzu LC20A HPLC液相系统，Cosmosil C18色谱柱(4.6×250mm)，以乙腈-0.1％乙酸铵(20:80)为流动相，流速1.0ml/min，进样量10ul；PDA检测波长：280nm(附图1)、348nm。经HPLC检测，XJE提取物中马里苷含量为17.06％。
(3)采用LC/PDA/ESIMS/MS液质联用系统进一步测定XJE的主要成分(见表3)。色谱条件为：Shimadzu LC20XR UFLC液相系统，色谱柱为Kromasil C18柱(250*4.6mm，5um)，流动相乙腈：0.1％乙酸＝1:4等度洗脱，流速1.0ml/min，进样量10μl；PDA检测波长：280nm(二氢黄酮)、348nm(查尔酮)；质谱检测器AB Qtrap4500，扫描模式EMS-EPI、MIM-EPI。其测定结果如表3所示。本实施例从雪菊提取物中鉴定出12种主要成分，主要包括10种黄酮类和2种绿原酸类成分。该提取物成分组成与相关文献报道基本一致。
表3 雪菊提取物中化学成分的UFLC/PDA/ESIMS/MS鉴定结果
No Rt(min) 结构鉴定 UVmax(nm) [M-H]- MS/MS
1 3.70 3,4’,5,6,7-二氢槲皮素-O-己糖苷(XJ02) 285 465 303
2 4.22 绿原酸 290sh,323 353 191
3 5.33 黄诺马苷(XJ01) 283 449 431
4 6.58 黄三叉菊宁 289 433 151
5 6.93 槲皮素-7-O-葡萄糖苷 357 479 317
6 12.04 3,4’,5,6,7-二氢槲皮素 288 303 285
7 12.06 3’,5,5’,7-四羟基黄烷酮-O-己糖苷 285 449 287
8 12.70 马里苷(XJ03) 380 449 431
9 12.88 3’,5,5’,7-四羟基黄烷酮 285 287 151
10 17.0 奥卡宁(XJ04) 380 287 151
11 18.22 二咖啡酰奎宁酸 300sh,328 515 353
12 24.0 金鸡菊苷 381 433 271
实施例6：雪菊提取物XJE对实验性高脂血症小鼠的调脂作用
取雄性昆明种小鼠60只，随机分成二组，正常对照组12只和造模组48只。造模组小鼠于每天上午灌服高脂乳剂0.2ml/10g体重，正常对照组给予等体积的生理盐水。2周后，根据测得的TC水平再将造模组小鼠进一步分为：高脂模型组，剂量分别为100mg/kg，200mg/kg的小、大剂量的XJE给药组，阳性药物非诺贝特组(40mg/kg)，每组12只，继续给予高脂乳剂灌胃。大、小剂量的XJE给药物组和阳性药物组小鼠于每天下午分别按照相应的剂量灌服受试药物，正常对照组和高脂模型组小鼠给予等量的0.5％CMC-Na2溶液灌服，连续6周。在实验期间，每天称取小鼠的摄食量，每周称取小鼠的体重。在给药期间，每2周测定一次血清TC和TG水平，最后一次测定下列各项观察指标：(1)血中的指标：血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和LDL-C。其中LDL-C按下列公式计算：LDL-C＝TC-(TG/2.2+HDL-C)；(2)肝中的指标：肝重、肝重系数、SOD、MDA和GSH-PX。其结果分别如表4和表5所示。
结果表明，XJE对小鼠的摄食量和体重无明显不良影响。从表4中可以看出，和高脂模型组相比大、小剂量的XJE干预组均可降低血清中TG水平(P<0.05)，血清TC水平有下降趋势，但无统计学差异。从表5中可以看出，小剂量XJE可降低肝重系数(P<0.05)，降低肝内MDA水平(P<0.05)。以上结果表明XJE有一定的调血脂及抗氧化作用。
表4 给药6周时的血脂水平(n＝12)
其中，*表示与高脂模型组相比，P<0.05；**表示与高脂模型组相比P<0.01。
表5 给药6周时的肝重、肝重系数及SOD、MDA和GSH-PX水平(n＝12)
其中，*表示与高脂模型组相比P<0.05；**表示与高脂模型组相比P<0.01。
实施例7：体外抗氧化测试
(1)采用体外DPPH和ABTS自由基清除试验，分别测试XJE和其主要成分的抗氧化活性结果，以提取物浓度与抑制率表示的量效关系图如图2和图3所示，结果表明XJE及黄诺马苷、马里苷均具有剂量依赖性的抗氧化量效关系。其抗DPPH●和ABTS●+自由基的IC50(μg/mL)值依次分别为12、25、9μg/mL和51、88、35μg/mL，与常用抗氧化剂芦丁(分别为3μg/mL和64μg/mL)相近。结果表明XJE对脂溶性自由基DPPH和水溶性ABTS自由基均具有很强的直接清除作用，其中的黄诺马苷、马里苷等黄酮类成分是其主要抗氧化成分。
(2)采用过氧化氢诱导的人肝LO2细胞构建体外氧化应激细胞模型，测试了XJE及黄诺马苷、马里苷的抗氧化活性并探讨其可能的机制。结果表明XJE及XJ01、XJ02(20、50、100μg/ml)具有明显的抗氧化活性，且具有剂量依赖性的量效关系，其保护肝细胞的机制与明显增加细胞活力，减少NO的释放、降低caspase3、5、7的活力以及抑制细胞的凋亡相关。
通过上述实施例可以看出，本发明中雪菊提取物在剂量为100mg/kg，200mg/kg时，对小鼠具有调脂作用。雪菊提取物以及从其中分离出来的黄诺马苷、马里苷具有抗氧化作用，并测定黄诺马苷、马里苷等黄酮类成分是其主要抗氧化成分。通过改变雪菊提取物制备工艺中提取乙醇浓度、提取时间以及提取时料液比，可提高有效成分黄诺马苷、马里苷含量。表明该雪菊提取物可应用于治疗高脂血症、抗氧化药物中。

Claims (7)

1.一种雪菊提取物，其特征在于，所述雪菊提取物中马里苷和黄诺玛苷的总含量大于10％，其采用以下方法制备得到：
(1)选取雪菊药材，用12～25倍量的30～75％乙醇回流提取，每次0.5～1.5h，重复提取2～3次，合并提取液，浓缩，得到提取浓缩液；
(2)将上述提取浓缩液加水稀释，上样至预处理好的大孔树脂柱，依次用水、10％乙醇、50～75％乙醇梯度洗脱，收集50～75％乙醇洗脱部位，浓缩，干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的一种雪菊提取物，其特征在于，所述大孔树脂为弱极性或非极性树脂。
3.根据权利要求1所述的一种雪菊提取物，其特征在于，步骤(1)中用于回流提取的乙醇选定为30～40％乙醇，并且最后得到的所述雪菊提取物中马里苷和黄诺玛苷的比例为1：1～2，总含量大于20％。
4.根据权利要求1所述的一种雪菊提取物，其特征在于，步骤(1)中用于回流提取的乙醇选定为45～75％乙醇，并且最后得到的所述雪菊提取物中马里苷和黄诺玛苷的比例为1：0.4～1，总含量大于20％。
5.根据权利要求1所述的一种雪菊提取物，其特征在于，所述12～25倍量的30～75％乙醇选定为16-20倍量的30-35％乙醇，所述回流提取时间每次为50-60min，所述雪菊提取物中马里苷和黄诺玛苷含量大于35％。
6.如权利要求1～5任意一项所述的一种雪菊提取物在制备治疗高脂血症药物中的应用。
7.如权利要求1～5任意一项所述的一种雪菊提取物在制备抗氧化药物中的应用。
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