CN106404955A - 一种测定高粱红色素中槲皮素‑7‑葡萄糖苷含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学领域，本发明公开了一种测定高粱红色素中槲皮素‑7‑葡萄糖苷含量的高效液相色谱分析方法，该方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以甲醇‑乙酸水溶液作为流动相，可以定量测定槲皮素‑7‑葡萄糖苷的含量，从而有效控制高粱红色素的质量。本发明方法专属性强，准确度高、重复性好，操作简单。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定高粱红色素中槲皮素-7-葡萄糖苷(3,5,3',4'-四羟基黄酮-7-葡萄糖苷)含量的方法。
背景技术
高粱红色素(Sorghum red)又称高粱红、高粱色素等，是从高粱壳中提取得到的一种天然色素，呈深红棕色粉末，溶于水及乙醇水溶液，不溶于石油醚、三氯甲烷；主要成分为芹菜素(Apigenin；5,7,4'-三羟基黄酮)和槲皮素-7-葡萄糖苷(Quercetin-7-glucoside；3,5,3',4'-四羟基黄酮-7-葡萄糖苷)。高粱红色素具有色调自然、柔和、无毒、无特殊气味，价廉和着色性能好，可在各类食品中按生产需要适量使用；并具有生津止渴、消炎解热、扩张血管、降低血糖和血压的功能。
槲皮素-7-葡萄糖苷分子式为C21H20O12，结构式为：
。
现有技术中，评价高粱红色素的品质性能主要依靠GB 1886.32-2015食品安全国家标准 食品添加剂 高粱红中色价来评定，而这种评价方法尚有不妥之处，不能充分的反映出其中各成分的含量；因此需要对高粱红色素中主成分进行定量检测，确保各成分在高粱红色素中保持一定的含量。
目前，未见测定高粱红色素中主成分槲皮素-7-葡萄糖苷含量方法的报道。
近年来，随着分析技术的进步与液相色谱仪的普及，添加剂的质量控制大都采用高效液相色谱法，该方法有精密度高、准确度高、灵敏度高、专属性强等优点。因此，本实验拟采用高效液相色谱法定量分析高粱红色素中槲皮素-7-葡萄糖苷的含量，为进一步提高该产品的质量标准提供参考依据，有力保证其内在质量的稳定性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种测定高粱红色素中槲皮素-7-葡萄糖苷含量的高效液相色谱分析方法，以填补现有技术中对高粱红色素中槲皮素-7-葡萄糖苷定量检测的空白，为进一步提高高粱红色素产品的质量标准提供参考依据，有力保证其内在质量的稳定性。
本发明所述的测定高粱红色素中槲皮素-7-葡萄糖苷含量的高效液相色谱分析方法，包括如下步骤：
（1）标准品溶液的制备：精密称重槲皮素-7-葡萄糖苷标准品适量，加乙醇-盐酸溶液（pH 2.5~3.5）溶解，配制为标准品溶液；
（2）样品溶液的制备：称取高粱红色素（高粱壳提取物）适量，加乙醇-盐酸溶液（pH 2.5~3.5），超声溶解，过滤，续滤液即为样品溶液；
（3）色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶(250 mm× 4.6 mm，5 um)为填充剂，以甲醇为流动相A相，以体积比0.5 % ~ 1.5 %乙酸水溶液为流动相B相；其体积配比为流动相A相：流动相B相为50~70：30~50；柱温为25 ℃ ~ 35 ℃；流速为0.8 ml/min ~ 1.2 ml/min；检测波长为486±5 nm；
（4）色谱峰测定：将上述步骤（1）所制得的样品溶液注入高效液相色谱仪，按照上述步骤（3）的色谱条件，测定供试液溶液，得到高粱红色素中槲皮素-7-葡萄糖苷特征峰的保留时间；
（5）结果计算：制定标准曲线，测定峰面积，计算出样品中槲皮素-7-葡萄糖苷的含量。
作为本发明的优选，所述步骤（1）和步骤（2）溶液制备方法中，加入的乙醇-盐酸溶液的pH为3.0。
作为本发明的优选，所述步骤（1）标准品溶液制备方法中，所述槲皮素-7-葡萄糖苷浓度范围为10.2 ~ 408.0 μg/ml。
作为本发明的优选，所述步骤（3）的色谱条件中，流动相B相为1.0 %乙酸水溶液；流动相A相：流动相B相为60:40（体积比）；柱温为30 ℃；流速为1.0 ml/min；检测波长为486nm。
本发明的益处。
1、本发明所建立的高粱红色素中槲皮素-7-葡萄糖苷高效液相色谱检测方法，具有精密度、重现性良好、稳定性可靠的特点，能有效地对其进行定性鉴定和定量测定，实验结果表明，该检测方法的加标回收率在回收率为81.3 %~102.5 %之间，精密度为0.78 % （n=6），重复性为1.8 % （n=6）。
2、本发明提供了所述方法在监控高粱红色素或含高粱红色素的产品质量中的用途。
附图说明
图1为槲皮素-7-葡萄糖苷标准品全波长紫外-可见光谱扫描图。
图2为槲皮素-7-葡萄糖苷标准品的PDA 3D图。
图3为流动相为甲醇：1 %乙酸水溶液=60:40(V/V)时槲皮素-7-葡萄糖苷标准品色谱图。
图4为流动相为甲醇：1 %乙酸水溶液=60:40(V/V)时高粱壳提取物样品色谱图。
图5为流动相为甲醇：1 %乙酸水溶液=30:70(V/V)时槲皮素-7-葡萄糖苷标准品色谱图。
图6为流动相为乙腈：1 %乙酸水溶液=40:60(V/V)时高粱壳提取物样品色谱图。
图7为槲皮素-7-葡萄糖苷的标准曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，但实施例并不限制本发明的保护范围。
主要实验仪器：Waters e2695 高效液相色谱仪：配有Waters 2998 二极管阵列检测器(PDA)和Empower色谱工作站。
色谱条件：色谱柱：C18 (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流动相：甲醇-1 %乙酸溶液(50~70∶30~50，V/V)；流速：1 ml/min；检测波长：486 nm；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；光谱扫描范围：200~800nm。
标准品与试剂：槲皮素-7-葡萄糖苷标准品(含量98 %)；甲醇(色谱纯)；无水乙醇(分析纯)、冰乙酸(分析纯)；盐酸(优级纯)。
样品：高粱红色素、高粱壳。
实验中流动相和溶液用水均为超纯水。
实施例1 检测波长的选择。
采用二极管阵列检测器(PDA) 200~800 nm全波长扫描槲皮素-7-葡萄糖苷标准溶液，得全波长紫外-可见光谱扫描图和PDA 3D图(参见图1~2)，由图1可知，槲皮素-7-葡萄糖苷在486 nm波长处有最大吸收，由图2可知在486 nm处槲皮素-7-葡萄糖苷色谱图基线稳定，干扰少，灵敏度好；所以，选择486 nm作为检测波长。
实施例2 流动相的选择。
将不同体积比的流动相组成进行对比筛选试验，分别观察了甲醇-水(60∶40，V/V)、甲醇-0.1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)、甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)、甲醇-1 %乙酸溶液(50∶50，V/V)、甲醇-1 %乙酸溶液(30∶70，V/V)以及乙腈-1 %乙酸溶液(40∶60，V/V)等对槲皮素-7-葡萄糖苷在C18柱上保留行为的影响。结果发现：当选择流动相为甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)作为流动相时，槲皮素-7-葡萄糖苷的峰形好，样品分离度好，保留时间适中(7.2 min)，效果参见图3~4。
实施例3 标准溶液的配制。
准确称取 10.20 mg槲皮素-7-葡萄糖苷标样至10 ml容量瓶中，加乙醇-盐酸溶液(pH3.0)溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度为1.02 mg/ml的槲皮素-7-葡萄糖苷标准储备液，使用时用乙醇-盐酸溶液(pH3.0)逐级稀释到所需浓度。
实施例4 标准曲线的制作。
高效液相色谱条件为：色谱柱：C18 (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流动相：甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：486 nm；进样体积：10 μL；检测波长：486nm。
取上述配制的槲皮素-7-葡萄糖苷标准溶液进样，以峰面积对浓度作图，具体参见图7。
由图7可知，槲皮素-7-葡萄糖苷在浓度10.2~408.0 μg/ml的范围内时，槲皮素-7-葡萄糖苷质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为：Y＝1 063.4X-564.5，R＝0.999 8。
当信噪比S/N＝3时，测得槲皮素-7-葡萄糖苷的最低检测限为 4 μg/ml。
实施例5 回收率试验。
高效液相色谱条件为：色谱柱：C18 (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流动相：甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：486 nm；进样体积：10 μL；检测波长：486nm。
采用加标回收试验，称取高粱红色素样品25 mg于25 ml容量瓶中，加入槲皮素-7-葡萄糖苷标准储备液(1.02 mg/ml) 0.1 ml、1 ml、5 ml，加乙醇-盐酸溶液(pH3.0)溶解并稀释至刻度，摇匀，进行HPLC检测，比较添加量和检测量计算添加回收率，结果如下：
。
在3个不同的水平，槲皮素-7-葡萄糖苷的平均回收率在81.3 %~102.5 %之间，其相对标准偏差RSD (n=3)在1.6 %~9.2 %之间。
实施例6 重复性试验。
高效液相色谱条件为：色谱柱：C18 (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流动相：甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：486 nm；进样体积：10 μL；检测波长：486nm。
取同一批高粱红色素，分别称取50 mg高粱红色素至25 ml的容量瓶中，乙醇-盐酸溶液(pH3.0)定容，超声溶解，0.22 μm 有机膜过滤，配置6份，按上述色谱条件测定，记录峰面积，计算相对标准偏差（RSD），RSD（n=6）为1.8 %，结果本方法的重复性良好。
实施例7 精密度试验。
高效液相色谱条件为：色谱柱：C18 (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流动相：甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：486 nm；进样体积：10 μL；检测波长：486nm。
取51.0 μg/ml槲皮素-7-葡萄糖苷标准溶液，按上述色谱条件，同一份溶液重复测定6次，记录峰面积，计算其RSD（n=6）为0.78 %，表明本方法的精密度良好。
实施例8 样品中槲皮素-7-葡萄糖苷含量的测定。
高效液相色谱条件为：色谱柱：C18 (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流动相：甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：486 nm；进样体积：10 μL；检测波长：486nm。
取含槲皮素-7-葡萄糖苷高粱红色素样品50.42 mg高粱红色素至25 ml的容量瓶中，用乙醇-盐酸溶液(pH3.0)溶解并稀释至刻度，摇匀，0.22 μm 有机膜过滤，进行高效液相色谱分析，参见图4。
经测定，高粱红色素中槲皮素-7-葡萄糖苷的含量为 0.0169g/g。
实施例9 高粱壳中槲皮素-7-葡萄糖苷含量的测定。
高效液相色谱条件为：色谱柱：C18 (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流动相：甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：486 nm；进样体积：10 μL；检测波长：486nm。
称取3.1345 g粉碎的高粱壳，用滤纸包好后，置于250 ml索氏提取器中，加入170ml乙醇，在80℃的水浴上加热2 h，提取液浓缩至体积约5 ml后，用乙醇-盐酸溶液(pH3.0)定容25 ml，摇匀，0.22 μm 有机膜过滤，进行高效液相色谱分析。
经测定，高粱壳中槲皮素-7-葡萄糖苷的含量为 3.2×10-4 g/g。
Claims (4)
1.一种测定高粱红色素中槲皮素-7-葡萄糖苷含量的方法，其特征在于采用该方法能有效的高粱红色素中对槲皮素-7-葡萄糖苷进行含量测定，包括如下步骤：
（1）标准品溶液的制备：精密称重槲皮素-7-葡萄糖苷标准品适量，加乙醇-盐溶液（pH2.5~3.5）溶解，配制为标准品溶液；
（2）样品溶液的制备：称取高粱红色素适量，加乙醇-盐酸溶液（pH 2.5-3.5），超声溶解，过滤，续滤液即为样品溶液；
（3）色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶(250 mm×4.6 mm，5 um)为填充剂，以甲醇为流动相A相，以体积比0.5 % ~ 1.5 %乙酸水溶液为流动相B相；其体积配比为流动相A相：流动相B相为50~70：30~50；柱温为25 ℃ ~ 35 ℃；流速为0.8 ml/min ~ 1.2 ml/min；检测波长为486±5 nm；
（4）色谱峰测定：将上述步骤（1）所制得的样品溶液注入高效液相色谱仪，按上述步骤（3）的色谱条件，测定供试液溶液，得到高粱红色素中槲皮素-7-葡萄糖苷特征峰的保留时间；
（5）结果计算：制定标准曲线，测定峰面积，计算出样品中槲皮素-7-葡萄糖苷的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）溶液制备方法中，加入的乙醇-盐酸溶液的pH为3.0。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）标准品溶液制备方法中，所述槲皮素-7-葡萄糖苷浓度范围为10.2 ~ 408.0 μg/mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）的色谱条件为，流动相B相为1.0%乙酸水溶液；流动相A相：流动相B相为60:40（V/V）；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min；检测波长为486nm。
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