CN108562568B - 一种泽泻药材的鉴别和质量检测方法 - Google Patents

一种泽泻药材的鉴别和质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种泽泻药材的鉴别和质量检测方法，该方法分别通过泽泻药材和泽泻药材DNA的拉曼光谱建模比较法鉴别泽泻药材的真伪，并采用表面增强拉曼光谱法测定泽泻药材中乙酰泽泻醇B的含量。本发明可以准确地鉴别出药材饮片的真伪和品质及是否被硫熏处理的情况，可以快速有效地实现泽泻药材中乙酰泽泻醇B含量的快速、低成本、环保地检测。

Description

一种泽泻药材的鉴别和质量检测方法
技术领域
本发明涉及中医药技术领域，具体是一种泽泻药材的鉴别和质量检测方法。
背景技术
泽泻（学名：Alisma plantago-aquatica Linn.），多年生水生或沼生草本。全株有毒，地下块茎毒性较大。块茎直径1-3.5厘米，或更大。花药长约1毫米，椭圆形，黄色，或淡绿色；瘦果椭圆形，或近矩圆形，种子紫褐色，具凸起。花较大，花期较长，可用于花卉观赏。亦可入药，主治肾炎水肿、肾盂肾炎、肠炎泄泻、小便不利等症。泽泻药材为泽泻科植物泽泻的干燥块茎。冬季茎叶开始枯萎时采挖，洗净，干燥，除去须根及粗皮。泽泻药材利小便，清湿热；用于小便不利，水肿胀满，泄泻尿少，痰饮眩晕，热淋涩痛，高血脂。
拉曼光谱仪主要适用于科研院所、高等院校物理和化学实验室、生物及医学领域等光学方面，研究物质成分的判定与确认；还可以应用于刑侦及珠宝行业进行毒品的检测及宝石的鉴定。拉曼光谱仪以其结构简单、操作简便、测量快速高效准确，以低波数测量能力著称；采用共焦光路设计以获得更高分辨率，可对样品表面进行um级的微区检测，也可用此进行显微影像测量。拉曼光谱(Raman spectra)是一种散射光谱。拉曼光谱分析法是基于印度科学家C.V.拉曼(Raman)所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。表面增强拉曼散射( SERS) 效应是指在特殊制备的一些金属良导体表面或溶胶中，在激发区域内，由于样品表面或近表面的电磁场的增强导致吸附分子的拉曼散射信号比普通拉曼散射(NRS)信号大大增强的现象。
发明内容
本发明的目的是提供一种泽泻药材的鉴别和质量检测方法，该方法通过泽泻药材和泽泻药材DNA拉曼光谱建模比较法鉴别泽泻药材的真伪，并采用表面增强拉曼光谱法测定泽泻药材中乙酰泽泻醇B的含量。本发明可以准确地鉴别出药材饮片的真伪和品质及是否被硫熏处理的情况，可以快速有效地实现泽泻药材中乙酰泽泻醇B含量的快速、低成本、环保地检测。
本发明所述一种泽泻药材的鉴别和质量检测方法包括以下内容：
1、制备银溶胶并给石英玻璃片镀上银镜：
（1）制备银溶胶：制备浓度为1×10-3mol/L的硝酸银溶液，加热到沸腾；然后向沸腾的硝酸银溶液中逐滴加入新配置的重量含量为1％的柠檬酸三钠溶液5mL；保持沸腾状态约30min后，继续搅拌至溶液冷却，即制备出青黄色的、最大吸收波长为420 nm的银溶胶。
（2）给石英玻璃片镀上银镜：量取1mL 2%的硝酸银溶液，加入0.1mL 10%的NaOH溶液，震荡试管看到沉淀，逐步滴入2%的氨水至沉淀恰好溶解；再加入3mL葡萄糖溶液或0.15mL甲醛，震荡后将石英玻璃片放入反应容器内，把反应容器放入55℃热水中，超声震荡反应1.5min，使石英玻璃片镀上银镜。
2、泽泻药材拉曼光谱建模步骤如下：
（1）将银溶胶与泽泻对照药材按重量比为1:1充分混合，将表面吸附了银溶胶的泽泻对照药材均匀分散在镀银镜的石英玻璃片上，再将玻璃片直接装在样品架上测定药材断面的拉曼光谱作为对照光谱；
（2）将银溶胶与待测药材按重量比为1:1充分混合后，将表面吸附了银溶胶的待测药材均匀分散在镀银镜的石英玻璃片上，再将玻璃片装在样品架上测定药材断面的拉曼光谱，与对照光谱作比较，鉴别药材饮片的真伪和品质及是否被硫熏处理的情况。
3、提取泽泻的高浓度DNA包括以下内容：
（1）配制试剂：
1）配制1mol/L的Tris-HCl：称取Tris碱6.06g，加入超纯水40mL溶解，滴加浓HCl约2.1mL调节pH至8.0，再加超纯水定容至50mL；
2）配制CTAB-free 缓冲液：配制内含Tris-HCl浓度为0.2mol/L、EDTA浓度为0.05mol/L、 NaCl浓度为0.25mol/L，内含4%巯基乙醇的溶液；
3）配制TE缓冲液：精密量取1mL 1mol/L的Tris-HCl，加入0.2mL 0.5mol/L的EDTA，加入超纯水定容至100mL。
（2）琼脂糖电泳法判定DNA的大小步骤如下：
1）称取泽泻粉末0.5g，加入4 ℃预冷的CTAB-free 缓冲液2mL，没过粉末表面，在4℃恒温冰箱内放置10min，再在4℃下7000r/min离心10min，弃上清液；
2）加入0.05g维生素C干粉末，涡旋使溶解均匀，调节pH值为6.0～6.5，得到DNA溶液；
3）在0.8%琼脂糖凝胶、1*TAE缓冲液、200V电压条件下，取5uLDNA溶液做0.8%的琼脂糖电泳，电泳30min，检查DNA的大小。
（3）紫外分光光度计判定DNA的质量，步骤如下：
1）称取泽泻粉末0.5g，加入4℃预冷的CTAB-free 缓冲液2mL，在4℃恒温冰箱内放置10min；
2）加2mL的氯仿-异戊醇（氯仿：异戊醇=24：1），轻轻颠倒混匀，4 ℃下12000r/min离心10min；
3）取上清液转移至新管，重复步骤2）；
4）取上清液转移至新管，加入2倍体积预冷的无水乙醇，常温静置5min，短暂离心，去掉上清液，用70%乙醇洗涤3次得到DNA；
5）将DNA放于通风处约10min，晾干，用1mL纯化水溶解得到DNA溶液；
6）取5uLDNA溶液用紫外分光光度计判定DNA的质量。
4、泽泻药材DNA拉曼光谱建模步骤如下：
（1）将银溶胶与泽泻对照药材DNA按重量比1:1充分混合，将表面吸附了银溶胶的泽泻对照药材DNA均匀分散在镀银镜的石英玻璃片上，再将玻璃片装在样品架上测定其拉曼光谱作为DNA对照光谱；
（2）将银溶胶与待测药材DNA按重量比1:1充分混合，取表面吸附了银溶胶的待测药材DNA均匀分散在镀银镜的石英玻璃片上，再将玻璃片装在样品架上测定药材DNA的拉曼光谱，与对照光谱DNA作比较，鉴别药材真伪及品质。
5、泽泻药材中乙酰泽泻醇B的含量测定，步骤如下：
（1）制备对照品溶液：取乙酰泽泻醇B对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1mL含20μg的溶液，即得。
（2）制备供试品溶液：取泽泻药材饮片粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙腈25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50kHz)30min，放冷，再称定重量，用乙腈补足减失的重量，摇匀，用中性7cm定量滤纸滤过，取续滤液即得。
（3）分别取乙酰泽泻醇B对照品适量，精密称定，加乙腈分别制成浓度为0.05、0.1、0.5、1、5、10、25、50、100μg/mL的溶液，将溶液分别与银溶胶按重量比1:1的比例混合，充分混合后分别取溶液各1mL，移入石英玻璃毛细管进行SERS光谱量测；以拉曼光谱强度(I)为纵坐标，浓度(C)为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。
（4）将对照品溶液与供试品溶液分别与银溶胶按重量比1:1的比例混合，充分混合后取对照品溶液与供试品溶液各1mL，分别移入石英玻璃毛细管进行SERS光谱量测：采用激光能量200mw的785nm激光源拉曼光谱对所述上机检测液进行扫描，以位移2846±2cm-l、2235±2cm-l、1392±2cm-l、904±2cm-l和593±2cm-l为判定乙酰泽泻醇B的特征峰；定量以2846±2cm-l对应峰强度进行谱图归一化，以2846±2cm-l对应峰强度进行乙酰泽泻醇B含量计算。
本发明的有益效果是：
本发明通过泽泻药材和泽泻药材DNA的拉曼光谱建模比较法鉴别泽泻药材的真伪，并采用表面增强拉曼光谱法测定泽泻药材中乙酰泽泻醇B的含量。本发明可以准确地鉴别出药材饮片的真伪和品质及是否被硫熏处理的情况，可以快速有效地实现泽泻药材中乙酰泽泻醇B含量的快速、低成本、环保地检测，减少对泽泻样本进行复杂的前处理以及化学分析，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，在快速获取泽泻药材中乙酰泽泻醇B成分的信息的同时，提高了测量的准确率。本发明采用表面增强拉曼法，克服了拉曼光谱灵敏度低的缺点，获得了常规拉曼光谱所不易得到的结构信息，使被吸附的样品其拉曼光谱的强度提高103-106倍。由于仅有金、银、铜三种金属和少数极不常用的碱金属(如锂、钠等) 具有强的SERS 效应，本申请人还对金溶胶和银溶胶进行了比较，发现银溶胶的增强效果较好，因此选择了银溶胶作为本发明的拉曼光谱信号表面增强剂。
附图说明
图1为DNA Marker图，图中1表示BM2000+、2表示DL500、3表示MD114、4表示泽泻药材饮片、5表示泽泻标准药材；
图2为泽泻药材DNA拉曼光谱图，图中1表示对照药材DNA光谱、2表示被测药材饮片DNA光谱；
图3为泽泻药材中乙酰泽泻醇B拉曼光谱图，图中1表示非泽泻药材饮片提取物光谱、2表示泽泻标准对照药材提取物光谱、3表示泽泻经硫熏处理饮片提取物光谱、4表示泽泻饮片提取物光谱。
具体实施方式
为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。
实施例1
一种泽泻药材的鉴别和质量检测方法包括以下内容：
1、制备银溶胶并给石英玻璃片镀上银镜：
（1）制备银溶胶：称取18 mg硝酸银固体溶解在100 mL水中(浓度：1×10-3mol/L)，加热到沸腾(95-100℃)；然后向沸腾的硝酸银溶液中逐滴加入新配置的重量含量为1％的柠檬酸三钠溶液5mL；保持沸腾状态约30min后，继续搅拌至溶液冷却，即制备出青黄色的、最大吸收波长为420 nm的银溶胶。
（2）给石英玻璃片镀上银镜：量取1mL 2%的硝酸银溶液，加入0.1mL 10%的NaOH溶液，震荡试管看到沉淀，逐步滴入2%的氨水至沉淀恰好溶解；再加入3mL葡萄糖溶液或0.15mL甲醛，震荡后将石英玻璃片放入反应容器内，把反应容器放入55℃热水中，超声震荡反应1.5min，使石英玻璃片镀上银镜。
2、泽泻药材拉曼光谱建模步骤如下：
（1）将银溶胶与泽泻对照药材按重量比为1:1充分混合，将表面吸附了银溶胶的泽泻对照药材均匀分散在镀银镜的石英玻璃片上，再将玻璃片直接装在样品架上测定药材断面的拉曼光谱作为对照光谱；
（2）将银溶胶与待测药材按重量比为1:1充分混合后，将表面吸附了银溶胶的待测药材均匀分散在镀银镜的石英玻璃片上，再将玻璃片装在样品架上测定药材断面的拉曼光谱，与对照光谱作比较，鉴别药材饮片的真伪、品质及是否被硫熏处理情况。
3、提取泽泻的高浓度DNA包括以下内容：
（1）配制试剂：
1）配制1mol/L的Tris-HCl：称取Tris碱6.06g，加入超纯水40mL溶解，滴加浓HCl约2.1mL调节pH至8.0，再加超纯水定容至50mL；
2）配制CTAB-free 缓冲液：配制内含Tris-HCl浓度为0.2mol/L、EDTA浓度为0.05mol/L、 NaCl浓度为0.25mol/L，内含4%巯基乙醇的溶液；
3）配制TE缓冲液：精密量取1mL 1mol/L的Tris-HCl，加入0.2mL 0.5mol/L的EDTA，加入超纯水定容至100mL。
（2）琼脂糖电泳法判定DNA的大小步骤如下：
1）称取泽泻粉末0.5g两份，各加入4 ℃预冷的CTAB-free 缓冲液2mL，没过粉末表面，在4℃恒温冰箱内放置10min，再在4℃下7000r/min离心10min，弃上清液；
2）加入0.05g维生素C干粉末，涡旋使溶解均匀，调节pH值为6.0～6.5，得到DNA溶液；
3）在0.8%琼脂糖凝胶、1*TAE缓冲液、200V电压条件下，取5uLDNA溶液做0.8%的琼脂糖电泳，电泳30min，检查DNA的大小，平行测定两次，结果见图1。
（3）紫外分光光度计判定DNA的质量，步骤如下：
1）称取泽泻粉末0.5g两份，各加入4℃预冷的CTAB-free 缓冲液2mL，在4℃恒温冰箱内放置10min；
2）各加2mL的氯仿-异戊醇（氯仿：异戊醇=24：1），轻轻颠倒混匀，4 ℃下12000r/min离心10min；
3）取上清液转移至新管，重复步骤2）；
4）取上清液转移至新管，加入2倍体积预冷的无水乙醇，常温静置5min，短暂离心，去掉上清液，用70%乙醇洗涤3次得到DNA；
5）将DNA放于通风处约10min，晾干，每份用1mL纯化水溶解得到DNA溶液；
6）取5uLDNA溶液用紫外分光光度计判定DNA的质量，平行测定两次。
4、泽泻药材DNA拉曼光谱建模步骤如下：
（1）将银溶胶与泽泻对照药材DNA按重量比1:1充分混合，将表面吸附了银溶胶的泽泻对照药材DNA均匀分散在镀银镜的石英玻璃片上，再将玻璃片装在样品架上测定其拉曼光谱作为DNA对照光谱；
（2）将银溶胶与待测药材DNA按重量比1:1充分混合，取表面吸附了银溶胶的待测药材DNA均匀分散在镀银镜的石英玻璃片上，再将玻璃片装在样品架上测定药材DNA的拉曼光谱，与对照光谱DNA作比较，鉴别药材真伪及品质，见图2。
5、泽泻药材中乙酰泽泻醇B的含量测定，步骤如下：
（1）制备对照品溶液：取乙酰泽泻醇B对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1mL含20μg的溶液，即得。
（2）制备供试品溶液：取泽泻药材饮片粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙腈25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50kHz)30min，放冷，再称定重量，用乙腈补足减失的重量，摇匀，用中性7cm定量滤纸滤过，取续滤液即得。
（3）分别取乙酰泽泻醇B对照品适量，精密称定，加乙腈分别制成浓度为0.05、0.1、0.5、1、5、10、25、50、100μg/mL的溶液，将溶液分别与银溶胶按重量比1:1的比例混合，充分混合后分别取溶液各1mL，移入石英玻璃毛细管进行SERS光谱量测；以拉曼光谱强度(I)为纵坐标，浓度(C)为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程为：I=3786.95C-165.33，r2=0.9802。结果表明乙酰泽泻醇B在5-100μg·mL-l浓度范围呈良好线性关系。
（4）将对照品溶液与供试品溶液分别与银溶胶按重量比1:1的比例混合，充分混合后取对照品溶液与供试品溶液各1mL，分别移入石英玻璃毛细管进行SERS光谱量测：采用激光能量200mw的785nm激光源拉曼光谱对所述上机检测液进行扫描，以位移2846±2cm-l、2235±2cm-l、1392±2cm-l、904±2cm-l和593±2cm-l为判定乙酰泽泻醇B的特征峰；定量以2846±2cm-l对应峰强度进行谱图归一化，以2846±2cm-l对应峰强度进行乙酰泽泻醇B含量计算。光谱图见图3，所检测的不同产地的泽泻药材中乙酰泽泻醇B含量测定结果见下表：
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Claims (3)

1.一种泽泻药材的鉴别和质量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下内容：
（1）泽泻药材拉曼光谱建模步骤如下：
1）将银溶胶与泽泻对照药材按重量比为1:1充分混合，将表面吸附了银溶胶的泽泻对照药材均匀分散在镀银镜的石英玻璃片上，再将玻璃片直接装在样品架上测定药材断面的拉曼光谱作为对照光谱；
2）将银溶胶与待测药材按重量比为1:1充分混合后，将表面吸附了银溶胶的待测药材均匀分散在镀银镜的石英玻璃片上，再将玻璃片装在样品架上测定药材断面的拉曼光谱，与对照光谱作比较，鉴别药材饮片的真伪和品质及是否被硫熏处理的情况；
（2）泽泻药材DNA拉曼光谱建模步骤如下：
1）提取泽泻的高浓度DNA，并分别用0 .8%琼脂糖电泳和紫外分光光度计判定DNA的大小和DNA的质量；
2）将银溶胶与泽泻对照药材DNA按重量比1:1充分混合，将表面吸附了银溶胶的泽泻对照药材DNA均匀分散在镀银镜的石英玻璃片上，再将玻璃片装在样品架上测定其拉曼光谱作为DNA对照光谱；
3）将银溶胶与待测药材DNA按重量比1:1充分混合，取表面吸附了银溶胶的待测药材DNA均匀分散在镀银镜的石英玻璃片上，再将玻璃片装在样品架上测定药材DNA的拉曼光谱，与对照光谱DNA作比较，鉴别药材真伪及品质；
（3）泽泻药材中乙酰泽泻醇B的含量测定，步骤如下：
1）制备对照品溶液：取乙酰泽泻醇B对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1mL含20μg的溶液，即得；
2）制备供试品溶液：取泽泻药材饮片粉末0 .5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙腈25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用乙腈补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液即得；
3）分别取乙酰泽泻醇B对照品适量，精密称定，加乙腈分别制成浓度为0 .05、0 .1、0.5、1、5、10、25、50、100μg/mL的溶液，将溶液分别与银溶胶按重量比1:1的比例混合，充分混合后分别取溶液各1mL，移入石英玻璃毛细管进行SERS光谱量测；以拉曼光谱强度(I)为纵坐标，浓度(C)为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程；
4）将对照品溶液与供试品溶液分别与银溶胶按重量比1:1的比例混合，充分混合后取对照品溶液与供试品溶液各1mL，分别移入石英玻璃毛细管进行SERS光谱量测；计算待测药材中乙酰泽泻醇B含量；
所述银溶胶的制备步骤如下：
制备浓度为1×10-3mol/L的硝酸银溶液，加热到沸腾；然后向沸腾的硝酸银溶液中逐滴加入新配置的重量含量为1%的柠檬酸三钠溶液5mL；保持沸腾状态30min后，继续搅拌至溶液冷却，即得青黄色的、最大吸收波长为420 nm的银溶胶。
2.根据权利要求1所述泽泻药材的鉴别和质量检测方法，其特征在于，所述镀银镜的石英玻璃片的制作步骤如下：
量取1mL 2%的硝酸银溶液，加入0 .1mL 10%的NaOH溶液，震荡试管看到沉淀，逐步滴入2%的氨水至沉淀恰好溶解；再加入3mL葡萄糖溶液或0 .15mL甲醛，震荡后将石英玻璃片放入反应容器内，把反应容器放入55℃热水中，超声震荡反应1 .5min，使石英玻璃片镀上银镜。
3.根据权利要求1所述泽泻药材的鉴别和质量检测方法，其特征在于，所述泽泻药材DNA拉曼光谱建模步骤1）的具体步骤如下：
（1）配制试剂：
1）配制1mol/L的Tris-HCl：称取Tris碱6 .06g，加入超纯水40mL溶解，滴加浓HCl调节pH至8 .0，再加超纯水定容至50mL；
2）配制CTAB-free 缓冲液：配制内含Tris-HCl浓度为0 .2mol/L、EDTA浓度为0.05mol/L、 NaCl浓度为0 .25mol/L，内含4%巯基乙醇的溶液；
3）配制TE缓冲液：精密量取1mL 1mol/L的Tris-HCl，加入0 .2mL 0 .5mol/L的EDTA，加入超纯水定容至100mL；
（2）琼脂糖电泳法判定DNA的大小步骤如下：
1）称取泽泻粉末0 .5g，加入4 ℃预冷的CTAB-free 缓冲液2mL，没过粉末表面，在4℃恒温冰箱内放置10min，再在4℃下7000r/min离心10min，弃上清液；
2）加入0 .05g维生素C干粉末，涡旋使溶解均匀，调节pH值为6 .0～6 .5，得到DNA溶液；
3）在0 .8%琼脂糖凝胶、1*TAE缓冲液、200V电压条件下，取5uLDNA溶液做0 .8%的琼脂糖电泳，时间为30min，检查DNA的大小；
（3）紫外分光光度计判定DNA的质量，步骤如下：
1）称取泽泻粉末0 .5g，加入4℃预冷的CTAB-free 缓冲液2mL，在4℃恒温冰箱内放置10min；
2）加2mL的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀，4℃下12000r/min离心10min；
3）取上清液转移至新管，重复步骤2）；
4）取上清液转移至新管，加入2倍体积预冷的无水乙醇，常温静置5min，短暂离心，去掉上清液，用70%乙醇洗涤3次得到DNA；
5）将DNA放于通风处晾干，用1mL纯化水溶解得到DNA溶液；
6）取5uLDNA溶液用紫外分光光度计判定DNA的质量。
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