CN103760278B - 一种同时定量检测水辣蓼中六种黄酮类成分的高效液相色谱方法 - Google Patents

一种同时定量检测水辣蓼中六种黄酮类成分的高效液相色谱方法 Download PDF

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Abstract

本发明建立了同时定量检测水辣蓼中六种黄酮类成分的高效液相色谱方法，方法选用Waters色谱柱，选定甲醇和0.4%甲酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱，流动相的流速为1ml/min，分为3个梯度洗脱，3个梯度的甲醇和0.4%甲酸水溶液的体积比例分别为45：55，55:45，70:30，将洗脱物分别在359nm处进行紫外检测，确定各组分的浓度。本方法准确、简便，重复性好，可用于水辣蓼中芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素和山奈酚的含量测定，为控制水辣蓼药材的质量提供依据。

Description

一种同时定量检测水辣蓼中六种黄酮类成分的高效液相色谱方法
技术领域
本发明涉及黄酮检测领域，更具体地，涉及一种同时定量检测水辣蓼中六种黄酮类成分的高效液相色谱方法。
背景技术
水辣蓼为蓼科植物水辣蓼(PolygonumhydropiperLinn.)的全草，别名柳草、蓼子草、斑蕉草、蝙蝠草等。全草均可入药，水辣蓼味辛，温；具有祛风利湿，散淤止痛，解毒消肿，杀虫止痒等功效；主要用于痢疾、肠胃炎、腹泻、风湿关节痛、跌打肿痛、功能性子宫出血；外用治毒蛇咬伤、皮肤湿疹等症状。
黄酮的种类很多，其各自的功效也不尽相同，因此了解水辣蓼中不同黄酮类有效成分的含量能精确定位到不同的黄酮种类与疗效之间的关系，有助于了解其与药效学之间的联系。黄酮类化合物的分析方法一般分为分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、超临界流体色谱法、薄层扫描法等。分光光度法的原理是利用黄酮类化合物结构上的还原性基团与金属盐试剂形成有色配合物，在特定的波长处测定配合物的吸光度，从而计算其浓度与含量。其优点是设备简单，操作简便，但样品未经分离纯化，受色素和酚性成分的干扰较大，结果往往高于实际含量。毛细管电泳法具有快速、高效、经济、微量、多模式等优点；同时由于进样量少，因而制备能力差，且毛细管直径小，使光路太短，用一些检测方法（如紫外吸收光谱法）时，灵敏度较低，电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性。在黄酮类化合物的分离中，主要采用的方法是毛细管区域电泳(CZE)。薄层扫描法（TLCS）又称原位定量波层色谱扫描法（QTLC）系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品定性定量的分析方法。样品经薄层层析分离后，直接在薄层扫描仪上，在选定波长处扫描，得到薄层斑点的面积积分值，由回归方程计算含量。该法不受其他成分干扰，方法简便、准确。缺点是不够灵敏，对生物高分子的分离效果不甚理想。
高效液相色谱法(HPLC)在分析中，以C18柱与C8柱最为常用，柱内填充粒径以10um和5um用的最多。其固液色谱法的原理是根据固定相对被测组分的吸附力大小不同而进行分离，分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。由于黄酮类化合物常带有酚羟基，在水中会部分解离，而未解离的羟基与固定相作用较强，从而导致拖尾现象，所以黄酮类化合物的HPLC法中需要加入酸来调节pH值，以抑制解离减少拖尾现象。HPLC法相对干扰少，分离效能高，灵敏度高，重现性好，测定结果更为精确可靠，但仪器设备较贵，且无法检测中药总黄酮的含量。
发明内容
为了弥补现有技术检测水辣蓼中的黄酮的空白，本发明首先提供一种同时定量检测水辣蓼中六种黄酮类成分的高效液相色谱方法，选用Waters色谱柱，选定甲醇和0.4%甲酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱，流动相的流速为1ml/min，分为3个梯度洗脱，3个梯度的甲醇和0.4%甲酸水溶液的体积比例分别为45：55，55:45，70:30，将洗脱物分别在359nm处进行紫外检测，确定各组分的浓度。
所述的六种黄酮类成分为芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素和山奈酚。
所述的梯度洗脱的程序包括以下5个洗脱过程。
所述的Waters色谱柱为WatersSymmetryshieldRP185.0μm4.6mmx250mmColumn。
所述的芦丁在10.5~11.5Min处洗脱获得，金丝桃苷在11.8~12.8Min处洗脱获得，槲皮苷在16.5~17.5Min处洗脱获得，槲皮素在30.5~31.5Min处洗脱获得，异鼠李素在38.5~39.5Min处洗脱获得，山奈酚在40.0~41.0Min处洗脱获得。本发明的优点在于，建立了一种同时检测水辣蓼中的六种黄酮的方法，填补了现有技术的空白，提高了水辣蓼的检测效率，为水辣蓼的产品质量控制提供了更好的解决方法。
附图说明
图1为10ug/ml混合对照品溶液的色谱图。
图2为芦丁等六种对照品的峰面积标准曲线图。
图3为芦丁等六种对照品的峰高标准曲线图。
图4为7种辣蓼样品中六种黄酮含量测定结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
实施例1方法的有效性测试
对照品的配制：精密称取芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚对照品各10mg分别置于10ml容量瓶中，用甲醇定容到10ml，摇匀，配制成1mg/ml的储备液，备用。分别取六种储备液0.5ml置于25ml容量瓶中，得到20.0ug/ml的混合标准溶液，再经稀释后得到10.0，5.0，1.0，0.1ug/ml的混合标准溶液。供试品的制备：水辣蓼粉碎，过20目筛，加10倍量的甲醇，称重并记录数据，超声40min后，称重并用甲醇补足至先前重量，过滤，取续滤液备用。在最适波长359nm处使用高效液相色谱紫外检测器检测，10ug/ml混合对照品的色谱图如图1。
从对照品的色谱图可以看出，六种对照品的图谱峰形都很好，峰尖且锐，没有前沿和拖尾现象，达到基线分离，因此可以同时采用峰面积和峰高定量。以峰面积为纵坐标，浓度C为横坐标，做线性回归，得到六种对照品的标准曲线如图2所示。以峰高为纵坐标，浓度C为横坐标，做线性回归，得到六种对照品的标准曲线如图3。
从图2得出：
芦丁y=18449x+2208R2=0.9995，
金丝桃苷y=25883x+1293.5R2=1，
槲皮苷y=20592x+1611.4R2=0.9998，
槲皮素y=35394x+0.5251R2=1，
异鼠李素y=40021x+302.75R2=0.9999，
山奈酚y=41012x+3483.3R2=0.9998。
从图3得出
芦丁y=770.47x+86.992R2=0.9996，
金丝桃苷y=1197.4x+83.509R2=1，
槲皮苷y=959.05x+92.694R2=0.9998，
槲皮素y=1517.3x-42.411R2=0.9999，
异鼠李素y=2072.1x-25.497R2=1，
山奈酚y=2115.7x+113.18R2=0.9999。
以上证明六种对照品在0.1ug/ml~20ug/ml范围内线性关系良好。
实施例2加样回收率实验测试本方法的有效性。
精密称取5份已知含量的水辣蓼粉末1.00g。每份加入芦丁1.0mg、金丝桃苷0.5mg、槲皮苷0.17mg、槲皮素0.5mg、异鼠李素0.05mg、山奈酚0.5mg，按“线性关系”项下的操作进行提取。回收率%=(实测值-供试品所含被测成分量)/加入对照品量*100%。所述的结果如表1~表6所示。
表1水辣蓼中芦丁回收率测定结果
表2水辣蓼中金丝桃苷回收率测定结果
表3水辣蓼中槲皮苷回收率测定结果
表4水辣蓼中槲皮素回收率测定结果
表5水辣蓼中异鼠李素回收率测定结果
表6水辣蓼中山奈酚回收率测定结果
以上的实验证明，本发明的方法，分离度良好，得出的结果符合使用标准。
实施例3本发明的方法应用
采用本发明的方法，对7个不同产地和批次的辣蓼进行黄酮类成分含量的测定，测定结果如表7所示：
表7辣蓼样品中六种黄酮含量测定结果
注：“—”为未检测到该物质。
根据表7的测试结果，制作图4，分析测试结果表明六种物质在不同辣蓼中含量差异很大。总体而言，辣蓼中主要含有芦丁、金丝桃苷和槲皮素三种黄酮，产地和采摘月份不同，会影响其在药材中的含量；而山奈酚、异鼠李素含量较低，个别产地甚至检测不到相关成分；槲皮素含量差异最为显著，其中广东清远的辣蓼中槲皮素含量明显高于其他产地。因此认为不同产地和不同采摘月份的原材料对试验的影响较大，所以本实例选择了已有样品中总黄酮含量最高的辣蓼，即采集地为广东茂名，批次为201302，另外在处理辣蓼样品时采取整根粉碎过20目筛取样的方法，而且每批样品测定五次后取平均值，这就保证了取样的均衡性，使得到的数据更加可靠。
辣蓼药用资源丰富，为民间常用中草药，然而辣蓼的产地与采摘月份对其有效成分的含量影响显著，这就需要有一个合适的质量标准来规范辣蓼药材的品质，因此本实例测定了辣蓼中六种黄酮类成分的含量，由此可严格控制辣蓼的质量。黄酮类成分具有镇痛、消炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性，但黄酮类物质种类繁多，且不同的黄酮类成分具有的生物活性不同，治疗的疾病也不同，因此本发明有助于规范芦丁等六种黄酮成分对药效学的影响，可得到相应的量效关系。除原材料外，本发明对辣蓼相关的成品、半成品等的质量控制，也很有意义。

Claims (3)

1.一种同时定量检测水辣蓼中六种黄酮类成分的高效液相色谱方法，其特征在于，样品制备为将水辣蓼粉碎，过20目筛，加10倍量的甲醇，称重并记录数据，超声40min后，称重并用甲醇补足至先前重量，过滤，取续滤液备用，仪器条件为选用Waters色谱柱，选定甲醇和0.4%甲酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱，流动相的流速为1ml/min，分为3个梯度洗脱，3个梯度的甲醇和0.4%甲酸水溶液的体积比例分别为45：55，55:45，70:30，将洗脱物分别在359nm处进行紫外检测，确定各组分的浓度；
所述的六种黄酮类成分为芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素和山奈酚；
所述的梯度洗脱的程序包括以下5个洗脱过程，
第一阶段：初始阶段，设置流速1.00ml/min，其中甲醇和0.4%甲酸水溶液的体积比例为45:55；第二阶段：采用流动相洗脱15min，流速1.00ml/min，其中甲醇和0.4%甲酸水溶液的体积比例为55:45；第三阶段：采用流动相洗脱20min，流速1.00ml/min，其中甲醇和0.4%甲酸水溶液的体积比例为55:45；
第四阶段：采用流动相洗脱45min，流速1.00ml/min，其中甲醇和0.4%甲酸水溶液的体积比例为70:30；
第五阶段：采用流动相洗脱50min，流速1.00ml/min，其中甲醇和0.4%甲酸水溶液的体积比例为45:55。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Waters色谱柱为WatersSymmetryshieldRP185.0μm4.6mmx250mmColumn。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的芦丁在10.5~11.5Min处洗脱获得，金丝桃苷在11.8~12.8Min处洗脱获得，槲皮苷在16.5~17.5Min处洗脱获得，槲皮素在30.5~31.5Min处洗脱获得，异鼠李素在38.5~39.5Min处洗脱获得，山奈酚在40.0~41.0Min处洗脱获得。
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