CN108333267A - 利用高效液相色谱测定铭复乐中精氨酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及利用高效液相色谱测定铭复乐中精氨酸含量的方法。其色谱条件为：色谱柱：C8柱；流动相：0.05mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝(20～60)：(30～80)；检测波长：200～220mm；柱温：30～35℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl。本发明方法特别适用于测定铭复乐中精氨酸含量，其无需柱前/柱后衍生化，且具有准确度、精密度高、重复性良好、线性范围宽等特点，为铭复乐产品制定了一个科学、严格的内控标准，提高了铭复乐产品的质量。

Description

利用高效液相色谱测定铭复乐中精氨酸含量的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及利用高效液相色谱测定铭复乐中精氨酸含量的方法。

背景技术

TNK-tPA是迄今为止最安全有效且使用最方便的溶栓药，国内上市的第一代重组天然tPA类产品，完全依赖进口，商品名“爱通立”， 50mg/支，售价高达5717元。而采用大肠杆菌表达的第二tPA类产品，即瑞替普酶，由山东阿华生产的“瑞通立”和北京爱德药业开发的“派通欣”分别于2007年和2010年获准上市。而铭复乐是广州铭康生物工程有限公司生产的第三代tPA类产品，是目前唯一可以单次静脉推注的溶栓药品种，其具有一针救命，使用方便的特点，更加适合急救，使得溶栓治疗在院外进行成为可能，具有划时代的意义。而为了提高铭复乐的质量标准，极其需要建立制剂中辅料精氨酸含量的检验方法和控制要求。

对于精氨酸含量的检测，2010版《中国药典》中公开了采用电位滴定法测定精氨酸的含量、采用旋光法测定盐酸精氨酸注射液中精氨酸的含量，但由于本品中精氨酸是作为辅料，含量较低，且存在主药和其他辅料的影响，故不宜采用电位滴定法或旋光法测定精氨酸的含量。

现有技术中公开了众多测定注射制剂中氨基酸的含量的方法，如张彦文，张庆伟利用C18色谱柱测定了脑蛋白水解物注射液中各游离氨基酸的含量《脑蛋白水解物注射液的质量评价》。还有文献报道采用离子色谱法、氨基键合硅胶填充柱对注射制剂中氨基酸的含量进行检测，但均存在线性范围窄、图谱峰型较差、出峰时间短等问题。也有部分报道采用反相柱(C18、C8柱)柱前或柱后衍生化的方法，将其与衍生化实际反应后生成有紫外吸收的物质进行检测(脑蛋白水解物注射液中氨基酸含量测定分析方法，龚继华，张泽辛，邱德清)，但是又存在重复性和准确度不够，操作繁琐，检测设备要求高等缺点。更重要的是，上述方法涉及的均是对多种氨基酸含量的测定，而各个氨基酸之间的性质差异较大，上述方法极其有可能不适合用于铭复乐中精氨酸含量的检测。

因此，针对上述问题，为了提高铭复乐制剂的质量，亟需提供一种特别适用于检测铭复乐制剂中精氨酸含量的检测方法，且该方法具备准确度和精密度高、线性范围宽，重复性良好的特点。

发明内容

本发明旨在提供利用高效液相色谱测定铭复乐中精氨酸含量的方法，该方法特别适于检测铭复乐中精氨酸的含量，无需柱前/柱后衍生化，具有准确度和精密度高、线性范围宽，重复性良好的优点。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：利用高效液相色谱测定铭复乐中精氨酸含量的方法，其色谱条件为：

色谱柱：C8丙烯酰胺键合硅胶柱，5μm，100A，4.6×250mm；

流动相：0.05mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝(20～60)：(30～80)；

检测波长：200～220mm；

柱温：30～35℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：10μl。

进一步地，所述铭复乐中精氨酸含量为165±0.1～0.5mg。

进一步地，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.0～8.0。

进一步地，所述流动相为磷酸二氢钾溶液：乙腈＝(20～50)： (40～80)，以体积份数计。

进一步地，所述流动相为磷酸二氢钾溶液：乙腈＝40：60，以体积份数计。

进一步地，所述检测波长为208mm。

进一步地，所述柱温为30℃。

进一步地，还包括以下步骤：

A)将样品溶解；

B)将溶解后的样品溶液注入高效液相色谱仪；

C)记录色谱图，根据外标法计算样品中精氨酸的含量。

进一步地，色谱条件为：

色谱柱：C8丙烯酰胺键合硅胶柱；

流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液：乙腈＝40：60，以体积份数计；

检测波长：208mm；

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：10μl。

本发明具有以下优点：

本发明提供了一种特别适用于准确测定铭复乐中精氨酸含量的方法，其采用C8丙烯酰胺键合硅胶柱，通过对各参数进行调整，实现了对铭复乐中精氨酸含量的准确测定。其无需柱前/柱后衍生化，且其检测专属性、重复性、线性范围、精密度等均通过了验证，为铭复乐产品制定了一个科学、严格的内控标准，提高了铭复乐产品的质量。

附图说明

图1显示了实施例1测试方法测试铭复乐供试样品的HPLC图；

图2显示了实施例1测试方法测试相同浓度的精氨酸标准品的 HPLC图；

图3显示了磷酸二氢钾溶液与乙腈的比例为50:50的HPLC图；

图4显示了磷酸二氢钾溶液与乙腈的比例为60:80的HPLC图；

图5显示了检测波长为220mm的HPLC图；

图6显示了检测波长为200mm的HPLC图；

图7显示了磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠溶液的HPLC图；

图8显示了磷酸二氢钾溶液pH为6.0的HPLC图；

图9显示了磷酸二氢钾溶液pH为5.5的HPLC图；

图10显示了流速为0.5ml/min的HPLC图；

图11显示了磷酸二氢钾溶液与乙腈的比例为60：40的HPLC图；

图12显示了采用C18柱检测铭复乐供试样品的HPLC图；

图13为标准曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

本文中所述“铭复乐”为广州铭康生物工程有限公司生产，规格为16mg/瓶(以活性成分计)。

实施例1、铭复乐中精氨酸含量的测定方法

色谱条件：

色谱柱：C8丙烯酰胺键合硅胶柱；

流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液：乙腈＝40：60，pH为7.0，以体积份数计；

检测波长：208mm；

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：10μl。

测定步骤：取供试样品1瓶按标示量复溶后用流动相稀释10倍和标准品(约1.375g)加入流动相溶解，得供试样品溶液和标准品溶液，各取10μl，分别注入高效液相色谱仪，记录供试样品色谱图(图1)和标准品色谱图(图2)，按照外标法以峰面积计算即得。从图1 可知，精氨酸与其他成分有良好的分离度，不对称性和拖尾因子等系统适应性基本符合药典的要求；从图2可看出，供试样品中精氨酸的保留时间与标准品一致。

实施例2、铭复乐中精氨酸含量的测定方法

实施例2中所述流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液：乙腈＝50： 50，其余参数及操作如实施例1所示。

测定步骤如实施例1所示，测定结果图3所示。从图中可以看出，改变了磷酸二氢钾溶液与乙腈的比例，出峰时间缩短，但有拖尾现象，且杂质峰较多。

实施例3、铭复乐中精氨酸含量的测定方法

实施例3中所述流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液：乙腈＝60： 80，其余参数及操作如实施例1所示。

测定步骤如实施例1所示，测定结果如图4所示。从图中可以看出，改变了磷酸二氢钾溶液与乙腈的比例导致峰型不好，有拖尾现象，且分离效果较差，杂质峰较多。

实施例4、铭复乐中精氨酸含量的测定方法

实施例4中所述检测波长为220mm，其余参数及操作如实施例1 所示，测定结果如图5所示。从图中可以看出，改变了检测波长导致峰型较差，有拖尾现象。

实施例5、铭复乐中精氨酸含量的测定方法

实施例5中所述检测波长为200mm，其余参数及操作如实施例1 所示，测定结果如图6所示。从图中可以看出，改变了波长，出峰时间缩短，但分离效果较差，且杂质峰较多，需要继续优化。

实施例6、铭复乐中精氨酸含量的测定方法

实施例6中用磷酸二氢钠溶液代替磷酸二氢钾溶液，其余参数及操作如实施例1所示，测定结果如图7所示。从图中可以看出，改变了缓冲液，导致出峰时间延长，与杂质峰分离效果较差，有拖尾现象，且峰型不好。

实施例7、铭复乐中精氨酸含量的测定方法

实施例7中所述磷酸二氢钾溶液的pH为6.0，其余参数及操作如实施例1所示，测定结果如图8所示。从图中可以看出，改变了流动相的pH，导致出峰时间较慢，但差别不大。

实施例8、铭复乐中精氨酸含量的测定方法

实施例8中所述磷酸二氢钾溶液的pH为5.5，其余参数及操作如实施例1所示，测定结果如图9所示。从图中可以看出，改变了流动相的pH，导致出峰时间延长。

实施例9、铭复乐中精氨酸含量的测定方法

实施例9中流速为0.5ml/min，其余参数及操作如实施例1所示，测定结果如图10所示。从图中可以看出，改变了流速，导致出峰时间明显延长。

对比例1、铭复乐中精氨酸含量的测定方法

对比例1中所述流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液：乙腈＝60： 40，其余参数及操作如实施例1所示，测定结果如图11所示。从图中可以看出，流动相的比例变成60:40，导致与杂质峰分离效果较差，拖尾现象严重，且杂质峰较多。

对比例2、铭复乐中精氨酸含量的测定方法

对比例2中，所述色谱柱为C18柱，其余参数及操作如实施例1 所示。测定步骤如实施例1所示，测定结果如图12所示。结果显示，采用C18色谱柱检测，出峰时间明显延长，且有杂质峰。

试验一、性能考察

1.1线性关系考察

取精氨酸样品，加入流动相分别稀释成2.75mg/ml(50％)， 4.4mg/ml(80％)，4.95mg/ml(90％)，5.5mg/ml(100％)，6.05mg/ml (110％)、6.6mg/ml(120％)，8.25mg/ml(150％)，采用高效液相色谱仪，按实施例1所述色谱条件进行检测，并依次记录相应的峰面积，以峰面积为(Y)纵坐标，其浓度(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程y＝993892.1x+1247805，R＝0.9995，即浓度在2.75-8.25mg/ml 之内，精氨酸的含量与峰面积呈良好的线性关系，测试数据如表1所示，标准曲线图如图13所示。

表1精氨酸标准曲线数据

1.2准确度和精密度考察

取精氨酸样品，加入流动相稀释成浓度为4.4mg/ml(80％)、 5.5mg/ml(100％)、6.6mg/ml(120％)的供试品溶液(设定3个浓度点，共9个样品溶液)，注入高效液相色谱仪中，按实施例1所述条件进行检测，分别重复进样3次，计算回收率和相对偏差(RSD)，结果如表2所示。

表2试验结果

由上表可知，本发明所述检测体系具有良好的线性关系，线性范围宽，在2.75-8.25mg/ml之内，精氨酸的含量与峰面积呈良好的线性关系，且准确度高，RSD为2.0％，与现有技术取得了显著的进步。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.利用高效液相色谱测定铭复乐中精氨酸含量的方法，其特征在于，其色谱条件为：

色谱柱：C8丙烯酰胺键合硅胶柱；

流动相：0.05mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝(20～60)：(30～80)；

检测波长：200～220mm；

柱温：30～35℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：10μl。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每瓶所述铭复乐中精氨酸含量为165±0.1～0.5mg。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.0～8.0。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相为磷酸二氢钾溶液：乙腈＝(20～50)：(40～80)，以体积份数计。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动相为磷酸二氢钾溶液：乙腈＝40：60，以体积份数计。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测波长为208mm。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柱温为30℃。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：

A)将样品用流动相溶解，得样品溶液；

B)上述样品溶液注入高效液相色谱仪；

C)记录色谱图，根据外标法计算样品中精氨酸的含量。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其色谱条件为：

色谱柱：C8丙烯酰胺键合硅胶柱；

流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液：乙腈＝40：60，以体积份数计；

检测波长：208mm；

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：10μl。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述磷酸氢二钾溶液的pH为6.0～8.0。