CN110487949A

CN110487949A - 一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法

Info

Publication number: CN110487949A
Application number: CN201910938473.9A
Authority: CN
Inventors: 范治平; 程萍; 李宁; 韩军; 王正平
Original assignee: Liaocheng University
Current assignee: Liaocheng University
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2019-11-22

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法，其包括如下步骤：取葡萄糖酸钙片对照品和葡萄糖酸钙自制片，加水溶解并定量稀释分别制成对照品溶液；量取对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度的对数值对相应的峰面积的对数值计算线性回归方程。本发明解决了现有药典检测方法取样点多、检测时间长、重复性差及准确度低的技术缺点，可用于葡萄糖酸钙片及含葡萄糖酸钙成分的部分复方药溶出曲线的测定。

Description

一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法。

背景技术

钙是生物体的必需元素，与身体的生理活动密切相关。在人体肌肉组织、神经组织、体液和骨骼中，均有大量与钙密切结合的蛋白质。它也是实现人体机能，如神经传递、肌肉收缩、血液凝结、激素释放和乳汁分泌等活动所必需的有机质。钙的缺乏常会引起多种钙缺乏症，如佝偻病、骨质疏松、骨发育不全等等病症，而葡萄糖酸钙片则是对以上病症进行治疗及预防的有效药物。葡萄糖酸钙片是NMPA在20l6年第l06号公告附件中公布的“2018年底前须完成仿制药一致性评价品种目录”（常简称“289目录”）中的第44号品种。根据20l7年8月21日发布的“关于企业开展289日录内仿制药质量和疗效一致性评价基本情况信息”的统计汇总，截至2017年5月国内持有文号的生产企业总量为88家，经摸底调研确定不放弃评价的企业数量为48家，约占55%，已开展评价的企业数量为20家，约占42%，可见该种药物的研发需求及市场广阔，因此开发准确、快捷及实用性强的检测方法具有重要意义。

葡萄糖酸钙片原质量标准采用原子吸收分光光度法对药物溶出度进行控制（《中国药典》2015年版二部）。对于片剂溶出曲线的检测，通常所需检测点较多，时间较长，如果采用原子吸收分光光度法，常存在干扰因素多，稳定性差等缺点，很难满足检测要求。原质量标准采用滴定法对片剂含量进行控制（《中国药典》2015年版二部），而传统滴定法检测中，由于药物溶出浓度较低、显色不明显，肉眼很难判断滴定终点且重复性差，测定值与实际值常存在较大误差。因此，滴定法检测片剂溶出曲线的适用性也不理想。不仅如此，现行其他多国药典检测方法也较为滞后，为满足葡萄糖酸钙片开发过程中溶出曲线的检测需求，急需开发出一种HPLC测定其溶出曲线的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供与现行葡萄糖酸钙片药典方法相比具有专属性强、准确度好的溶出曲线检测方法，以解决上述技术问题。

为实现上述目的本发明采用以下技术方案：

一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法，包括如下步骤：（1）取葡萄糖酸钙对照品精密称定，置于容量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，摇匀后作为对照品溶液，取处方比例的空白辅料精密称定，置容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度、摇匀、滤过；精密量取续滤液置容量瓶中，用水稀释至刻度摇匀即得，取空白溶剂、空白辅料及对照品溶液，在该色谱条件下进样，要求三种物质彼此之间无出峰重叠、干扰，具有良好专属性；

（2）精密称定葡萄糖酸钙对照品置容量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，摇匀后作为母液，分别精密量取三种母液置容量瓶中，用纯水稀释制成浓度为0.2184 mg/ml、0.4367 mg/ml、0.6551 mg/ml的溶液，分别作为线性2、线性3、线性5；精密量取母液置容量瓶中，用纯水稀释制成0.5677 mg/ml的溶液，作为线性4；精密量取母液置容量瓶中，用水稀释制成0.0655 mg/ml的溶液，作为线性1；

（3）各浓度对照品溶液依该色谱条件测定其峰面积，以各对照品峰面积为纵坐标Y，浓度为横坐标X进行线性回归，相关系数不小于0.99；并确定适用浓度范围为0.0655mg/ml~0.6551mg/ml。

作为本发明进一步的方案，步骤（1）、（2）具体内容如下：

取葡萄糖酸钙对照品14 mg，精密称定，置于25 ml容量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，摇匀后作为对照品溶液，取处方比例的空白辅料68.50 mg，精密称定，置100 ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度、摇匀、滤过；精密量取续滤液1 ml置10 ml容量瓶中，用水稀释至刻度摇匀即得，取空白溶剂、空白辅料及对照品溶液，在该色谱条件下进样，要求三种物质彼此之间无出峰重叠、干扰，具有良好专属性；

精密称定葡萄糖酸钙对照品0.1094 g置50 ml容量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，摇匀后作为母液，分别精密量取1 ml、2 ml、3 ml母液置10 ml容量瓶中，用纯水稀释制成浓度为0.2184 mg/ml、0.4367 mg/ml、0.6551 mg/ml的溶液，分别作为线性2、线性3、线性5；精密量取13 ml母液置50 ml容量瓶中，用纯水稀释制成0.5677 mg/ml的溶液，作为线性4；精密量取3 ml母液置100 ml容量瓶中，用水稀释制成0.0655 mg/ml的溶液，作为线性1。

作为本发明进一步的方案，所述液相色谱仪的色谱柱为十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长150 mm-250 mm，内径为4.6 mm，颗粒直径为3-6 μm，所述色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq。

作为本发明进一步的方案，色谱系统的流动相为磷酸二氢钾溶液，磷酸二氢钾溶液浓度范围为0.001-0.2，单位为mol/L。

作为本发明进一步的方案，磷酸二氢钾溶液优选浓度为0.02 mol/L。

作为本发明进一步的方案，磷酸二氢钾溶液与磷酸配伍得到混合溶液的pH范围为1-7。

作为本发明进一步的方案，磷酸二氢钾溶液与磷酸配伍得到混合溶液的优选pH值为2.5。

作为本发明进一步的方案，磷酸二氢钾溶液流速范围为0.001-5，单位为ml/min；柱温范围在10-50℃之间。

作为本发明进一步的方案，磷酸二氢钾溶液流速优选值为0.6 ml/min；柱温为25℃。

作为本发明进一步的方案，使用紫外检测器，检测条件是检测波长为210 nm。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明的的溶出曲线检测方法具有专属性强、准确度好、灵敏度高、实用性强等诸多优点。

附图说明

图1是葡萄糖酸钙片水中溶出曲线图。

图2是专属性检验图。

图3是葡萄糖酸钙线性关系图。

图4是葡萄糖酸钙溶液稳定性图。

图5是葡萄糖酸钙片溶出曲线对比图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细阐述。

葡萄糖酸钙片溶出曲线方法建立：

仪器：高效液相色谱仪(厂家：Thermo U3000)；百万分之一天平(厂家：Sartorius)、万分之一天平(厂家：上海舜宇恒平)；离心机（厂家：Eppendorf）、溶出仪（厂家：富科思）。

试药：葡萄糖酸钙片（自制；批号：20180809；标示含量：100.0%）、葡萄糖酸钙对照品（来源：中国食品药品检定研究院；纯度：99.8%）、空白辅料（自制）。

色谱条件的选择：经过反复验证、筛选，确定色谱条件如下：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq（250 mm*4.6 mm，5 µm）；

流动相：0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液（用磷酸调至pH 2.50）；

检测波长：210 nm。

对照品溶液的配制：取葡萄糖酸钙对照品14 mg，精密称定，置于25 ml容量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，摇匀后作为对照品溶液。

供试品溶液的配制：取葡萄糖酸钙片（批号：20180809）12片，以纯水为溶出介质（T= 37℃）投入溶出仪中，设定转速为50 rpm/min，分别于5 min、10 min、15 min、20 min、30min、45 min、60 min、90 min、120 min取样，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

溶出曲线测定方法：取对照品溶液和供试品溶液各10 µl进样，按上述色谱条件进行色谱分析，记录葡萄糖酸钙的色谱峰面积，按外标法以峰面积计算葡萄糖酸钙的溶出曲线，如附图1所示。

专属性：

空白辅料溶液的配制：取处方比例的空白辅料68.50 mg，精密称定，置100ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度、摇匀、滤过；精密量取续滤液1ml置10 ml容量瓶中，用水稀释至刻度、摇匀、即得。

专属性检验：为检验、确证方法专属性，取空白溶剂、空白辅料及对照品溶液，在上述色谱条件下进样，检验结果如附图2所示：

结果表明：在此方法下，空白溶剂与空白辅料均无出峰，而对照品溶液出峰位置约为4.75 min，三种物质彼此之间无任何干扰，专属性良好。

线性关系与范围：

精密称定葡萄糖酸钙对照品0.1094 g置50 ml容量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，摇匀后作为母液。分别精密量取1 ml、2 ml、3 ml母液置10 ml容量瓶中，用纯水稀释制成浓度为0.2184 mg/ml、0.4367 mg/ml、0.6551 mg/ml的溶液，分别作为线性2、线性3、线性5；精密量取13 ml母液置50 ml容量瓶中，用纯水稀释制成0.5677 mg/ml的溶液，作为线性4；精密量取3 ml母液置100 ml容量瓶中，用水稀释制成0.0655 mg/ml的溶液，作为线性1。各浓度对照品溶液依上述色谱条件测定其峰面积，以各对照品峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X）进行线性回归（附图3）。葡萄糖酸钙线性方程：Y=8.1177X-0.0684，相关系数R=0.9990。

结果表明：葡萄糖酸钙在浓度为0.0655 mg/ml-0.6551 mg/ml范围内，有良好的线性关系。

回收率试验：

取葡萄糖酸钙原料药（已标定合格），分别精密称定33.6 mg、56.0 mg、61.6 mg，并分别加入处方比例的空白辅料6.85 mg，置100 ml容量瓶中，加纯水超声溶解并定容到刻度、摇匀、滤过。使葡萄糖酸钙终浓度分别为60%、100%、110%，各配制三份作为供试品溶液。另取葡萄糖酸钙对照品精密称定，加纯水溶解并稀释成每l ml中含0.56 mg的溶液，作为对照品溶液。分别取对照品溶液和供试品溶液按照上述色谱条件进行色谱分析。依据色谱图出峰信息，计算9份样品的回收率（表1）。

表1 回收率数据表

Table 1 Results of Recovery Data

结果表明：葡萄糖酸钙在60%-110%浓度范围内，平均回收率为102.8%，RSD为1.84%（n=9）；方法的回收率良好。

溶液稳定性：

取葡萄糖酸钙片20片精密称定、研细，精密称取适量（约相当于葡萄糖酸钙1.12 g），置100ml容量瓶中，加纯水超声溶解，滤过，取续滤液1 ml置20 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，作为100%浓度考察24 h溶液稳定性（表2）；精密量取100%浓度溶液1 ml置10 ml量瓶，加水定容至刻度，作为10%浓度考察24 h溶液稳定性（表3）。于预设时间点0 h、2 h、4 h、6 h、8h、12 h、18 h、24 h时取样，按照上述色谱条件测定葡萄糖酸钙的峰面积（附图4）。

表2 100%溶液稳定性数据表

Table 2 Results of 100% Solution Stability

表3 10%溶液稳定性数据表

Table 3 Results of 10% Solution Stability

结果表明：100%溶液和10%溶液在室温条件下，24 h内稳定。100%溶液RSD为0.4%（n=8）；10%溶液RSD为0.6%（n=8）。

重复性试验：

为验证方法重复性，分别在5 min和120 min自溶出杯中取样，连续进样6次，进样体积10 µL，测得葡萄糖酸钙峰面积如表4所示。

表4重复性实验数据表

Table 4 Results of Repeatability Test

结论：葡萄糖酸钙的重复性良好；RSD分别为0.09%和0.05%（n=6）。

耐用性：通过改变流动相pH变化±0.5、柱温变化±5℃、检测波长变化±2nm、流速相对值变化±20%，用对照品溶液考察方法的耐用性。

结果表明：以上四种条件的改变对方法实施无明显影响，耐用性良好。

不同方法检测溶出曲线对比：

取葡萄糖酸钙片（批号：20180809）分别以本文所述HPLC法和药典方法（原子分光光度法）检测溶出曲线数据（表5），对比图见附图5。

表5溶出曲线数据对比

Table 4 Comparison of Dissolution Curve Data

以上所述为本发明较佳实施例，对于本领域的普通技术人员而言，根据本发明的教导，在不脱离本发明的原理与精神的情况下，对实施方式所进行的改变、修改、替换和变型仍落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法，其特征是，包括如下步骤：（1）取葡萄糖酸钙对照品精密称定，置于容量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，摇匀后作为对照品溶液，取处方比例的空白辅料精密称定，置容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度、摇匀、滤过；精密量取续滤液置容量瓶中，用水稀释至刻度摇匀即得，取空白溶剂、空白辅料及对照品溶液，在该色谱条件下进样，要求三种物质彼此之间无出峰重叠、无干扰，具有良好专属性；

2.根据权利要求1所述的一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法，其特征是，步骤（1）、（2）具体内容如下：

3.根据权利要求1或2所述的一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法，其特征是，所述液相色谱仪的色谱柱为十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长150 mm-250 mm，内径为4.6 mm，颗粒直径为3-6 μm，所述色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq。

4.根据权利要求l或2所述的一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法，其特征是，色谱系统的流动相为磷酸二氢钾溶液，磷酸二氢钾溶液浓度范围为0.001-0.2，单位为mol/L。

5.根据权利要求4所述的一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法，其特征是，磷酸二氢钾溶液优选浓度为0.02 mol/L。

6.根据权利要求4所述的一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法，其特征是，磷酸二氢钾溶液与磷酸配伍得到混合溶液的pH范围为1-7。

7.根据权利要求6所述的一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法，其特征是，磷酸二氢钾溶液与磷酸配伍得到混合溶液的优选pH值为2.5。

8.根据权利要求4所述的一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法，其特征是，磷酸二氢钾溶液流速范围为0.001-5，单位为ml/min；柱温范围在10-50℃之间。

9.根据权利要求8所述的一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法，其特征是，磷酸二氢钾溶液流速优选值为0.6 ml/min；柱温为25℃。

10.据权利要求1或2所述的一种葡萄糖酸钙片溶出曲线的检测方法，其特征是，使用紫外检测器，检测条件是检测波长为210 nm。