CN115032307A - 一种利用高效液相色谱测定替奈普酶中精氨酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用高效液相色谱测定替奈普酶中精氨酸含量的方法，该方法的色谱条件为：色谱柱：C18；流动相：0.019mol/L庚烷磺酸钠的0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至2.6)‑甲醇(80：20)；检测波长：206mm；柱温：20～30℃；流速：1.5ml/min；进样量：20μl。本发明的方法特别适用于测定替奈普酶(TNK‑tPA)中精氨酸含量，其无需进行柱前/柱后衍生化，且具有准确度、精密度高、重复性良好、线性范围宽等特点，为替奈普酶(TNK‑tPA)产品制定了一个科学、严格的内控标准，提高了替奈普酶(TNK‑tPA)产品的质量。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种利用高效液相色谱测定替奈普酶中精氨酸含量的方法。
背景技术
替奈普酶(TNK-tPA)是迄今为止最安全有效且使用最方便的溶栓药，目前国内已上市的有第一代重组天然tPA类产品，商品名“爱通立”；第二代为采用大肠杆菌表达的tPA类产品，即瑞替普酶；而替奈普酶(TNK-tPA)是世贸天阶制药(江苏)有限责任公司生产的第三代tPA类产品，是目前可以单次静脉推注的溶栓药品种，其具有一针救命，使用方便的特点，更加适合急救，使得溶栓治疗在院外进行成为可能，具有划时代的意义。
而为了提高替奈普酶(TNK-tPA)的质量标准，需要建立制剂中精氨酸含量的检验方法和控制要求。对于原辅料中精氨酸含量的检测，2020版《中国药典》中收纳的方法为电位滴定法测定精氨酸的含量、采用旋光法测定盐酸精氨酸注射液中精氨酸的含量，但由于生物制品中精氨酸是作为辅料使用，含量较低，且生物制品中组分较为复杂，辅料之间存在一定影响，因此上述两种方法不适用于该产品中精氨酸含量测定。
现有技术中亦公开了众多测定注射制剂中氨基酸的含量的方法，如张彦文，张庆伟利用C18色谱柱测定了脑蛋白水解物注射液中各游离氨基酸的含量《脑蛋白水解物注射液的质量评价》；还有文献报道采用离子色谱法、氨基键合硅胶填充柱对注射制剂中氨基酸的含量进行检测，但均存在线性范围窄、图谱峰型较差、出峰时间短等问题。也有部分报道采用反相柱(C18、C8柱)柱前或柱后衍生化的方法，将其与衍生化实际反应后生成有紫外吸收的物质进行检测(脑蛋白水解物注射液中氨基酸含量测定分析方法，龚继华，张泽辛，邱德清)，但是上述方法又存在重复性和准确度不够，操作繁琐，检测设备要求高等缺点。更重要的是，上述方法涉及的均是对多种氨基酸含量的测定，而各个氨基酸之间的性质差异较大，采用上述用于检测替奈普酶(TNK-tPA)中精氨酸的含量，检测结果准确度低。
因此，针对上述问题，为了提高替奈普酶(TNK-tPA)制剂的质量，亟需提供一种特别适用于检测替奈普酶(TNK-tPA)中精氨酸含量的检测方法，且该方法具有准确度和精密度高、线性范围宽，重复性良好的特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可有效解决上述技术问题的利用高效液相色谱测定替奈普酶中精氨酸含量的方法。
为达到本发明之目的，采用如下技术方案：
一种利用高效液相色谱测定替奈普酶中精氨酸含量的方法，包括如下步骤：
A)将替奈普酶供试样品用水溶解，得样品溶液；
B)将上述样品溶液注入高效液相色谱仪；
C)记录色谱图，根据外标法计算替奈普酶供试样品中精氨酸含量。
优选的，所述步骤B)中高效液相色谱仪的色谱条件为：
色谱柱：C18十八烷基硅烷键合柱；
流动相：磷酸盐缓冲液-甲醇；
检测波长：206mm；
柱温：20～30℃；
流速：1.35-1.65ml/min；
进样量：20μl。
优选的，所述流动相中磷酸盐缓冲液与甲醇的添加比例为80：20。
优选的，所述磷酸盐缓冲液的pH值为2.6。
优选的，所述磷酸盐缓冲液为添加了庚烷磺酸钠的磷酸二氢钾溶液。
优选的，所述磷酸二氢钾溶液中庚烷磺酸钠的浓度为0.019mol/L。
优选的，所述磷酸二氢钾溶液中磷酸二氢钾的浓度为0.025mol/L。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所采用的方法与现有技术相比，其采用C18十八烷基硅烷键合柱，以磷酸盐缓冲液-甲醇为流动相，通过对各参数进行调整，不仅实现了对替奈普酶(TNK-tPA)中精氨酸含量的准确测定；而且本发明所采用的测定方法不需要进行柱前/柱后衍生化，缩短了检测时间，简化了检测步骤；同时本发明所采用的方法的检测专属性、重复性、线性范围、精密度等均通过了验证，从而为替奈普酶(TNK-tPA)产品制定了一个科学、严格的内控标准，提高了替奈普酶(TNK-tPA)产品的质量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1显示了实施例1的测试方法测试的替奈普酶(TNK-tPA)供试样品的HPLC图；
图2显示了实施例1的测试方法测试的精氨酸对照品的HPLC图；
图3显示了实施例2的测试方法中流动相的流速为1.35ml/min时替奈普酶(TNK-tPA)供试样品的HPLC图；
图4显示了实施例3的测试方法中流动相的流速为1.65ml/min时替奈普酶(TNK-tPA)供试样品的HPLC图；
图5显示了实施例4的测试方法中柱温为20℃时替奈普酶(TNK-tPA)供试样品的HPLC图；
图6显示了实施例4的测试方法中柱温为20℃时精氨酸对照品的HPLC图；
图7显示了实施例5的测试方法中柱温为30℃时替奈普酶(TNK-tPA)供试样品的HPLC图；
图8显示了实施例5的测试方法中柱温为30℃时精氨酸对照品的HPLC图；
图9为本发明提供的测定方法的线性关系标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。
本发明提供的一种利用高效液相色谱测定替奈普酶中精氨酸含量的方法，该方法包括如下步骤：
A)将替奈普酶供试样品用水溶解，得样品溶液；
B)将上述样品溶液注入高效液相色谱仪；
C)记录色谱图，根据外标法计算替奈普酶供试样品中精氨酸含量。
其中，所述步骤B)中高效液相色谱仪的色谱条件为：
色谱柱：C18十八烷基硅烷键合柱；
流动相：磷酸盐缓冲液-甲醇；
检测波长：206mm；
柱温：20～30℃；
流速：1.35-1.65ml/min；
进样量：20μl。
具体的，所述流动相中磷酸盐缓冲液与甲醇的添加比例为80：20；所述磷酸盐缓冲液的pH值为2.6，其为添加了庚烷磺酸钠的磷酸二氢钾溶液，且所述磷酸二氢钾溶液中庚烷磺酸钠的浓度为0.019mol/L，磷酸二氢钾的浓度为0.025mol/L。
需要说明的是，本文中所述“替奈普酶(TNK-tPA)”为世贸天阶制药(江苏)有限责任公司生产，规格为20mg/瓶。色谱柱：C18十八烷基硅烷键合柱的规格为5μm，4.6×250mm。
实施例1
测定替奈普酶(TNK-tPA)供试样品色谱图和精氨酸对照品色谱图。
色谱条件为：
色谱柱：C18十八烷基硅烷键合柱；
流动相：0.019mol/L庚烷磺酸钠的0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至2.6)-甲醇(80：20)；
检测波长：206mm；
柱温：25℃；
流速：1.5ml/min；
进样量：20μl。
步骤如下：
A)取替奈普酶(TNK-tPA)供试样品1瓶，按标示量复溶后用水稀释330倍后得到样品溶液；而后取精氨酸对照品16mg，按标示量加水溶解成0.16mg的溶液，作为对照品溶液；
B)取上述样品溶液和对照品溶液各20μl，分别注入高效液相色谱仪中进行检测；
C)记录替奈普酶(TNK-tPA)供试样品色谱图和精氨酸对照品色谱图，按照外标法以峰面积计算即得精氨酸的含量。
替奈普酶(TNK-tPA)供试样品色谱图和精氨酸对照品色谱图分别如图1和图2所示，从图1可知，替奈普酶(TNK-tPA)供试样品中精氨酸与其他成分有良好的分离度，理论塔板和拖尾因子等系统适应性符合药典的要求；从图2可看出，替奈普酶(TNK-tPA)供试样品中精氨酸的保留时间与精氨酸对照品中精氨酸的保留时间一致。
实施例2
与实施例1的区别在于色谱条件中流速为1.35ml/min，其余参数与操作步骤同实施例1，替奈普酶(TNK-tPA)供试样品色谱图如图3所示，从图中可以看出，改变了流动相的流速后，出峰时间略有延长，但各参数均符合药典的要求。
实施例3
与实施例1的区别在于色谱条件中流速为1.65ml/min，其余参数与操作步骤同实施例1，替奈普酶(TNK-tPA)供试样品色谱图如图4所示，改变了流动相的流速后，出峰时间略有延长，但各参数均符合药典的要求。
实施例4
与实施例1的区别在于色谱条件中柱温为20℃，其余参数与操作步骤同实施例1，替奈普酶(TNK-tPA)供试样品色谱图和精氨酸对照品色谱图分别如图5和图6所示，从图中可以看出，改变了温度后，出峰时间略有缩短，但各参数均符合药典的要求。
实施例5
与实施例1的区别在于色谱条件中柱温为30℃，其余参数与操作步骤同实施例1，替奈普酶(TNK-tPA)供试样品色谱图和精氨酸对照品色谱图分别如图7和图8所示，从图中可以看出，改变了温度后，出峰时间略有缩短，但各参数均符合药典的要求。
1、线性关系测试
线性系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。可用一贮备液经精密稀释，制备一系列供试品的方法进行测定，以测得的峰面积与被测物浓度作图，观察是否呈线性，进行线性回归。
测试步骤：采用高效液相色谱仪，按实施例1所述色谱条件进行检测，取精氨酸对照品用水稀释制成每1ml溶液中含0.06mg、0.10mg、0.16mg、0.20mg、0.25mg系列溶液作为对照品溶液，绘制标准曲线并依次记录相应的峰面积，以峰面积为(Y)纵坐标，其浓度(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程y＝4382605.378X+478.751；R＝1.00，即浓度在0.06～0.25mg/ml之内，精氨酸的含量与峰面积呈良好的线性关系，测试数据如表1所示，标准曲线图如图9所示。
表1
通过标准曲线图可知，采用本发明的方法测定的精氨酸呈良好的线性关系。
2、准确度测试
准确度系指用该方法测定的结果与理论值接近的程度，一般用回收率(％)表示，回收率在98.0％～102.0％范围内可接受。
测试步骤：
采用高效液相色谱仪，按实施例1所述色谱条件进行检测，取替奈普酶(TNK-tPA)供试样品一支，加标示量水复溶后，将样品稀释165倍(约为0.32mg/ml)，作为供试品贮备溶液；
而后取供试品贮备溶液用水稀释至约为0.16mg/ml溶液，再与0.16mg/ml对照品溶液1:1混合，作为供试品100％溶液；
取供试品贮备溶液用水稀释至约为0.12mg/ml溶液，再与0.12mg/ml对照品溶液1:1混合，作为供试品80％溶液；
取供试品贮备溶液用水稀释至约为0.20mg/ml溶液，再与0.20mg/ml对照品溶液1:1混合，作为供试品120％溶液，平行制备三份；
最后分别测定0.12mg/ml、0.16mg/ml、0.20mg/ml的供试品贮备溶液、供试品贮备溶液与对照品溶液的混合溶液，计算加样对照回收率(％)；结果如表2所示。
表2
由表2的数据可知，精氨酸的回收率在100％-101％之间，由此可以证明采用该方法测定精氨酸有良好的准确度。
由附图即测试数据可知，本发明的方法不仅实现了对替奈普酶(TNK-tPA)中精氨酸含量的准确测定；而且本发明所采用的测定方法不需要进行柱前/柱后衍生化，缩短了检测时间，简化了检测步骤；同时本发明所采用的方法的检测专属性、重复性、线性范围、精密度等均通过了验证，从而为替奈普酶(TNK-tPA)产品制定了一个科学、严格的内控标准，提高了替奈普酶(TNK-tPA)产品的质量。
所述对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。
Claims (7)
1.一种利用高效液相色谱测定替奈普酶中精氨酸含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：
A)将替奈普酶供试样品用水溶解，得样品溶液；
B)将上述样品溶液注入高效液相色谱仪；
C)记录色谱图，根据外标法计算替奈普酶供试样品中精氨酸含量。
2.根据权利要求1所述的一种利用高效液相色谱测定替奈普酶中精氨酸含量的方法，其特征在于：所述步骤B)中高效液相色谱仪的色谱条件为：
色谱柱：C18十八烷基硅烷键合柱；
流动相：磷酸盐缓冲液-甲醇；
检测波长：206mm；
柱温：20～30℃；
流速：1.35-1.65ml/min；
进样量：20μl。
3.根据权利要求2所述的一种利用高效液相色谱测定替奈普酶中精氨酸含量的方法，其特征在于：所述流动相中磷酸盐缓冲液与甲醇的添加比例为80：20。
4.根据权利要求3所述的一种利用高效液相色谱测定替奈普酶中精氨酸含量的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液的pH值为2.6。
5.根据权利要求4所述的一种利用高效液相色谱测定替奈普酶中精氨酸含量的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液为添加了庚烷磺酸钠的磷酸二氢钾溶液。
6.根据权利要求5所述的一种利用高效液相色谱测定替奈普酶中精氨酸含量的方法，其特征在于：所述磷酸二氢钾溶液中庚烷磺酸钠的浓度为0.019mol/L。
7.根据权利要求5所述的一种利用高效液相色谱测定替奈普酶中精氨酸含量的方法，其特征在于：所述磷酸二氢钾溶液中磷酸二氢钾的浓度为0.025mol/L。
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| CN103048396A (zh) * | 2012-08-31 | 2013-04-17 | 石家庄中硕药业集团有限公司 | 一种精氨酸含量的测定方法 |
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