CN110208397B - 一种同时测定土霉素氟尼辛注射液中两种主药含量的高效液相色谱法 - Google Patents

一种同时测定土霉素氟尼辛注射液中两种主药含量的高效液相色谱法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种土霉素氟尼辛注射液中两种主药含量同时测定的方法，应用于含量测定技术领域。本方法属于高效液相色谱法，包括液相色谱条件的筛选、溶液的配制和样品测定。本发明用同一个液相色谱条件即可同时测定土霉素和氟尼辛两种主药的含量，降低了原方法分别测定的操作复杂性，提高了检测效率。

Description

一种同时测定土霉素氟尼辛注射液中两种主药含量的高效液 相色谱法
技术领域
本发明涉及一种复方注射液含量测定方法，具体涉及一种同时测定土霉素氟尼辛注射液中两种主药含量的高效液相色谱法。
背景技术
土霉素氟尼辛注射液为我公司研发的兽用复方制剂，主要成分为土霉素和氟尼辛葡甲胺，注射液的规格为每1ml含土霉素300mg、氟尼辛20mg，其中土霉素为常用的四环素类抗生素，氟尼辛葡甲胺为非甾体类动物专用的解热镇痛药物，属于烟酸类衍生物，是环氧化酶的抑制剂，具有解热、消炎和镇痛作用，氟尼辛葡甲胺可以增强抗生素的活性，两者合用能够明显改善动物临床症状，用于敏感菌引起的各种临床疾病的治疗。虽然2015版《中国兽药典》中收载了土霉素和氟尼辛葡甲胺原料及部分制剂的标准，USP和EP等国外药典也均有收载，但土霉素氟尼辛注射液在国外各药典、中国兽药典、国家其他法定标准中均无收载。因此目前两种主药含量测定的方法采用药典中的方法分别测定，但这种测定方法需要建立两种不同的色谱条件并分别配制对照品溶液和供试品溶液，操作复杂。
发明内容
本发明提供了一种同时测定土霉素氟尼辛注射液中两种主成分含量的高效液相色谱法，该方法的发明简化了原方法中分别测定时溶液的配制和测定的操作复杂性，使得土霉素氟尼辛注射液含量的测定更加准确、方便、高效。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种同时测定土霉素氟尼辛注射液中两种主药含量的高效液相色谱方法，包括以下步骤：
(A)液相色谱条件的选定
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，0.05％的磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱；检测波长为254nm；土霉素峰与相邻杂质峰分离良好，氟尼辛峰与土霉素峰分离良好，氟尼辛峰的理论塔板数不低于1500。
(B)溶液的配制
对照品溶液的配制：取土霉素对照品和氟尼辛葡甲胺对照品适量，用0.01mol/L的盐酸溶解并稀释制成同时包含土霉素和氟尼辛的对照品溶液，每ml对照品溶液中包含0.75mg土霉素、0.05mg氟尼辛。
供试品溶液的配制：取土霉素氟尼辛注射液适量，加0.01mol/L的盐酸稀释制成每ml供试品溶液中含0.75mg土霉素、0.05mg氟尼辛。
(C)样品的测定
分别取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪进行梯度洗脱，按外标法以峰面积计算供试品溶液的浓度。
本发明的进一步改进在于，梯度洗脱的具体过程为：0～10分钟用流动相A、流动相B组成的混合流动相进行洗脱，混合流动相中包含体积比80％的流动相A和20％的流动相B；15～30分钟用流动相A、B组成的混合流动相洗脱，混合流动相中包含体积比40％的流动相A和60％的流动相B；31～48分钟用流动相A、B组成的混合流动相进行洗脱，所述混合流动相中包含体积比80％的流动相A和20％的流动相B。
由于采用了上述技术方案，本发明所取得的技术进步在于：
本发明用同一个液相色谱条件即可同时测定土霉素与氟尼辛两种主成分的含量，原来的方法需建立两种色谱条件和配制四种溶液，而且土霉素的液相条件及流动相的配制相当复杂，本方法只需建立一种色谱条件和配制两种溶液即可，缩短了液相色谱检测的时间和操作，提高了效率。本发明方法经过方法学系统的验证，专属性强，准确度高，重现性好，适于在质量控制标准中采用，有利于提高产品的检测效率。
本发明所述方法中，土霉素和氟尼辛的浓度与峰面积之间存在良好的线性关系，因此本发明方法中土霉素和氟尼辛的含量计算方法可以通过简单的外标法计算得到，计算方法简单。
(一)关于本发明方法的专属性
(1)土霉素对照品溶液的配制：取土霉素对照品适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶解并定量稀释制成每1ml中含0.75mg土霉素的溶液，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图(见图1)。
(2)氟尼辛对照品溶液的配制：取氟尼辛葡甲胺对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中含0.05mg氟尼辛的溶液，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图(见图2)。
(3)混合对照品溶液的配制：分别取土霉素、氟尼辛葡甲胺对照品适量，加0.01mol/L盐酸溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.75mg土霉素和0.05mg氟尼辛的溶液，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图(见图3)。
(4)供试品溶液的配制：取土霉素氟尼辛注射液0.25ml置100ml量瓶中，用0.01mol/L的盐酸稀释至刻度，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图(见图4)。
色谱检测结果见表1。
表1对照品溶液与供试品溶液的专属性对比
Figure BDA0002063270650000041
由表1可知，对照品溶液色谱图中与供试品溶液色谱图中主峰的保留时间一致，供试品溶液中主峰与相邻杂质峰的分离度符合要求，氟尼辛峰的理论塔板数为1.62×105，符合规定，该方法的专属性良好。
(二)关于方法的准确性和重现性
对土霉素氟尼辛注射液采用本方法同时测定两种主药的含量，并分别采用2015版《中国兽药典》中土霉素的含量测定方法测定土霉素的含量、2015版《中国兽药典》中氟尼辛葡甲胺注射液中氟尼辛的含量测定方法测定氟尼辛的含量，测定结果见表2，本方法6次含量测定结果的RSD分别为0.52％、0.67％，已收载方法6次测定结果的RSD分别为0.58％、0.31％，且两种方法测定的结果相差不大，证明本方法的准确度与重现性均符合要求。
表2准确度及重现性实验结果
Figure BDA0002063270650000051
Figure BDA0002063270650000061
(三)关于本发明方法中溶液浓度与峰面积的线性关系
分别取土霉素、氟尼辛葡甲胺对照品适量，精密称定，加0.01mol/L的盐酸溶解并定量稀释制成每1ml中含1.5mg土霉素和0.1mg氟尼辛的溶液，分别精密量取上述溶液3ml、4ml、5ml、6ml、7ml置10ml量瓶中，并用0.01mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，分别进样，记录色谱图。分别以峰面积为纵坐标y，浓度为横坐标x作图，其回归方程分别为：土霉素：y土霉素＝2×1010x-320306(R2＝0.9997)，氟尼辛：y氟尼辛＝2×1010x-9497(R2＝0.9994)，结果见表3和图5～6。
表3溶液浓度与峰面积测定结果
Figure BDA0002063270650000062
由表3和图5～6可得，本发明方法测定的土霉素在0.4369～1.0195mg/ml浓度范围、氟尼辛在0.03045～0.07104mg/ml浓度范围内线性关系良好。
附图说明
图1为土霉素对照品溶液的液相色谱图；
图2为氟尼辛对照品溶液的液相色谱图；
图3为混合对照品溶液的液相色谱图；
图4为供试品(土霉素氟尼辛注射液)溶液的液相色谱图；
图5为土霉素溶液浓度与峰面积的线性关系图；
图6为氟尼辛溶液浓度与峰面积的线性关系图。
具体实施方式
对本发明做进一步详细说明：
(A)色谱条件的选定
采用高效液相色谱仪(Waterse2695)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，0.05％的磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为254nm；要求土霉素峰与氟尼辛峰分离良好，土霉素峰与氟尼辛峰分离良好，氟尼辛峰的理论塔板数不低于1500。
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～10 80 20
10～15 80→40 20→60
15～30 40 60
30～31 40→80 60→20
31～48 80 20
(B)对照品溶液的制备
分别取土霉素、氟尼辛对照品适量，加0.01mol/L的盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.75mg土霉素和0.05mg氟尼辛的溶液。
(C)供试品溶液的配制
取土霉素氟尼辛注射液0.25ml置100ml量瓶中，用0.01mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，即得。
(D)测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。按外标法以峰面积计算，即得。
测得结果：土霉素、氟尼辛的含量分别为99.1％、97.6％。

Claims (1)

1.一种同时测定土霉素氟尼辛注射液中两种主药含量的高效液相色谱法，其特征在于包括如下步骤：
(A)液相色谱条件的选定
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，0.05％的磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱；检测波长为254nm；土霉素峰与相邻杂质峰分离良好，土霉素峰与氟尼辛峰分离良好，氟尼辛峰的理论塔板数不低于1500；
(B)溶液的配制
对照品溶液的配制：取土霉素对照品和氟尼辛葡甲胺对照品适量，用0.01mol/L的盐酸溶解并稀释制成同时包含土霉素和氟尼辛的对照品溶液，每ml对照品溶液中包含0.75mg土霉素、0.05mg氟尼辛；
供试品溶液的配制：取土霉素氟尼辛注射液适量，加0.01mol/L的盐酸稀释制成每ml供试品溶液中含0.75mg土霉素、0.05mg氟尼辛；
(C)样品的测定
分别取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪进行梯度洗脱，按外标法以峰面积计算供试品溶液的浓度；
梯度洗脱程序为：
Figure FDA0003619056860000011
Figure FDA0003619056860000021
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