CN114660213B - 一种复方利血平氢氯噻嗪片的成分含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复方利血平氢氯噻嗪片的成分含量测定方法，属于药品质量检测技术领域，所述的复方利血平氢氯噻嗪片的成分含量测定方法，包括以下步骤：取复方利血平氢氯噻嗪片，配制成供试品溶液；将供试品溶液采用液相色谱仪分析，得到色谱图；以外标法通过色谱图的峰面积计算出待测成分的含量；所述液相色谱仪分析的色谱条件包括：以庚烷磺酸钠溶液为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱。本发明所述的成分含量测定方法能有效的简化样品的前处理过程，缩短实验时间，具有良好的专属性，精密度，重复性及耐用性，能够实现样品中利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6、甲基橙皮苷中的一种至五种的成分含量测定。
Description
技术领域
本发明涉及药品质量检测技术领域，具体涉及一种复方利血平氢氯噻嗪片的成分含量测定方法。
背景技术
复方利血平氢氯噻嗪片为复方制剂，是各种类型高血压的多组分制剂。按复方利血平氢氯噻嗪片说明书，临床用于各种类型高血压症，口服后迅速吸收，作用特点为起效缓慢，作用温和持久。
经查阅国内外各药品标准，复方利血平氢氯噻嗪片的现行标准为局颁标准化药地标升国标第五册WS-10001-(HD-0441)-2002。在各国药典均无收载。现行标准中采用液相色谱法测定利血平与罗通定的含量，采用紫外分光光度法测定氢氯噻嗪的含量。检测过程繁琐且未对该药物处方中的维生素B6与甲基橙皮苷的含量进行检测。中国医药工业杂志中的期刊公开了《复方利血平氢氯噻嗪片中三组分的HPLC法测定》，其采用乙腈和0.1％磷酸溶液作为流动相，其只能对、罗通定、维生素B6、甲基橙皮苷进行测量，无法对复方利血平氢氯噻嗪片中的氢氯噻嗪、利血平含量进行测量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种复方利血平氢氯噻嗪片的成分含量测定方法，所述的成分含量测定方法能实现样品中利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6、甲基橙皮苷中的一种至五种的成分含量测定。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种复方利血平氢氯噻嗪片的成分含量测定方法，包括以下步骤：
取复方利血平氢氯噻嗪片，配制成供试品溶液；
将供试品溶液采用液相色谱仪分析，得到色谱图；
以外标法通过色谱图的峰面积计算出待测成分的含量；
所述液相色谱仪分析的色谱条件包括：以庚烷磺酸钠溶液为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱。
本发明的发明人在大量的复方利血平氢氯噻嗪片的成分含量测定方法研究中发现，以庚烷磺酸钠溶液、乙腈为流动相进行梯度洗脱，通过所述的色谱图能够有效的测量出复方利血平氢氯噻嗪片中利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6、甲基橙皮苷一种至五种的含量。
作为本发明的优选实施方案，所述待测成分为利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6、甲基橙皮苷中的至少一种。
作为本发明的优选实施方案，所述待测成分为利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6和甲基橙皮苷。
作为本发明的优选实施方案，所述流动相A为0.2～0.5％的庚烷磺酸钠溶液，所述0.2～0.5％的庚烷磺酸钠溶液的配制方法为：取庚烷磺酸钠2～5g，加水600～800ml溶解，溶解后加入2～5ml三乙胺，调节pH至2.8～3.2，加水稀释至1000ml。当庚烷磺酸钠溶液0.2～0.5％时，各峰的峰型和分离度好，且峰的纯度高。
作为本发明的优选实施方案，所述流动相A为0.4％的庚烷磺酸钠溶液，所述0.4％的庚烷磺酸钠溶液的配制方法为：取庚烷磺酸钠4g，加水800ml溶解，溶解后加入4ml三乙胺，调节pH至3，加水稀释至1000ml。当庚烷磺酸钠溶液0.4％时，各峰的峰型、分离度、峰纯度最好。
作为本发明的优选实施方案，所述梯度洗脱条件为：0～8min，流动相A的体积分数变化为90％→70％，流动相B的体积分数变化为10％→30％，8～14min，流动相A的体积分数变化为70％→50％，流动相B的体积分数变化为30％→50％，14～15min，流动相A的体积分数变化为50％→40％，流动相B的体积分数变化为50％→60％，15～25min，流动相A的体积分数为40％，流动相B的体积分数为60％，25～25.01min，流动相A的体积分数变化为40％→90％，流动相B的体积分数变化为60％→10％，25.01～30min，流动相A的体积分数为90％，流动相B的体积分数为10％。
发明人发现，在本发明以0.2～0.5％庚烷磺酸钠溶液、乙腈为流动相的体系下，以上述的洗脱条件为进行梯度洗脱，能够得到含有利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6、甲基橙皮苷五个特征峰的色谱图，利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6、甲基橙皮苷的特征峰峰纯度高、峰分离度好，分离时间短，且不含有其他的杂峰，
若采取其他的流动相或者其他的梯度洗脱条件，会导致利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6、甲基橙皮苷相关峰不存在，峰纯度以及峰分离度变低，也就是说，采取本发明的流动相以及梯度洗脱条件能够检测出利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6、甲基橙皮苷中的一种至五种的含量，若采取其他的流动相或者其他的梯度洗脱条件，上述利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6、甲基橙皮苷会存在峰数量减少，从而不能完成对上述五个成分的同时检测。
且在本发明中，采用上述的方法在上述的0.2～0.5％庚烷磺酸钠溶液、乙腈为流动相，采用上述的梯度洗脱条件，能够有效的简化样品的前处理过程，缩短实验时间，具有良好的专属性，精密度，重复性及耐用性，能够实现样品中利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6、甲基橙皮苷中的一种至五种的成分含量测定。
作为本发明的优选实施方案，所述液相色谱仪分析的色谱条件还包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，检测波长为250～275nm，流速为0.8～1.2ml/min，进样体积为15～30μl。当采取上述的检测波长时峰响应丰富且干扰较小，分离度较好。
作为本发明的优选实施方案，所述液相色谱仪分析的色谱条件还包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，检测波长为268nm，流速为1ml/min，进样体积为20μl。当波长为268nm时，峰响应丰富且干扰小，分离度最好。
作为本发明的优选实施方案，所述供试品溶液的配制方法为：取复方利血平氢氯噻嗪片1片，置于容器中，加溶剂使复方利血平氢氯噻嗪片溶解，用溶剂稀释至40～60ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
作为本发明的优选实施方案，所述溶剂由乙腈和水按照体积比1：0.5～2配制，并调节pH至2.8～3.2。
本发明的有益效果在于：本发明所述的成分含量测定方法能有效的简化样品的前处理过程，缩短实验时间，具有良好的专属性，精密度，重复性及耐用性，能够实现样品中利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6、甲基橙皮苷中的一种至五种的成分含量测定。
附图说明
图1为复方利血平氢氯噻嗪片色谱图；
图2为利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6、甲基橙皮苷线性回归图；
图3为耐用性实验中Thermo Acclaim C18色谱柱色谱图；
图4为耐用性实验中Waters Symmetry C18色谱柱色谱图；
图5为耐用性实验中phenomenex Luna C18(2)色谱柱色谱图；
图6为空白辅料色谱图；
图7为利血平阴性对照色谱图；
图8为氢氯噻嗪阴性对照色谱图；
图9为甲基橙皮苷阴性对照色谱图；
图10为罗通定阴性对照色谱图；
图11为维生素B6阴性对照色谱图。
图中标记：qlsq代表氢氯噻嗪，vb6代表维生素B6峰，jjcpg代表甲基橙皮苷峰，ltd代表罗通定峰，lxp代表利血平峰。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种复方利血平氢氯噻嗪片的成分含量测定方法
1.1液相色谱仪分析的色谱条件包括：以0.4％庚烷磺酸钠溶液为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱、以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，检测波长为268nm，流速为1ml/min，进样体积为20μl；0.4％庚烷磺酸钠溶液的配制方法为：取庚烷磺酸钠4g，加水800ml溶解，溶解后加入4ml三乙胺，并用冰醋酸调节pH至3，加水稀释至1000ml。
1.2梯度洗脱条件为：0～8min，流动相A的体积分数变化为90％→70％，流动相B的体积分数变化为10％→30％，8～14min，流动相A的体积分数变化为70％→50％，流动相B的体积分数变化为30％→50％，14～15min，流动相A的体积分数变化为50％→40％，流动相B的体积分数变化为50％→60％，15～25min，流动相A的体积分数为40％，流动相B的体积分数为60％，25～25.01min，流动相A的体积分数变化为40％→90％，流动相B的体积分数变化为60％→10％，25.01～30min，流动相A的体积分数为90％，流动相B的体积分数为10％。
1.3供试品溶液的配制方法为：取复方利血平氢氯噻嗪片1片，置于容器中，加溶剂使复方利血平氢氯噻嗪片溶解，用溶剂稀释至50ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，所述溶剂由乙腈和水按照体积比1:1配制，并用冰醋酸调节pH至3。
1.4对照品溶液的制备方法为：取利血平对照品18.75mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂适量，超声使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为利血平对照品贮备液；取氢氯噻嗪、维生素B6与甲基橙皮苷对照品各25mg，取罗通定对照品12.5mg，精密称定，置于50ml量瓶中，加溶剂适量，超声使溶解，精密量取利血平对照品贮备液1ml，置于50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
1.5分别取供试品溶液、对照品溶液注入液相色谱仪，在上述1.1、1.2的色谱条件下进行梯度洗脱，记录色谱图，并通过对照品溶液的峰进行指认，确认与利血平对照品溶液相对应的为利血平峰，与氢氯噻嗪对照品溶液相对应的为氢氯噻嗪峰，与罗通定对照品溶液相对应的为罗通定峰，与维生素B6对照品溶液相对应的为维生素B6峰，与甲基橙皮苷对照品溶液相对应的为甲基橙皮苷峰，见图1。
2.色谱条件优化
2.1检测波长的优化：按照“1.1”、“1.2”、“1.3”的色谱条件和供试品的制备方法进行进样分析，仅改变检测波长(波长分别为230nm、250nm、268nm、275nm、300nm)，考察不同检测波长对色谱图的影响，结果显示，当检测波长为250nm、268nm、275nm时，峰响应丰富且干扰较小，分离度较好，且当检测波长为268nm时，干扰最小，分离度最好，当波长(230nm、300nm)不在本发明的波长范围内时，分离度相对较差。
2.2流速优化：按照“1.1”、“1.2”、“1.3”的色谱条件和供试品的制备方法进行进样分析，仅改变流速(流速分别为0.8ml/min、1ml/min、1.2ml/min)，考察不同流速对色谱图的影响，结果显示，当流速为0.8ml/min、1ml/min、1.2ml/min时，峰纯度以及分离度均较好。
2.3流动相的优化：按照“1.1”、“1.2”、“1.3”的色谱条件和供试品的制备方法进行进样分析，仅改变流动相A的浓度(浓度分别为0.2％、0.4％、0.5％)，考察不同流动相A的浓度对色谱图的影响，结果显示，当流动相A的浓度为0.2％、0.4％、0.5％时，各峰的峰型和分离度好，且峰的纯度高，当流动相A的浓度为0.4％时，各峰的峰型、分离度、峰纯度最好。
3.1精密度试验：取“1.4”制备的对照品溶液，进样6次，利血平、氢氯噻嗪、罗通定、甲橙皮苷、维生素B6的精密度分别为RSD＝0.2％、0.1％、0.1％、0.1％、0.1％(n＝6)。
3.2线性关系：取利血平原料(批号：8170401，含量97.5％)0.07552g，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂约30ml，超声使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为利血平对照品贮备液；分别精密称取氢氯噻嗪原料(批号：C01-20170713，含量97.7％)0.10248g、罗通定原料(批号：C034A170602，含量100.7％)0.05051g，维生素B6原料(批号：H898b－1705208，含量99.5％)0.10028g，和甲基橙皮苷原料(批号：D10170403，含量54.8％)0.10307g，精密量取利血平对照品贮备液1.0ml，置于50ml量瓶中，加溶剂约30ml，超声使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性对照品贮备液。
分别取线性对照品贮备液1ml、1ml、2ml、2ml、3ml、3ml置于50ml、20ml、25ml、20ml、25ml、20ml容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5和溶液6。分别精密量取溶液1至6各20μl，注入液相色谱仪，记录主峰面积，以线性溶液浓度(μg/ml)为横坐标X，以主峰峰面积为纵坐标Y，进行线性回归，线性关系良好，结果见图2。
利血平在0.6～4.4μg/ml范围内呈线性关系，峰面积对浓度的线性方程为y＝33580574x+508，r2＝1.0000(n＝6)；
氢氯噻嗪在0.04～0.3mg/ml范围内呈线性关系，峰面积对浓度的线性方程为y＝66923773x+264275，r2＝0.9998(n＝6)；
罗通定在0.02～0.15mg/ml范围内呈线性关系，峰面积对浓度的线性方程为y＝8835639x+11076，r2＝0.9999(n＝6)；
甲橙皮苷在0.02～0.17mg/ml范围内呈线性关系，峰面积对浓度的线性方程为y＝18104561x+29549，r2＝0.9999(n＝6)；
维生素B6在0.04～0.3mg/ml范围内呈线性关系，峰面积对浓度的线性方程为y＝11731221x+45836，r2＝0.9998(n＝6)。
3.3重复性试验：取“1.3”制备的供试品溶液，重复测定本品6次，利血平、氢氯噻嗪、罗通定、甲橙皮苷、维生素B6含量结果的平均值分别为96.9％、99.1％、96.2％、58.0％、98.6％，RSD分别为1.4％、1.4％、1.1％、0.9％、1.3％(n＝6)。重复性良好。
3.4稳定性试验：取“1.3”制备的供试品溶液，每隔1小时分别进样测定，在16小时内溶液稳定，利血平、氢氯噻嗪、罗通定、甲橙皮苷、维生素B6含量测定结果的RSD分别为0.8％、0.1％、0.1％、0.2％、0.2％(n＝17)。
3.5回收率试验：取利血平原料(批号：8170401，含量97.5％)0.07552g，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂约30ml，超声使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为利血平对照品贮备液。分别精密称取氢氯噻嗪原料(批号：C01-20170713，含量97.7％)0.20029g、罗通定原料(批号：C034A170602，含量100.7％)0.1009g、维生素B6原料(批号：H898b－1705208，含量99.5％)0.20002g，和甲基橙皮苷原料(批号：D10170403，含量54.8％)0.20106g，精密量取利血平对照品贮备液2.0ml，置同一100ml量瓶中，加溶剂约30ml，超声使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为回收率贮备液。取按本品处方配制的混合辅料约0.1g(约相当于1片所含的辅料量)九份，置50ml量瓶中，每三份为一组(为低、中、高浓度)，低、中、高浓度分别加入回收率贮备液约4ml、5ml、6ml，加溶剂适量，超声溶解，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。回收率试验结果见表1，利血平、氢氯噻嗪、罗通定、甲橙皮苷、维生素B6对照品的平均回收率分别为104.0％、101.1％、98.8％、101.5％、101.5％，RSD分别为0.4％、0.7％、0.6％、0.8％、0.7％(n＝9)。
表1 含量测定回收率结果表
3.6耐用性试验：分别采用Thermo Acclaim C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱、WatersSymmetry C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱和phenomenex Luna C18(2)(250×4.6mm，5μm)色谱柱测定，按照“1.1”、“1.2”、“1.3”的色谱条件和供试品的制备方法进行进样分析，均符合系统适用性要求。图谱见图3、图4、图5。
3.7辅料干扰试验：按处方量制备辅料溶液和阴性对照，测定，辅料对含量测定无干扰，见图6～图10。
4.样品测定结果：取样品3批，按上述步骤进行测定，3批样品含量测定结果见表2(以WS-10001-(HD-0441)-2002标示量为标准)。
表2 复方利血平氢氯噻嗪片含量测定
本发明经与对照品溶液进样结果对比，保留时间、分离度、拖尾因子、理论板数等各项评价指标均符合药典的相关规定要求，测定结果能反映出复方利血平氢氯噻嗪片中利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6与甲基橙皮苷的含量。本发明方法简便快速，测定结果准确可靠，能够用于该药物含量测定项目的检验控制。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (5)
1.一种复方利血平氢氯噻嗪片的成分含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
取复方利血平氢氯噻嗪片，配制成供试品溶液；
将供试品溶液采用液相色谱仪分析，得到色谱图；
以外标法通过色谱图的峰面积计算出待测成分的含量；
所述液相色谱仪分析的色谱条件包括：以庚烷磺酸钠溶液为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱；
所述流动相A为0.2~0.5%的庚烷磺酸钠溶液，所述0.2~0.5%的庚烷磺酸钠溶液的配制方法为：取庚烷磺酸钠2~5g，加水600~800ml溶解，溶解后加入2~5ml三乙胺，调节pH至2.8~3.2，加水稀释至1000ml；
所述梯度洗脱条件为：0~8min，流动相A的体积分数变化为90%→70%，流动相B的体积分数变化为10%→30%，8~14min，流动相A的体积分数变化为70%→50%，流动相B的体积分数变化为30%→50%，14~15min，流动相A的体积分数变化为50%→40%，流动相B的体积分数变化为50%→60%，15~25min，流动相A的体积分数为40%，流动相B的体积分数为60%，25~25.01min，流动相A的体积分数变化为40%→90%，流动相B的体积分数变化为60%→10%，25.01~30min，流动相A的体积分数为90%，流动相B的体积分数为10%；
所述液相色谱仪分析的色谱条件还包括：检测波长为250~275nm，流速为0.8~1.2ml/min，进样体积为15~30μl；
色谱柱为Thermo Acclaim C18色谱柱、Waters Symmetry C18色谱柱或phenomenexLuna C18(2)色谱柱，所述色谱柱的规格均为250×4.6mm，5μm；
所述待测成分为利血平、氢氯噻嗪、罗通定、维生素B6和甲基橙皮苷。
2.根据权利要求1所述的复方利血平氢氯噻嗪片的成分含量测定方法，其特征在于，所述流动相A为0.4%的庚烷磺酸钠溶液，所述0.4%的庚烷磺酸钠溶液的配制方法为：取庚烷磺酸钠4g，加水800ml溶解，溶解后加入4ml三乙胺，调节pH至3，加水稀释至1000ml。
3.根据权利要求1所述的复方利血平氢氯噻嗪片的成分含量测定方法，其特征在于，所述检测波长为268nm，流速为1ml/min，进样体积为20μl。
4.根据权利要求1所述的复方利血平氢氯噻嗪片的成分含量测定方法，其特征在于，所述供试品溶液的配制方法为：取复方利血平氢氯噻嗪片1片，置于容器中，加溶剂使复方利血平氢氯噻嗪片溶解，用溶剂稀释至40~60ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
5.根据权利要求4所述的复方利血平氢氯噻嗪片的成分含量测定方法，其特征在于，所述溶剂由乙腈和水按照体积比1：0.5~2配制，并调节pH至2.8~3.2。
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