CN113125611A - 叶酸中杂质6-甲酰蝶呤含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种叶酸中杂质6‑甲酰蝶呤含量的检测方法。该方法以Agi l entSB‑CN为色谱柱，在高效液相色谱(HPLC)分离后，采用荧光检测器对叶酸中杂质6‑甲酰蝶呤进行定性和定量检测，并进行方法学验证。经实验验证，该方法能够实现对叶酸中微量的光敏杂质6‑甲酰蝶呤和蝶呤6‑羧酸的同步定量检测，该方法具有专属性强、快速、灵敏度高、准确度高等优点。本发明首次建立了叶酸中微量光敏杂质6‑甲酰蝶呤和蝶呤6‑羧酸的同步定量检测方法，便于对叶酸进行质量控制，从而提高了叶酸原料药的质量和用药安全性。

Description

叶酸中杂质6-甲酰蝶呤含量的检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种叶酸中杂质6-甲酰蝶呤含量的检测方法。特别地，涉及一种叶酸中微量光敏杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的同步定量检测方法。

背景技术

叶酸是一种维生素的基本品种，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质，对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用。人体缺少叶酸可导致红细胞的异常，未成熟细胞的增加，贫血以及白细胞减少；孕妇缺乏叶酸有可能导致胎儿出生时出现低体重、唇腭裂、心脏缺陷等。

叶酸极不稳定，易受紫外线、高温等影响而发生氧化。当暴露于紫外线辐射后，叶酸分子会裂解为对氨基苯甲酰基-L-谷氨酸(p-aminobenzoilglutamicacid,PABA-Glu)和6-甲酰蝶呤(6-formylpterin,FOP)，6-甲酰蝶呤在紫外线和氧气的作用下又会进一步转变为蝶呤6-羧酸(6-carboxypterin,CAP)，6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸反过来又会促进叶酸的光降解。此循环一旦开启，就会加速叶酸的光降解，使其杂质含量增加，使原料药质量下降，同时增加了用药安全性方面的安全隐患。

因此，对叶酸原料药中6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸杂质的含量进行监测非常重要。但是，由于6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸杂质在叶酸中的含量较低，因而采用常规高效液相色谱(HPLC)分离，结合紫外检测的方法无法检测。并且，6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的化学结构和理化性质接近，6-甲酰蝶呤在一定条件下还会向蝶呤6-羧酸转变，导致目前尚无能够将叶酸中的微量杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸分离，并实现对其同步定量检测的HPLC检测方法。因而，建立对叶酸中微量光敏杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的同步定量检测方法，对于对叶酸进行质量控制，以提高叶酸原料药的质量和用药安全性具有重要意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种叶酸中微量光敏杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的同步定量检测方法，并进行了方法学验证。经实验证明，该方法具有专属性强、快速、灵敏度高、准确度高等优点，能够可靠地对叶酸中微量光敏杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的同步定量检。

具体地，通过以下技术方案实现了本发明：

本发明提供了一种叶酸中杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的同步定量检测方法，将叶酸溶解后直接进样，采用HPLC分离结合荧光检测器对叶酸中6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸进行定性和定量检测，所述HPLC分离结合荧光检测器的色谱条件为：

色谱柱：AgilentSB-CN色谱柱；流速：0.8-1.2mL/min；柱温：33-37℃；流动相A：甲醇-含0.2％磷酸的水＝15：85-25：75；流动相B：甲醇-0.2％磷酸的水＝40：60-50：50；

梯度洗脱条件见下表1。

表1：梯度洗脱表

时间/min	流动相A/％	流动相B/％
			0	100	0
5	100	0
			10	0	100
15	0	100
			20	100	0

荧光检测器：激发波长350nm，发射波长450nm。

在一个优选的实施方式中，所述HPLC分离结合荧光检测器的色谱条件为：

色谱柱：AgilentSB-CN色谱柱，4.6×250mm，5μm；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；流动相A：甲醇-含0.2％磷酸的水＝20：80；流动相B：甲醇-0.2％磷酸的水＝45：55。

作为可选方式，在上述定量检测方法中，溶解叶酸、6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸采用的溶剂为28.6g/L碳酸钠溶液，稀释剂为按照体积比甲醇-水＝5：95。

作为可选方式，在上述定量检测方法中，建立6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的标准曲线，采用外标法测定叶酸中杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的含量。

作为可选方式，在上述定量检测方法中，所述定量检测方法中，叶酸峰的保留时间为3.8±0.1min，蝶呤6-羧酸的保留时间为10.7±0.1min和6-甲酰蝶呤的保留时间为15.5±0.1min。

作为可选方式，在上述定量检测方法中，所述定量检测的具体方法包括：

(1)取叶酸，用溶剂溶解并定容，配制成1mL中含有2mg叶酸的溶液，作为供试品溶液；

(2)分别取6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸，用溶剂溶解并定容，配制成1mL含有0.002mg6-甲酰蝶呤和0.002mg蝶呤6-羧酸的溶液，作为对照品溶液；

(3)取步骤(1)中制备得到的供试品溶液与步骤(2)中制备得到的对照品溶液，采用HPLC分离结合荧光检测器进行同步定量检测，记录色谱图；

(4)按照外标法，以峰面积计算叶酸中杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的含量。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

(1)本发明首次建立了叶酸中微量光敏杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的同步定量检测方法，便于对叶酸进行质量控制，从而提高了叶酸原料药的质量和用药安全性。

(2)采用本发明的叶酸中微量光敏杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的同步定量检测方法，能够使这两种杂质得到很好的分离，在本发明的定量检测方法中，叶酸峰的保留时间为3.8±0.1min，蝶呤6-羧酸的保留时间为10.7±0.1min和6-甲酰蝶呤的保留时间为15.5±0.1min。

(3)经实验证明，本发明方法具有专属性强、快速、灵敏度高、准确度高等优点，能够可靠地对叶酸中微量光敏杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸进行同步定量检测。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例：

1.主要仪器和试剂

(1)仪器：高效液相色谱仪器：Agilent 1200Series，配有荧光检测器，液相色谱仪运行软件为Agilent公司的ChemStation软件(RevB.04.01SP1)。

(2)试剂：超纯水，甲醇(色谱纯)，磷酸(色谱纯)。

2.实验方法

(1)色谱条件：

色谱柱：AgilentSB-CN色谱柱，4.6×250mm，5μm；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量：35μL；流动相A：甲醇-含0.2％磷酸的水＝20：80；流动相B：甲醇-0.2％磷酸的水＝45：55。

梯度洗脱条件见表1。

检测器：荧光检测器，激发波长350nm，发射波长450nm。

(2)溶液的制备：

1)专属性溶液的制备

精密称取6-甲酰蝶呤对照品20.05mg，置100mL容量瓶中，加溶剂28.6g/L碳酸钠溶液1ml溶解，加甲醇-水(体积比＝5：95)稀释至刻度，得到溶液1。

精密称取蝶呤6-羧酸对照品20.26mg，置100mL容量瓶中，加溶剂28.6g/L碳酸钠溶液1ml溶解，加甲醇-水(体积比＝5：95)稀释至刻度，得到溶液2。

精密称取四氢叶酸对照品20.18mg，置100mL容量瓶中，加溶剂28.6g/L碳酸钠溶液1ml溶解，加甲醇-水(体积比＝5：95)稀释至刻度，得到溶液3。

精密称取4-甲酰-四氢叶酸对照品20.21mg，置100mL容量瓶中，加溶剂28.6g/L碳酸钠溶液1ml溶解，加甲醇-水(体积比＝5：95)稀释至刻度，得到溶液4。

精密量取溶液11.0mL置100mL容量瓶中，用溶剂甲醇-水(体积比＝5：95)稀释置刻度，得到浓度为0.002005mg/mL的对照品溶液1。

精密量取溶液21.0mL置100mL容量瓶中，用溶剂甲醇-水(体积比＝5：95)稀释置刻度，得到浓度为0.002026mg/mL的对照品溶液2。

精密称取叶酸200.25mg，置100mL容量瓶中，加溶剂28.6g/L碳酸钠溶液1ml溶解，加甲醇-水(体积比＝5：95)稀释至刻度，得到供试品溶液。

精密称取叶酸20.17mg，置10mL容量瓶中，加溶剂28.6g/L碳酸钠溶液1ml溶解，分别量取溶液1-4各1.0mL置上述同一10mL容量瓶中，加溶剂甲醇-水(体积比＝5：95)稀释至刻度，得混合溶液。

2)线性溶液的制备

精密称取6-甲酰蝶呤对照品20.05mg，置100mL容量瓶中，用溶剂28.6g/L碳酸钠溶液1ml溶解，加甲醇-水(体积比＝5：95)稀释至刻度，精密量取1.0mL置100mL容量瓶中，用溶剂甲醇-水(体积比＝5：95)稀释至刻度，得到浓度为0.002005mg/mL的对照品溶液1。分别取对照品溶液10μL、20μL、30μL、40μL、50μL和60μL进样，得到线性溶液1。

精密称取蝶呤6-羧酸对照品20.26mg，置100mL容量瓶中，加溶剂28.6g/L碳酸钠溶液1ml溶解，加甲醇-水(体积比＝5：95)稀释至刻度，精密量取1.0mL置100mL容量瓶中，用溶剂甲醇-水(体积比＝5：95)稀释至刻度，得到浓度为0.002026mg/mL的对照品溶液2。分别取对照品溶液10μL、20μL、30μL、40μL、50μL和60μL进样，得到线性溶液2。

3)加标供试品溶液的制备

精密称取叶酸样品200mg，精确到0.01mg共6份，分别置于100mL容量瓶中，加溶剂28.6g/L碳酸钠溶液1ml溶解，加入溶液1和溶液2各1.0mL，再加入溶剂甲醇-水(体积比＝5：95)稀释至刻度，作为加标供试品溶液，计算本发明定量测定方法的重现性。在不同日期对同一样品进行相同检测，计算本发明定量测定方法的中间精密度。

配制加入不同浓度6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸对照品溶液1和2的加标供试品溶液，计算本发明定量测定方法的准确度。

4)HPLC检测

将“1)专属性溶液的制备”制备得到的对照品溶液、供试品溶液和混合溶液各35μL分别进样，按照本发明色谱条件进行HPLC检测，记录色谱图。结果表明，在本发明的定量检测方法中，叶酸峰的保留时间为3.805min，蝶呤6-羧酸的保留时间为10.704min和6-甲酰蝶呤的保留时间为15.496min，上述三者的色谱峰能够得到很好的分离，且在叶酸原料药中常见的其他杂质在本发明定量测定方法的荧光检测条件下无色谱峰或不干扰6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的定量测定。

对线性溶液1和线性溶液2进行检测，然后以6-甲酰蝶呤或蝶呤6-羧酸的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制线性标准曲线，通过外标法以峰面积S计算叶酸中杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的含量。

3.分析方法验证

(1)专属性

取对照品溶液1和对照品溶液2连续进样6次进行HPLC检测，得到6-甲酰蝶呤峰面积RSD＝0.95％，保留时间RSD＝0.01％，得到蝶呤6-羧酸峰面积RSD＝0.96％，保留时间RSD＝0.01％。

混合溶液中，6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的分离度为4.79，其他杂质和叶酸样品不干扰杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的测定。因此，本发明定量测定方法的专属性符合要求。

(2)线性

取“2)线性溶液的制备”中制备得到的线性溶液1和线性溶液2进行HPLC测定，所得结果分别以6-甲酰蝶呤或蝶呤6-羧酸的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。结果表明，6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的线性方程的相关系数均为r＝0.9999。因此，本发明定量测定方法的线性符合要求。

(3)重现性和中间精密度

取“3)加标供试品溶液的制备”中制备得到的叶酸样品进行重现性测定。不同日期取重现性实验的同一叶酸样品进行中间精密度测定。结果如下表2所示。

表2：重现性和中间精密度结果

(4)准确度

配制样品加入不同浓度6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸对照品溶液的供试品溶液，计算方法的准确度。结果如下表3所示。

表3：准确度结果

(5)耐用性

取“1)专属性溶液的制备”中制备的对照品溶液1和对照品溶液2，在48小时内重复进样，对照品溶液1和对照品溶液2峰面积相对标准偏差分别为1.03％和1.06％。

取“1)专属性溶液的制备”中制备得到的叶酸供试品溶液，在24小时内重复进样，在该叶酸供试品溶液中未检测到6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸。

(6)检测限

本发明方法的检测限(LOD)为取信噪比S/N大于3倍时6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的进样浓度，其通过计算6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸分别为8.9ng和9.1ng，百分比浓度分别为0.0070％和0.0075％。

(7)定量限

本发明方法的定量限(LOQ)为取信噪比S/N大于10倍时6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的进样浓度，通过计算6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸分别为40.45ng和41.87ng，其百分比浓度分别为0.035％和0.038％。

上述实验结果表明，本发明方法具有专属性强、快速、灵敏度高、准确度高等优点，能够可靠地对叶酸中微量光敏杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸进行同步定量检测。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种叶酸中杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的同步定量检测方法，其特征在于：将叶酸溶解后直接进样，采用HPLC分离结合荧光检测器对叶酸中6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸进行定性和定量检测，所述HPLC分离结合荧光检测器的色谱条件为：

色谱柱：AgilentSB-CN色谱柱；流速：0.8-1.2mL/min；柱温：33-37℃；流动相A：甲醇-含0.2％磷酸的水＝15：85-25：75；流动相B：甲醇-0.2％磷酸的水＝40：60-50：50；

梯度洗脱条件：

时间/min 流动相A/％ 流动相B/％ 0 100 0 5 100 0 10 0 100 15 0 100 20 100 0

荧光检测器：激发波长350nm，发射波长450nm。

2.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：所述HPLC分离结合荧光检测器的色谱条件为：

色谱柱：AgilentSB-CN色谱柱，4.6×250mm，5μm；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量：35μL；流动相A：甲醇-含0.2％磷酸的水＝20：80；流动相B：甲醇-0.2％磷酸的水＝45：55。

3.根据权利要求1或2所述的定量检测方法，其特征在于：溶解叶酸、6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸采用的溶剂为28.6g/L碳酸钠溶液，稀释剂为按照体积比甲醇-水＝5：95。

4.根据权利要求3所述的定量检测方法，其特征在于：建立6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的标准曲线，采用外标法测定叶酸中杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的含量。

5.根据权利要求3所述的定量检测方法，其特征在于：所述定量检测方法中，叶酸峰的保留时间为3.8±0.1min，蝶呤6-羧酸的保留时间为10.7±0.1min和6-甲酰蝶呤的保留时间为15.5±0.1min。

6.根据权利要求4所述的定量检测方法，其特征在于：所述定量检测的具体方法包括：

(1)取叶酸，用溶剂溶解并定容，配制成1mL中含有2mg叶酸的溶液，作为供试品溶液；

(2)分别取6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸，用溶剂溶解并定容，配制成1mL含有0.002mg6-甲酰蝶呤和0.002mg蝶呤6-羧酸的溶液，作为对照品溶液；

(3)取步骤(1)中制备得到的供试品溶液与步骤(2)中制备得到的对照品溶液，采用HPLC分离结合荧光检测器进行同步定量检测，记录色谱图；

(4)按照外标法，以峰面积计算叶酸中杂质6-甲酰蝶呤和蝶呤6-羧酸的含量。