CN103364501B - 红花中的掺假色素金橙ⅱ的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了一种红花中的掺假色素金橙Ⅱ的检测方法。本发明可解决目前仅用HPLC检测红花中金橙Ⅱ含量的方法致假阳性样品数量多、结果不够精确的缺点，以及液质联用成本过高的弊端。本发明公开的HPLC对比筛选法，可用于红花药材中色素金橙Ⅱ的检测，该法是通过HPLC分别测定红花样品中金橙Ⅱ和羟基红花黄色素A（HSYA）含量，经两者含量的对比筛选得出掺金橙Ⅱ的阳性样品；且经液质联用法确证了对比筛选法的结果。HSYA色谱分析条件：甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液（体积比为26:2:72）为流动相。金橙Ⅱ色谱分析条件：乙腈-0.025mol/L-磷酸二氢钾溶液（40:60）为流动相。本发明具有高效、准确、经济、适用面广泛等优点。
Description
技术领域
本发明涉及了一种红花中的掺假色素金橙Ⅱ的检测方法。
背景技术
红花为菊科植物红花（Carthamustinctorius L）的干燥花，具有活血化淤、止痛等功效。它对心血管系统有广泛而显著的作用，其中查耳酮苷类化合物——羟基红花黄色素A（HSYA）为其活血化瘀作用的主要有效成分。由于红花具有确切的临床疗效，因此已大量用于中成药生产和临床处方。
但由于红花价格较高，其存在普遍的掺伪现象。其中最常见的为金橙Ⅱ，又名酸性橙Ⅱ、二号橙、桔黄橙或酸性金黄Ⅱ，俗名金黄粉，化学名为2-萘酚偶氮对苯磺酸钠，是一种化工染料，主要用于皮革、纺织物染色，禁止作为食品添加剂使用。但其具有色泽鲜艳、着色稳定、价廉等特点，一些不法商贩将其用于药材生产与加工，严重危害了消费者健康。
目前有关红花的质量分析方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法，但利用高效液相色谱法仅检测红花中金橙Ⅱ的含量会导致过多假阳性样品的出现，从而大大削弱了检测的准确性。另外，若采用高效液相色谱-质谱联用法，检测仪器和费用往往比较昂贵,所以此法不能适应更大范围内各实验室的检测条件。据文献，未见仅用常规HPLC法来提高红花中金橙Ⅱ筛选精确度的报道。本发明通过高效液相色谱分别测定红花样品中金橙Ⅱ和羟基红花黄色素A的含量，并进行对比筛选分析，有效提高分析结果的准确性且降低检测成本。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种红花中的掺假色素金橙Ⅱ的检测方法。
一种红花中的掺假色素金橙Ⅱ的检测方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 精密称取红花样品粉末，以甲醇浸提得到红花样品的提取液，超声后离心此提取液，得澄清上清液，取该上清液经高效液相色谱法测得各样品中的羟基红花黄色素A的含量。
b. 精密称取红花样品粉末，用乙醇浸提得到提取液，超声后离心此提取液，得澄清上清液；取该上清液经高效液相色谱法测得各红花样品中金橙Ⅱ的含量。
c. 将步骤a和步骤b所得结果进行对比，将比值超过千分之二的待测品筛选为含有非法添加色素金橙Ⅱ的阳性样品。
上述检测羟基红花黄色素A含量的高效液相色谱法是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇、乙腈和0.01%磷酸溶液（体积比为26:2:72），并用磷酸调节至pH值为3.0；检测波长为403nm。
本发明通过高效液相色谱分别测定红花样品中金橙Ⅱ和羟基红花黄色素A的含量，并进行对比筛选分析，有效提高筛选结果的准确性且降低检测成本。
本发明建立的检测各红花样品中的羟基红花黄色素A含量的方法，是基于《中华人民共和国药典》2010版测定红花中羟基红花黄色素A含量的方法，但作了一些改进，例如《药典》中使用甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液（体积比为26:2:72）为流动相，本发明中HPLC的流动相选择为：甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液（体积比为26:2:72），以磷酸调pH为3.0，色谱柱可采用通用型的ODS柱，且避免了流动相pH值过低易损色谱柱的现象，本发明中的羟基红花黄色素A色谱检测方法具有分离效果好、对色谱柱耐pH 值的要求低、通用性强等特点。
本发明中检测红花中金橙Ⅱ的色谱检测方法，采用国家食品药品监督管理局《中药材及中药饮片药品补充检验方法和检验项目批准件》检测红花中金橙Ⅱ的色谱分析方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.025mol/L-磷酸二氢钾溶液（含0.2%三乙胺，并用磷酸调pH为3.0）（40:60）；检测波长为484nm。
本发明有以下优点：
① 本发明中建立检测红花样品中的羟基红花黄色素A含量方法，具有分离效果好、对色谱柱耐pH 值的要求低、通用性强等特点。
② 本发明中的对比筛选法，主要是运用HPLC法同时测定了样品中金橙Ⅱ和羟基红花黄色素A的含量，经比对分析限定了一个合适的比值范围，若其两者含量比大于千分之二的红花样品确定为掺假色素金橙Ⅱ的阳性样品。本发明仅用常规的HPLC法，大大节省了检测成本，比液质联用法的适用面更为普及和广泛。
③ 本发明在筛选红花中添加金橙Ⅱ的阳性样品的同时，检测各样品中羟基红花黄色素A的含量，也可作为评定红花品质的重要依据之一。
④ 本发明检测高效、成本低、简便、通用强，且易于掌握。
附图说明
图1 46个样品羟基红花黄色素A与金橙Ⅱ浓度曲线。其中A为羟基红花黄色素A（HSYA）B为金橙Ⅱ（OrangeⅡ）。
具体实施方式
1 仪器与试药
Shimadzu LC-6AD高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（SPD-M20A）。金橙Ⅱ对照品（Dr.Ehrenstorfer GmbH, 批号：91014）；羟基红花黄色素A对照品（中国药品生物制品检验所，批号：111637201106）；红花药材标准品（中国药品生物制品检验所，批号：120907-200609）；红花样品（不同产地的红花，共46种，由药师做生药学鉴定）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 液相色谱条件
2.1.1 羟基红花黄色素A液相色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-SP（4.6 mm ×250mm，5μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液（体积比为26：2：72；用磷酸调节至pH=3.0）；流速：0.7 mL/ min；柱温：40℃；检测波长403nm；进样量10μL。
2.1.2 金橙Ⅱ液相色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-SP（4.6 mm ×250mm，5μm）；流动相：乙腈-0.025mol/L-磷酸二氢钾溶液（含0.2%三乙胺，并用磷酸调pH为3.0）（40:60）；流速：1.0mL/ min ；柱温：40℃；检测波长484nm；进样量10μL。
2.2 对照品溶液制备
2.2.1 羟基红花黄色素A对照品溶液制备
精密称取羟基红花黄色素A对照品0.4 mg，用25%甲醇定容，作为对照品储备溶液（含羟基红花黄色素A的含量 0.2mg/mL）
2.2.2 金橙Ⅱ对照品溶液制备
精密称取金橙Ⅱ对照品0.4mg，用70%乙醇稀释定容，作为对照品储备溶液（金橙Ⅱ的含量为0.2mg/mL）
2.3 样品溶液制备
2.3.1 羟基红花黄色素A样品溶液制备
精密称取红花药材粉末（过40目筛）0.2g，精密加入25%甲醇25mL提取羟基红花黄色素A，超声处理40min，取出，冷却，称重，用25%甲醇补足重量后离心（10000g，15min），冷藏保存。色谱分析时取1mL，用0.45μm的有机系微孔膜过滤后备用。
2.3.2 金橙Ⅱ样品溶液制备
取红花药材粉末（过40目筛）0.4 g，精密加入70%乙醇4mL提取金橙Ⅱ，超声处理20min，取出，冷却，称重，用70%乙醇补足重量后离心（10000g，15min），冷藏保存。色谱分析时取1mL，用0.45μm的有机系微孔膜过滤后备用。
2.4 方法学考察
2.4.1 羟基红花黄色素A标准曲线制备
精密吸取羟基红花黄色素A对照品储备液（0.2mg/m L）0.5、1、2、4、6、8、10 mL 置于10 mL 容量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀。按“2.1.1”色谱条件测定，以样品质量浓度（mg/mL）为横坐标X，峰面积为纵坐标Y绘制标准曲线。计算回归方程为：Y = 344×107 X +4.24×104，r=0.9999，表明羟基红花黄色素A在0.01～0.2mg/mL的浓度范围内与峰面积成良好的线性关系。
2.4.1.1 进样精密度试验
精密称取红花标准对照品溶液，连续进样6次，每次进样量为10μL，计算相对标准偏差RSD值为0.31%。
2.4.1.2 重复性试验
取同一红花生药样品6份，按“2.3.1”方法制备供试品溶液并测定含量。测得羟基红花黄色素A含量的RSD值为1.49%（n=6），显示该方法重复性良好。
2.4.1.3 加样回收率试验
精密称取红花标准样品，按“2.3.1”方法制备该样品溶液。分别加入三份不同量的羟基红花黄色素A标准品，依次测定，计算回收率，见表1。
表1 加样回收率试验结果（n=3）
| 羟基红花黄色素A添加量/mg | 平均测定值/mg | 平均回收率/% | RSD/% |
| 1.00 | 2.87 | 101.08 | 1.81 |
| 2.00 | 3.86 | 98.63 | 0.94 |
| 3.00 | 4.89 | 99.07 | 1.72 |
2.4.2 金橙Ⅱ标准曲线制备
取金橙Ⅱ对照品溶液（0.2mg/mL）适量配制成0.02mg/mL溶液，分别精密吸取 1mL置于1，5，25，100，500mL容量瓶中，加70%乙醇溶液稀释至刻度，以及0.2mg/mL对照品溶液，按“2.1.2”色谱条件测定，以样品质量浓度（mg/mL）为横坐标X，峰面积为纵坐标Y绘制标准曲线。计算回归方程为：Y = 3.11×107 X +3.92×103，r =0.9999，表明金橙Ⅱ在4.0×10-5～0.2mg/mL的浓度范围内与峰面积成良好的线性关系。
2.5 样品检测
2.5.1 HPLC方法测定
将各样品的羟基红花黄色素A和金橙Ⅱ的浓度绘制成联合曲线，以样品编号为横坐标，样品检测浓度（mg/mL）为纵坐标绘制曲线, 见图1 。
2.5.2 对比法筛选添加金橙Ⅱ阳性样品
单独检测样品中金橙Ⅱ含量出现了多达26个可疑阳性样品，为了缩小假阳性样品的范围，使检测更加经济高效，通过图1同时比对样品中羟基红花黄色素A和金橙Ⅱ的含量，将金橙Ⅱ与HYSA含量比值超过千分之二的样品，筛选为含非法添加色素金橙Ⅱ的阳性样品，即15、16号样品。
将所有46个红花样品，经液相质谱联用法，测定各个样品中金橙Ⅱ的含量。根据样品与标准对照品溶液的保留时间，以及碎片信号比值来判定，确定样品15和16中含有金橙Ⅱ，验证了HPLC对比筛选法结果的准确性。
Claims (2)
1.一种红花中的掺假色素金橙Ⅱ的检测方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 精密称取红花样品粉末，以甲醇浸提得到红花样品的提取液，超声后离心此提取液，得澄清上清液，取该上清液经高效液相色谱法测得各样品中的羟基红花黄色素A的含量；
b. 精密称取红花样品粉末，用乙醇浸提得到提取液，超声后离心此提取液，得澄清上清液；取该上清液经高效液相色谱法测得各红花样品金橙Ⅱ的含量；
c. 将步骤a和步骤b所得结果进行对比，将比值超过一定范围的待测品筛选为含有非法添加色素金橙Ⅱ的阳性样品。
2.根据权利要求1所述的红花中的掺假色素金橙Ⅱ的检测方法，其特征在于所述的高效液相色谱法是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇、乙腈和0.01%磷酸溶液，体积比为26:2:72，并用磷酸调节至pH值为3.0；检测波长为403nm。
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