CN104897832A

CN104897832A - 转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法

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Publication number: CN104897832A
Application number: CN201510246537.0A
Authority: CN
Inventors: 陶玉
Original assignee: Xi'an Jinhua Pharmaceutical Factory Of Jinhua Enterprise Co (group) Ltd Co
Current assignee: Xi'an Jinhua Pharmaceutical Factory Of Jinhua Enterprise Co (group) Ltd Co
Priority date: 2015-05-14
Filing date: 2015-05-14
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2035-05-14
Also published as: CN104897832B

Abstract

本发明提供一种转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法：精密量取衍生后的供试品溶液注入液相色谱仪，以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液为流动相A，以甲醇-乙腈-水为流动相B，利用流动相A-流动相B进行梯度洗脱，记录色谱图，从标准曲线回归方程中求出供试品中游离氨基酸含量。通过筛选流动相组成，使液相色谱图中各氨基酸峰峰形好，分离度高，大大降低了相邻组分峰间的重叠比例，提高了检测准确度，适用于转移因子溶液及其相关制剂中的游离氨基酸的检测，以便对转移因子的生产及其制剂实施有效的监督控制。

Description

转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法

技术领域

本发明属于医药分析领域，涉及一种利用高效液相色谱检测转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的方法。

背景技术

转移因子(transter factor，简称TF)又称传输因子，由具有细胞性免疫功能的淋巴细胞产生，作为一种特定的细胞因子参与机体的免疫反应，能提高动物机体细胞免疫功能，促进机体抗感染和防御能力。转移因子属于多肽类物质，是由多核苷酸、多肽及其他成分组成的复合分子。其中小分子肽类物质是转移因子的功能标示物，并作为其主要功效成分。而氨基酸是组成多肽的基本单元，是转移因子的关键质量指标。因此，准确测定转移因子中的游离氨基酸含量对于优化转移因子生产工艺及控制产品质量具有重要的意义。

迄今为止，已有较多关于采用高效液相色谱法对转移因子中游离氨基酸进行检测的报道，但由于转移因子组分复杂，报道的检测方法测定色谱图中，存在相邻组分峰间有较大程度重叠的情况，导致检测结果出现较大偏差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法，其能够实现对转移因子中游离氨基酸进行准确定量，显著改善相邻组分峰间的重叠程度。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1)制备供试品溶液；

2)供试品溶液的衍生

精密量取所述供试品溶液2.0mL，并置于10mL具塞试管中；然后向所述具塞试管中加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液0.8～1.0mL以及1mol/L三乙胺乙腈溶液0.4～0.6mL并摇匀，然后于室温下反应1～2小时，反应结束后用正己烷萃取，取萃取得到的下层溶液用滤膜过滤，收集滤液，得衍生后的供试品溶液；

3)测定

精密量取衍生后的供试品溶液，并注入高效液相色谱仪，以0.05～0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液为流动相A，以甲醇、乙腈和水的混合液为流动相B，利用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，记录色谱图，根据标准曲线回归方程求出供试品中游离氨基酸含量，所述梯度洗脱中流动相A与流动相B的体积比为：0min时为97:3，15min时为88:12，20min时为85:15，50min时为50:50，50.1min时为0:100，55min时为0:100，56min时为97:3，70min时为97:3。

所述供试品溶液的制备方法为：精密量取固体转移因子制剂的水溶液、液体转移因子制剂或转移因子溶液并置于量瓶中，加水稀释至刻度后摇匀，得供试品溶液。

所述供试品溶液中多肽的质量浓度为0.4～0.6mg/mL。

所述高效液相色谱仪的色谱柱填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶；所述十八烷基硅烷键合硅胶的粒度为5～10μm，优选5μm；所述色谱柱的内径为2～5mm，优选4.6mm；所述色谱柱的长度为10～30cm，优选25cm。

所述流动相A的pH值为6.0～6.5，优选6.3(用冰醋酸调节pH值)；所述流动相B中甲醇:乙腈:水的体积比为(15～25):(55～65):(15～25)，优选为(20:60:20)。

所述检测方法中，检测波长为210～320nm，优选254nm。

所述检测方法中，进样量为1～50μL，优选2μL。

所述检测方法中，洗脱流速为0.5～2mL/min，优选1mL/min。

所述检测方法中，柱温为20～50℃，优选35℃。

与现有技术相比，本发明的优点至少在于：采用高效液相色谱法测定转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸的含量，通过筛选流动相组成以及梯度洗脱的体积比，使液相色谱图中各氨基酸峰峰形好，分离度高，大大降低了相邻组分峰间的重叠比例，提高了检测准确度，适用于转移因子溶液及其相关制剂中的游离氨基酸的检测，以便对转移因子的生产及其制剂实施有效的监督控制。

通过筛选色谱柱、流动相pH值、色谱柱柱温等措施，进一步确定了最优检测色谱条件，进一步提高了检测准确度，液相色谱图中各氨基酸峰分离度得到提高。

附图说明

图1为本发明实施例中18种氨基酸对照品溶液的液相色谱图。

图2为本发明实施例中转移因子溶液供试品的液相色谱图。

图3为本发明实施例中转移因子口服溶液供试品的液相色谱图。

图4为本发明实施例中转移因子胶囊供试品的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但是，这些实施例仅是用于说明本发明，而不是对本发明范围的限制。

本发明依据18种常见氨基酸的性质及转移因子溶液中所含游离氨基酸的情况，建立检测色谱条件；对建立的色谱条件进行系统的方法学验证研究，并由对照品图谱中氨基酸浓度与氨基酸峰面积之间存在的线性关系，实现对游离氨基酸含量的准确测定。以及，利用所述检测色谱条件对不同批次转移因子溶液及其制剂样品进行游离氨基酸含量测定，验证了方法的适用性。氨基酸对照品包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及盐酸赖氨酸。

1.色谱条件

采用Dionex高效液相色谱仪，使用填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱(岛津，Shim-pack VP-ODS，4.6mm×250mm，5μm)；以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液(用冰醋酸调节pH值为6.3)为流动相A，甲醇-乙腈-水(甲醇:乙腈:水的体积比20:60:20)为流动相B，照下表进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL，检测波长为254nm，柱温为35℃，进样体积为2μL。

表1洗脱梯度时间表

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	97	3
15	88	12
			20	85	15
50	50	50
			50.1	0	100
55	0	100
			56	97	3
70	97	3

2.标准曲线的测定：

对照品贮备液的制备精密称取18种常见氨基酸对照品：门冬氨酸对照品12.0mg、谷氨酸对照品13.5mg、丝氨酸对照品13.5mg、甘氨酸对照品12.0mg、组氨酸对照品20.0mg、精氨酸对照品20.0mg、苏氨酸对照品17.5mg、丙氨酸对照品12.0mg、脯氨酸对照品15.0mg、酪氨酸对照品17.0mg、缬氨酸对照品11.0mg、甲硫氨酸对照品12.0mg、胱氨酸对照品17.0mg、异亮氨酸对照品12.5mg、亮氨酸对照品12.5mg、苯丙氨酸对照品17.0mg、色氨酸对照品15.0mg、盐酸赖氨酸对照品10.0mg，分置于50mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。

标准曲线系列溶液的制备以其中一种氨基酸对照品为例，分别精密量取对照品贮备液0.5mL、2mL、5mL、10mL，分置于20mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液1～4；对照品溶液5同对照品贮备液。

标准曲线系列溶液的衍生分别精密量取上述标准曲线系列溶液各2.0mL，分置于10mL具塞试管中；加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液1.0mL以及1mol/L三乙胺乙腈溶液0.5mL，摇匀，室温下反应1小时后，加入4mL正己烷萃取，静置10分钟，取下层溶液用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液即得。

测定法分别精密量取上述衍生后的标准曲线系列溶液各2μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以总氨基酸浓度对总峰面积按最小二乘法进行线性回归，求出标准曲线方程及线性相关系数(r>0.999)。

3.样品的测定：

供试品溶液的制备取供试品适量，加水稀释制成每1mL中含多肽约为0.5mg的溶液，作为供试品溶液；供试品溶液中若存在不溶于水的辅料，则需过滤处理，取续滤液检测。

供试品溶液的衍生精密量取上述供试品溶液2.0mL，置10mL具塞试管中；加入0.1moL/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液1.0mL以及1mol/L三乙胺乙腈溶液0.5mL，摇匀，室温下反应1小时后，加入4mL正己烷萃取，静置10分钟，取下层溶液用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液即得。

测定法精密量取上述衍生后的供试品溶液2μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。从标准曲线方程中求出游离氨基酸含量。

实例1转移因子溶液中游离氨基酸含量的检测

照上述色谱条件及试验方法对转移因子溶液中游离氨基酸含量进行检测。18种氨基酸对照品溶液的液相色谱图如图1所示：18种氨基酸按极性由大到小的顺序依次出峰，在检测用色谱柱上有很好的分离效果，18种氨基酸峰间的分离度均大于2.0，符合中国药典要求；且各氨基酸峰的理论板数均大于20000，保证了游离氨基酸含量测定的准确性。转移因子溶液供试品的液相色谱图如图2所示：各组分在检测用色谱柱上有很好的分离效果，18种氨基酸峰间及氨基酸峰与相邻其他组分峰间均能较好分离，各组分峰的理论板数也均较高且平行配制6份样品测定，结果的相对标准偏差RSD％值小于2；说明采用本发明的方法检测转移因子溶液中游离氨基酸含量，结果准确、可靠，可有效地监控转移因子溶液质量。

实例2转移因子口服溶液中游离氨基酸含量的检测

照上述色谱条件及试验方法对转移因子口服溶液中游离氨基酸含量进行检测。转移因子口服溶液供试品的液相色谱图如图3所示：各组分在检测用色谱柱上有很好的分离效果，18种氨基酸峰间及氨基酸峰与相邻其他组分峰间均能较好分离，各组分峰的理论板数也均较高且平行配制6份样品测定，结果的相对标准偏差RSD％值小于2；说明采用本发明的方法检测转移因子口服溶液中游离氨基酸含量，结果准确、可靠，可有效地监控转移因子口服溶液质量。

实例3转移因子胶囊中游离氨基酸含量的检测

照上述色谱条件及试验方法对转移因子胶囊中游离氨基酸含量进行检测。转移因子胶囊供试品的液相色谱图如图4所示：各组分在检测用色谱柱上有很好的分离效果，18种氨基酸峰间及氨基酸峰与相邻其他组分峰间均能较好分离，各组分峰的理论板数也均较高且平行配制6份样品测定，结果的相对标准偏差RSD％值小于2；说明采用本发明的方法检测转移因子胶囊中游离氨基酸含量，结果准确、可靠，可有效地监控转移因子胶囊质量。

Claims

1.一种转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)制备供试品溶液；

2)供试品溶液的衍生

精密量取所述供试品溶液2.0mL，并置于具塞试管中；然后向所述具塞试管中加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液0.8～1.0mL以及1mol/L三乙胺乙腈溶液0.4～0.6mL并摇匀，然后于室温下反应1～2小时，反应结束后用正己烷萃取，取萃取得到的下层溶液用滤膜过滤，收集滤液，得衍生后的供试品溶液；

3)测定

2.根据权利要求1所述一种转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述供试品溶液的制备方法为：精密量取固体转移因子制剂的水溶液、液体转移因子制剂或转移因子溶液并置于量瓶中，加水稀释至刻度后摇匀，得供试品溶液。

3.根据权利要求1所述一种转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述供试品溶液中多肽的质量浓度为0.4～0.6mg/mL。

4.根据权利要求1所述一种转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪的色谱柱填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶；所述十八烷基硅烷键合硅胶的粒度为5～10μm；所述色谱柱的内径为2～5mm；所述色谱柱的长度为10～30cm。

5.根据权利要求1所述一种转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述流动相A的pH值为6.0～6.5；所述流动相B中甲醇:乙腈:水的体积比为(15～25):(55～65):(15～25)。

6.根据权利要求1所述一种转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述检测方法中，检测波长为210～320nm。

7.根据权利要求1所述一种转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述检测方法中，进样量为1～50μL。

8.根据权利要求1所述一种转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述检测方法中，洗脱流速为0.5～2mL/min。

9.根据权利要求1所述一种转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述检测方法中，柱温为20～50℃。