TWI807910B - 游離胺基酸之分析方法 - Google Patents

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曾俊茂
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  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本發明提供一種游離胺基酸之分析方法，包括：製備待測樣品；以及以高效液相分析儀串聯螢光檢測器系統對該待測樣品進行層析分離和檢測；其中該高效液相分析儀設置有碳18逆相管柱；以及該分析方法包括：將該待測樣品注入該碳18逆相管柱；以及以移動相沖提該碳18逆相管柱；其中該移動相包括第一溶液、第二溶液和第三溶液；該移動相之流速為0.8~1.0 mL/min。

Description

游離胺基酸之分析方法
一種游離胺基酸之分析方法，更詳而言之，係一種可分析液體樣品中多種游離胺基酸之分析方法。
飲品的風味，例如甘味或鮮味，的來源是來自於飲品中的游離胺基酸，例如茶胺酸、天門冬醯酸等等。
但目前市面上對於游離胺基酸的標準檢測方法僅能同時分析同一樣品中的18種游離胺基酸，包括天門冬胺酸(Aspartate)、麩胺酸(Glutamate)、絲胺酸(Serine)、甘胺酸(Glycine)、組織胺酸(Histidine)、蘇胺酸(Threonine)、精胺酸(Arginine)、丙胺酸(Alanine)、脯胺酸(Proline)、酪胺酸(Tyrosine)、半胱胺酸(half-Cysteine,half-Cys)、纈胺酸(Valine)、甲硫胺酸(Methionine)、異白胺酸(Isoleucine)、白胺酸(Leucine)、賴胺酸(Lysine)和苯丙胺酸(Phenylalanine)和脯胺酸(Proline)。
由此可知，目前使用之游離胺基酸分析方法仍然無法有效同時分析對於飲品風味影響甚鉅的茶胺酸、天門冬醯酸等胺基酸。
本發明提供一種游離胺基酸之分析方法，包括：製備待測樣品；以及以高效液相分析儀串聯螢光檢測器系統對該待測樣品進行層析分離和檢測；其中該高效液相分析儀設置有碳18逆相管柱；以及該分析方法包括：將該待測樣品注入該碳18逆相管柱；以移動相沖提該碳18逆相管柱；以及其中該移動相包括第一溶液、第二溶液和第三溶液；該移動相之流速為0.8~1.0mL/min。
根據本發明一實施方式，其中該第一溶液為10%甲醇，以及該第二溶液為氰甲烷。
根據本發明一實施方式，其中該第三溶液包括緩衝溶液。
根據本發明一實施方式，其中該緩衝溶液為醋酸鈉溶液。
根據本發明一實施方式，其中該緩衝溶液之pH值為5.5~7.0。
根據本發明一實施方式，其中該緩衝溶液包括第一醋酸鈉溶液和第二醋酸鈉溶液。
根據本發明一實施方式，其中該移動相中該第一溶液佔該移動相之比例為0~40%；該第二溶劑佔該移動相之比例為0~60%；以及該第三溶液佔該移動相之比例為0~100%。
根據本發明一實施方式，其中該以移動相沖提該碳18逆相管柱之步驟包括利用梯度沖提法以移動相沖提該碳18逆相管柱。
相較於習知技術，本發明所提供的游離胺基酸之分析方法除了可以分析基本的18種胺基酸，還可以同時分析提供飲品中甘味和鮮味的其他游離胺基酸，本發明所提供的游離胺基酸之分析方法能夠有效率地檢測飲品中的各種胺基酸，進而快速地分析該飲品之風味。
S1、S2:步驟
圖1為本發明例示性實施例之流程圖。
圖2~5為本發明之實施例之層析圖譜。
圖6和7為比較例所使用之習知技術之層析圖譜。
以下藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟悉此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之其他優點及功效。
須知，本說明書所附圖式所繪示之結構、比例、大小等，均僅用以配合說明書所揭示之內容，以供熟悉此技藝之人士之瞭解與閱讀，並非用以限定本發明可實施之限定條件，故不具技術上之實質意義，任何結構之修飾、比例關係之改變或大小之調整，在不影響本發明所能產生之功效及所能達成之目的下，均應落在本發明所揭示之技術內容得能涵蓋之範圍內。同時，本說明書中所引用之如「上」、「內」、「外」、「底」及「一」等之用語，亦僅為便於敘述之明瞭，而非用以限定本發明可實施之範圍，其相對關係之改變或調整，在無實質變更技術內容下，當亦視為本發明可實施之範疇，合先敘明。
請參閱圖1，其為本發明例示性實施例之分析方法流程圖。
本發明提供一種游離胺基酸之分析方法，包括：製備待測樣品；以及以高效液相分析儀串聯螢光檢測器系統對該待測樣品進行層析分離和檢測；其中該高效液相分析儀設置有碳18逆相管柱；以及該分析方法包括：將該待測樣品注入該碳18逆相管柱；以移動相沖提該碳18逆相管柱；以及其中該移動相包括第一溶液、第二溶液和第三溶液；該移動相之流速為0.8~1.0mL/min。
根據本發明一實施方式，其中該第一溶液為10%甲醇，以及該第二溶液為氰甲烷。
根據本發明一實施方式，其中該第三溶液包括緩衝溶液。
根據本發明一實施方式，其中該緩衝溶液為醋酸鈉溶液。
根據本發明一實施方式，其中該緩衝溶液之pH值為5.5~7.0。
根據本發明一實施方式，其中該緩衝溶液包括第一醋酸鈉溶液和第二醋酸鈉溶液。
根據本發明一實施方式，其中該第一醋酸鈉溶液之pH值可為5.5~5.9；以及該第二醋酸鈉溶液之pH值可為6.6~7.0，但不限於此。
根據本發明一實施方式，其中該移動相中該第一溶液佔該移動相之比例為0~40%；該第二溶劑佔該移動相之比例為0~60%；以及該第三溶液佔該移動相之比例為0~100%。
根據本發明一實施方式，其中該以移動相沖提該碳18逆相管柱之步驟包括利用梯度沖提法以移動相沖提該碳18逆相管柱。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，包括：(1)自第0至第0.5分鐘，由0%：0%：100%至0%：1%：99%；(2)自第0.5至第17分鐘，由0%：1%：99%至0%：2%：98%；(3)自第17至第24分鐘，由0%：2%：98%至0%：4~5%：95~96%；以及(4)自第24至第32分鐘，由0%：4~5%：95~96%至0%：7~12%：88~93%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%； (3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13~14%：86~87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13~14%：86~87%至0%：15%：85%；(5)自第48至第48.1分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第48.1至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第49分鐘，由0%：13%：87%至0%：13~15%：85~87%；(5)自第49至第50.5分鐘，由0%：13~15%：85~87%至40%：60%：0%；(6)自第50.5至第52分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第52至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第49分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第49至第50.5分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第50.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第48至第48.1分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第48.1至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第36分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13~14%：86~87%；(4)自第36至第48分鐘，由0%：13~14%：86~87%至0%：14~15%：85~86%；(5)自第48至第48.1分鐘，由0%：14~15%：85~86%至40%：60%：0%；(6)自第48.1至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：17%：83%； (5)自第48至第48.1分鐘，由0%：17%：83%至40%：60%：0%；(6)自第48.1至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.2分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.2至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第48至第49.1分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第49.1至第52分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第52至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：18%：82%；(5)自第48至第49.5分鐘，由0%：18%：82%至40%：60%：0%；(6)自第49.5至第52分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第52至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%； (2)自第33.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至40%：60%：0%；(5)自第48至第49分鐘，由40%：60%：0%至0%：15%：85%；(6)自第49至第50.5分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第50.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：89.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：16%：84%；(5)自第48至第49.5分鐘，由0%：16%：84%至40%：60%：0%；(6)自第49.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.8分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(3)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：16%：84%；(4)自第48至第49.5分鐘，由0%：16%：84%至40%：60%：0%；(5)自第49.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(6)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第50分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第50至第52分鐘，由0%：15%：85%至0%：0%：100%；以及(6)自第52至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第50.5分鐘，由0%：13%：87%至40%：60%：0%；(5)自第50.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(6)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第36.5分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第36.5至第49分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第49至第50.5分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第50.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及 (7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第40分鐘，由0%：13%：87%至0%：13.5%：86.5%；(5)自第40至第49分鐘，由0%：13.5%：86.5%至0%：14.5%：85.5%；(6)自第49至第50.5分鐘，由0%：14.5%：85.5%至40%：60%：0%；(7)自第50.5至第52.5分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(8)自第52.5至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第48至第48.1分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第48.1至第51分鐘，由0%：14.5%：85.5%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%； (3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第47.9分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第47.9至第48分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第48至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第40分鐘，由0%：13%：87%至0%：13.5%：86.5%；(5)自第40至第45分鐘，由0%：13.5%：86.5%至0%：15%：85%；(6)自第45至第48分鐘，由0%：15%：85%至0%：20%：80%；(7)自第48至第48.1分鐘，由0%：20%：80%至40%：60%：0%；(8)自第48.1至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；(9)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%；以及(10)自第75至第110分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，包括：(1)自第0至第0.5分鐘，由0%：0%：100%至0%：1%：99%；(2)自第0.5至第17分鐘，由0%：1%：99%至0%：2%：98%；(3)自第17至第23分鐘，由0%：2%：98%至0%：4%：96%；以及(4)自第23至第32分鐘，由0%：4%：96%至0%：12%：88%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.5分鐘，由0%：12%：88%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第48至第48.1分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第48至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，包括：(1)自第0至第0.5分鐘，由0%：0%：100%至0%：1%：99%；(2)自第0.5至第17分鐘，由0%：1%：99%至0%：2%：98%；以及(3)自第17至第32分鐘，由0%：2%：98%至0%：7%：93%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.8分鐘，由0%：7%：93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(3)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：16%：84%；(4)自第48至第49.5分鐘，由0%：16%：84%至40%：60%：0%；(6)自第49.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，包括： (1)自第0至第0.5分鐘，由0%：0%：100%至0%：1%：99%；以及(2)自第0.5至第15分鐘，由0%：1%：99%至0%：2%：98%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第15至第24分鐘，由0%：2%：98%至0%：5%：95%；(2)自第24至第32分鐘，由0%：5%：95%至0%：7%：93%；(3)自第32至第33.8分鐘，由0%：7%：93%至0%：12.5%：87.5%；(4)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(5)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：16%：84%；(6)自第48至第49.5分鐘，由0%：16%：84%至40%：60%：0%；(7)自第49.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(8)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
根據本發明一實施方式，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第15至第32分鐘，由0%：5%：95%至0%：7%：93%；(2)自第32至第33.8分鐘，由0%：7%：93%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第48分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：16%：84%；(4)自第48至第49.5分鐘，由0%：16%：84%至40%：60%：0%；(5)自第49.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(6)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
本發明所提供之分析方法係用以分離並測定待測樣品中之一或多種游離胺基酸。
根據本發明一實施方式，其中該游離胺基酸包括至少一種胺基酸選自由天門冬胺酸(Aspartate)、麩胺酸(Glutamate)、絲胺酸(Serine)、 甘胺酸(Glycine)、組織胺酸(Histidine)、蘇胺酸(Threonine)、精胺酸(Arginine)、丙胺酸(Alanine)、脯胺酸(Proline)、酪胺酸(Tyrosine)、半胱胺酸(half-Cysteine,half-Cys)、纈胺酸(Valine)、甲硫胺酸(Methionine)、異白胺酸(Isoleucine)、白胺酸(Leucine)、賴胺酸(Lysine)、苯丙胺酸(Phenylalanine)和脯胺酸(Proline)所組成的群組中。
根據本發明一實施方式，其中該游離胺基酸還包括至少一種胺基酸選自由天門冬醯酸(Asparagine)、γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid)、麩醯胺酸(Glutamine)、鳥氨酸(Ornithine)、牛磺酸(Taurine)和茶胺酸(Theanine)所組成的群組中。
下列實施例用於闡明本發明。這些實施例絕非意欲限制所述方法及系統的範圍。
實施例1
根據本發明之游離胺基酸之分析方法，首先製備待測樣品；以及以高效液相分析儀串聯螢光檢測器系統對該待測樣品進行層析分離和檢測，該高效液相分析儀設置有碳18逆相管柱；將該待測樣品注入該碳18逆相管柱；利用梯度沖提法以移動相沖提該碳18逆相管柱；該移動相包括第一溶液、第二溶液和第三溶液，其流速為0.8~1.0mL/min，其中，該第一溶液為10%甲醇，該第二溶液為氰甲烷，該第一醋酸鈉溶液為pH 5.5~5.9之醋酸鈉溶液，以及該第二醋酸鈉溶液為pH 6.6~7.0之醋酸鈉溶液，該移動相之梯度設定如下表1。
Figure 111125735-A0305-02-0015-1
Figure 111125735-A0305-02-0016-2
實施例2
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表2。
Figure 111125735-A0305-02-0016-3
實施例3
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表3。
Figure 111125735-A0305-02-0017-4
實施例4
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表4。
Figure 111125735-A0305-02-0017-5
Figure 111125735-A0305-02-0018-6
實施例5
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表5。
Figure 111125735-A0305-02-0018-7
實施例6
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表6。
Figure 111125735-A0305-02-0019-8
實施例9
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表7。
Figure 111125735-A0305-02-0019-9
Figure 111125735-A0305-02-0020-10
實施例10
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表8。
Figure 111125735-A0305-02-0020-11
實施例11
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表9。
表9
Figure 111125735-A0305-02-0021-12
實施例12
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表10。
Figure 111125735-A0305-02-0021-13
Figure 111125735-A0305-02-0022-14
實施例13
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表11。
Figure 111125735-A0305-02-0022-15
實施例14
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表12。
Figure 111125735-A0305-02-0022-16
Figure 111125735-A0305-02-0023-17
實施例15
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表13。
Figure 111125735-A0305-02-0023-18
Figure 111125735-A0305-02-0024-19
實施例16
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表14。
Figure 111125735-A0305-02-0024-20
實施例17
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表15。
Figure 111125735-A0305-02-0024-21
Figure 111125735-A0305-02-0025-22
實施例18
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表16。
Figure 111125735-A0305-02-0025-23
實施例19
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表17。
Figure 111125735-A0305-02-0026-24
實施例20
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表18。
Figure 111125735-A0305-02-0026-25
Figure 111125735-A0305-02-0027-26
實施例21
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表19。
Figure 111125735-A0305-02-0027-27
實施例22
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表20。
Figure 111125735-A0305-02-0028-28
實施例23
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表21。
Figure 111125735-A0305-02-0028-29
Figure 111125735-A0305-02-0029-30
實施例24
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表22。
Figure 111125735-A0305-02-0029-31
實施例25
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表23。
Figure 111125735-A0305-02-0029-32
Figure 111125735-A0305-02-0030-33
實施例26
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表24。以本實施例方法針對包含基本18種胺基酸、天門冬醯酸(Asparagine)、γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid)、麩醯胺酸(Glutamine)、鳥氨酸(Ornithine)、牛磺酸(Taurine)和茶胺酸(Theanine)之待測樣品分析後，所得之層析圖譜如圖2所示。請參閱圖2，其中數字1~23所指之波峰分別代表不同胺基酸，1：天門冬胺酸(Aspartate，ASP)；2：麩胺酸(Glutamate，GLU)；3：絲胺酸(Serine，SER)；4：天門冬醯胺(Asparagine，ASN)；5：甘胺酸(Glycine，GLY)；6：麩醯胺酸(Glutamine，GLN)；7：組胺酸(Histidine，HIS)；8：牛磺酸(Taurine)；9：蘇胺酸(Threonine，THR)；10：精胺酸(Arginine，ARG)；11：丙胺酸(Alanine，ALA)；12：γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid，γ-GABA)；13：脯胺酸(Proline，PRO)；14：茶胺酸(Theanine)；15：酪胺酸(Tyrosine，TYR)；16：半胱胺酸(Cysteine，Half-CYS)；17：纈胺酸(Valine，VAL)；18：甲硫胺酸(Methionine，MET)；19：異白胺酸(Isoleucine，ILE)；20：鳥氨酸(Ornithine，ORN)； 21：白胺酸(Leucine，LEU)；22：離胺酸(Lysine，LYS)；23：苯丙胺酸(Phenylalanine，PHE)。
如圖2所示，可以發現本發明實施例所提供之方法除了能夠分離基本18種胺基酸外，還可有效分離另外添加之6種與茶飲風味相關之6種胺基酸。
Figure 111125735-A0305-02-0031-34
實施例27
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表25。
Figure 111125735-A0305-02-0031-35
Figure 111125735-A0305-02-0032-36
實施例28
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表26。
Figure 111125735-A0305-02-0032-37
實施例29
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表27。
Figure 111125735-A0305-02-0033-38
實施例30
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表28。
Figure 111125735-A0305-02-0033-39
Figure 111125735-A0305-02-0034-40
實施例31
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表29。
Figure 111125735-A0305-02-0034-41
實施例32
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表30。
Figure 111125735-A0305-02-0035-42
實施例33
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表31。
Figure 111125735-A0305-02-0035-43
Figure 111125735-A0305-02-0036-44
實施例34
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表32，管柱溫度設定為39℃。以本實施例方法針對包含基本18種胺基酸、天門冬醯酸(Asparagine)、γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid)、麩醯胺酸(Glutamine)、鳥氨酸(Ornithine)、牛磺酸(Taurine)和茶胺酸(Theanine)之待測樣品分析後，所得之層析圖譜如圖3所示。請參閱圖3，其中數字1~23所指之波峰分別代表不同胺基酸，1：天門冬胺酸(Aspartate，ASP)；2：麩胺酸(Glutamate，GLU)；3：絲胺酸(Serine，SER)；4：天門冬醯胺(Asparagine，ASN)；5：甘胺酸(Glycine，GLY)；6：麩醯胺酸(Glutamine，GLN)；7：組胺酸(Histidine，HIS)；8：牛磺酸(Taurine)；9：蘇胺酸(Threonine，THR)；10：精胺酸(Arginine，ARG)；11：丙胺酸(Alanine，ALA)；12：γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid，γ-GABA)；13：脯胺酸(Proline，PRO)；14：茶胺酸(Theanine)；15：酪胺酸(Tyrosine，TYR)；16：半胱胺酸(Cysteine，Half-CYS)；17：纈胺酸(Valine，VAL)；18：甲硫胺酸(Methionine，MET)；19：異白胺酸(Isoleucine，ILE)；20：鳥氨酸(Ornithine，ORN)；21：白胺酸(Leucine，LEU)；22：離胺酸(Lysine，LYS)；23：苯丙胺酸(Phenylalanine，PHE)。
如圖3所示，可以發現本發明實施例所提供之方法能夠有效分離上述23種胺基酸。
Figure 111125735-A0305-02-0037-45
實施例35
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表33，管柱溫度設定為39℃。
Figure 111125735-A0305-02-0037-46
Figure 111125735-A0305-02-0038-47
實施例36
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表34，管柱溫度設定為36℃。
Figure 111125735-A0305-02-0038-48
實施例37
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表35，管柱溫度設定為38℃。以本實施例方法針對包含基本18種胺基酸、天門冬醯酸(Asparagine)、γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid)、麩醯胺酸(Glutamine)、鳥氨酸(Ornithine)、牛磺酸(Taurine)和茶胺酸(Theanine)之待測樣品分析後，所得之層析圖譜如圖4所示。請參閱圖4，其中數字1~23所指之波峰分別代表不同胺基酸，1：天門冬胺酸(Aspartate，ASP)；2：麩胺酸(Glutamate，GLU)；3：絲胺酸(Serine，SER)；4：天門冬醯胺(Asparagine，ASN)；5：甘胺酸(Glycine，GLY)；6：麩醯胺酸(Glutamine，GLN)；7：組胺酸(Histidine，HIS)；8：牛磺酸(Taurine)；9：蘇胺酸(Threonine，THR)；10：精胺酸(Arginine，ARG)；11：丙胺酸(Alanine，ALA)；12：γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid，γ-GABA)；13：脯胺酸(Proline，PRO)；14：茶胺酸(Theanine)；15：酪胺酸(Tyrosine，TYR)；16：半胱胺酸(Cysteine，Half-CYS)；17：纈胺酸(Valine，VAL)；18：甲硫胺酸(Methionine，MET)；19：異白胺酸(Isoleucine，ILE)；20：鳥氨酸(Ornithine，ORN)；21：白胺酸(Leucine，LEU)；22：離胺酸(Lysine，LYS)；23：苯丙胺酸(Phenylalanine，PHE)。
如圖4所示，可以發現本發明實施例所提供之方法能夠有效分離上述23種胺基酸。
Figure 111125735-A0305-02-0039-50
Figure 111125735-A0305-02-0040-51
實施例38
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表36。
Figure 111125735-A0305-02-0040-53
實施例39
實施方式類似實施例1，惟該移動相之梯度設定如下表37。以本實施例方法針對包含基本18種胺基酸、天門冬醯酸(Asparagine)、γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid)、麩醯胺酸(Glutamine)、鳥氨酸(Ornithine)、牛磺酸(Taurine)和茶胺酸(Theanine)之待測樣品分析後，所得之層析圖譜如圖5所示。請參閱圖5，其中數字1~23所指之波峰分別代表不同胺基酸，1：天門冬胺酸(Aspartate，ASP)；2：麩胺酸(Glutamate，GLU)；3：絲胺酸(Serine，SER)；4：天門冬醯胺(Asparagine，ASN)；5：甘胺酸(Glycine，GLY)；6：麩醯胺酸(Glutamine，GLN)；7：組胺酸(Histidine，HIS)；8：牛磺酸(Taurine)；9：蘇胺酸(Threonine，THR)；10：精胺酸(Arginine，ARG)；11：丙胺酸(Alanine，ALA)；12：γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid，γ-GABA)；13：脯胺酸(Proline，PRO)；14：茶胺酸(Theanine)；15：酪胺酸(Tyrosine，TYR)；16：半胱胺酸(Cysteine，Half-CYS)；17：纈胺酸(Valine，VAL)；18：甲硫胺酸(Methionine，MET)；19：異白胺酸(Isoleucine，ILE)；20：鳥氨酸(Ornithine，ORN)；21：白胺酸(Leucine，LEU)；22：離胺酸(Lysine，LYS)；23：苯丙胺酸(Phenylalanine，PHE)。
如圖5所示，可以發現本發明實施例所提供之方法能夠有效分離上述23種胺基酸。
Figure 111125735-A0305-02-0041-54
Figure 111125735-A0305-02-0042-55
比較例1
根據現有習知之方法，例如Waters之AccQ˙Tag系列方法，首先製備待測樣品；以及以高效液相分析儀串聯螢光檢測器系統對該待測樣品進行層析分離和檢測，該高效液相分析儀設置有碳18逆相管柱；將該待測樣品注入該碳18逆相管柱；利用梯度沖提法以移動相沖提該碳18逆相管柱；該移動相包括A液、B液和C液，其流速為1.0mL/min，，其中，該A液為稀釋之AccQ．Tag A濃液，該B液為氰甲烷，C液為超純水，該移動相之梯度設定如下表38。
根據現有習知之方法針對包含18種胺基酸之基本樣品的分析圖譜如圖6所示；以現有習知之方法針對包含18種胺基酸之基本樣品以及天門冬醯酸(Asparagine)、γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid)、麩醯胺酸(Glutamine)、鳥氨酸(Ornithine)、牛磺酸(Taurine)和茶胺酸(Theanine)之待測樣品分析，所得之層析圖譜如圖7所示。
如圖6和7所示，可以發現習知技術之分析方法雖可分離包含基本18種胺基酸之樣品，但當額外加入上述6種和茶汁風味相關之胺基酸時，習知技術無法有效將該6種胺基酸與基本18種胺基酸分離。
Figure 111125735-A0305-02-0043-56
相較於習知技術，本發明所提供的游離胺基酸之分析方法可同時分析基本的18種胺基酸以及提供飲品中甘味和鮮味的其他游離胺基酸，因此能夠有效率地檢測飲品中的各種胺基酸，進而快速地分析該飲品之風味。本發明所提供之方法可應用於各種飲品。
S1、S2:步驟

Claims (35)

  1. 一種游離胺基酸之分析方法，包括：製備待測樣品；以及以高效液相分析儀串聯螢光檢測器系統對該待測樣品進行層析分離和檢測；其中該高效液相分析儀設置有碳18逆相管柱；以及該分析方法包括：將該待測樣品注入該碳18逆相管柱；以及以移動相沖提該碳18逆相管柱；其中該移動相包括第一溶液、第二溶液和第三溶液；其中，該第一溶液為10%甲醇，該第二溶液為氰甲烷，以及該第三溶液包括醋酸鈉緩衝溶液；該移動相之流速為0.8~1.0mL/min。
  2. 如請求項1所述之游離胺基酸之分析方法，其中該緩衝溶液為醋酸鈉溶液。
  3. 如請求項2所述之游離胺基酸之分析方法，其中該緩衝溶液之pH值為5.5~7.0。
  4. 如請求項3所述之游離胺基酸之分析方法，其中該緩衝溶液包括第一醋酸鈉溶液和第二醋酸鈉溶液。
  5. 如請求項4所述之游離胺基酸之分析方法，其中該移動相中該第一溶液佔該移動相之比例為0~40%；該第二溶劑佔該移動相之比例為0~60%；以及該第三溶液佔該移動相之比例為0~100%。
  6. 如請求項5所述之游離胺基酸之分析方法，其中該以移動相沖提該碳18逆相管柱之步驟包括利用梯度沖提法以移動相沖提該碳18逆相管柱。
  7. 如請求項6所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，包括：(1)自第0至第0.5分鐘，由0%：0%：100%至0%：1%：99%；(2)自第0.5至第17分鐘，由0%：1%：99%至0%：2%：98%；(3)自第17至第24分鐘，由0%：2%：98%至0%：4~5%：95~96%；以及(4)自第24至第32分鐘，由0%：4~5%：95~96%至0%：7~12%：88~93%。
  8. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13~14%：86~87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13~14%：86~87%至0%：15%：85%；(5)自第48至第48.1分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第48.1至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  9. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第49分鐘，由0%：13%：87%至0%：13~15%：85~87%； (5)自第49至第50.5分鐘，由0%：13~15%：85~87%至40%：60%：0%；(6)自第50.5至第52分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第52至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  10. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第49分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第49至第50.5分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第50.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  11. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第48至第48.1分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第48.1至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  12. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第36分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13~14%：86~87%；(4)自第36至第48分鐘，由0%：13~14%：86~87%至0%：14~15%：85~86%；(5)自第48至第48.1分鐘，由0%：14~15%：85~86%至40%：60%：0%；(6)自第48.1至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  13. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：17%：83%；(5)自第48至第48.1分鐘，由0%：17%：83%至40%：60%：0%；(6)自第48.1至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  14. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.2分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%； (2)自第33.2至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第48至第49.1分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第49.1至第52分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第52至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  15. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：18%：82%；(5)自第48至第49.5分鐘，由0%：18%：82%至40%：60%：0%；(6)自第49.5至第52分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第52至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  16. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至40%：60%：0%；(5)自第48至第49分鐘，由40%：60%：0%至0%：15%：85%； (6)自第49至第50.5分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第50.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  17. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：16%：84%；(5)自第48至第49.5分鐘，由0%：16%：84%至40%：60%：0%；(6)自第49.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  18. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.8分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(3)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：16%：84%；(4)自第48至第49.5分鐘，由0%：16%：84%至40%：60%：0%；(5)自第49.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(6)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  19. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第50分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第50至第52分鐘，由0%：15%：85%至0%：0%：100%；以及(6)自第52至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  20. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第50.5分鐘，由0%：13%：87%至40%：60%：0%；(5)自第50.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(6)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  21. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第36.5分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%； (4)自第36.5至第49分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第49至第50.5分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第50.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  22. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第40分鐘，由0%：13%：87%至0%：13.5%：86.5%；(5)自第40至第49分鐘，由0%：13.5%：86.5%至0%：14.5%：85.5%；(6)自第49至第50.5分鐘，由0%：14.5%：85.5%至40%：60%：0%；(7)自第50.5至第52.5分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(8)自第52.5至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  23. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第48至第48.1分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第48.1至第51分鐘，由0%：14.5%：85.5%至0%：0%：100%；以及 (7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  24. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第47.9分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第47.9至第48分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第48至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  25. 如請求項7所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第32.5分鐘，由0%：7~12%：88~93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第32.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第40分鐘，由0%：13%：87%至0%：13.5%：86.5%；(5)自第40至第45分鐘，由0%：13.5%：86.5%至0%：15%：85%；(6)自第45至第48分鐘，由0%：15%：85%至0%：20%：80%；(7)自第48至第48.1分鐘，由0%：20%：80%至40%：60%：0%；(8)自第48.1至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；(9)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%；以及(10)自第75至第110分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%。
  26. 如請求項10所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，包括：(1)自第0至第0.5分鐘，由0%：0%：100%至0%：1%：99%；(2)自第0.5至第17分鐘，由0%：1%：99%至0%：2%：98%；(3)自第17至第23分鐘，由0%：2%：98%至0%：4%：96%；以及(4)自第23至第32分鐘，由0%：4%：96%至0%：12%：88%。
  27. 如請求項26所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.5分鐘，由0%：12%：88%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.5至第33.8分鐘，由%：12.5%：87.5%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(4)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：15%：85%；(5)自第48至第48.1分鐘，由0%：15%：85%至40%：60%：0%；(6)自第48至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  28. 如請求項6所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，包括：(1)自第0至第0.5分鐘，由0%：0%：100%至0%：1%：99%；(2)自第0.5至第17分鐘，由0%：1%：99%至0%：2%：98%；以及(3)自第17至第32分鐘，由0%：2%：98%至0%：7%：93%。
  29. 如請求項28所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第32至第33.8分鐘，由0%：7%：93%至0%：12.5%：87.5%；(2)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(3)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：16%：84%；(4)自第48至第49.5分鐘，由0%：16%：84%至40%：60%：0%；(6)自第49.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(7)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  30. 如請求項6所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，包括：(1)自第0至第0.5分鐘，由0%：0%：100%至0%：1%：99%；以及(2)自第0.5至第15分鐘，由0%：1%：99%至0%：2%：98%。
  31. 如請求項30所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第15至第24分鐘，由0%：2%：98%至0%：5%：95%；(2)自第24至第32分鐘，由0%：5%：95%至0%：7%：93%；(3)自第32至第33.8分鐘，由0%：7%：93%至0%：12.5%：87.5%；(4)自第33.8至第37分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：13%：87%；(5)自第37至第48分鐘，由0%：13%：87%至0%：16%：84%；(6)自第48至第49.5分鐘，由0%：16%：84%至40%：60%：0%；(7)自第49.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及 (8)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  32. 如請求項30所述之游離胺基酸之分析方法，其中梯度沖提法係該移動相中該第一溶液：該第二溶劑：該第三溶液之比例依沖提時間而增減，還包括：(1)自第15至第32分鐘，由0%：5%：95%至0%：7%：93%；(2)自第32至第33.8分鐘，由0%：7%：93%至0%：12.5%：87.5%；(3)自第33.8至第48分鐘，由0%：12.5%：87.5%至0%：16%：84%；(4)自第48至第49.5分鐘，由0%：16%：84%至40%：60%：0%；(5)自第49.5至第51分鐘，由40%：60%：0%至0%：0%：100%；以及(6)自第51至第75分鐘，由0%：0%：100%至40%：60%：0%。
  33. 如請求項1所述之游離胺基酸之分析方法，其中該分析方法係用以分離並測定待測樣品中之一或多種游離胺基酸。
  34. 如請求項33所述之游離胺基酸之分析方法，其中該游離胺基酸包括至少一種胺基酸選自由天門冬胺酸(Aspartate)、麩胺酸(Glutamate)、絲胺酸(Serine)、甘胺酸(Glycine)、組織胺酸(Histidine)、蘇胺酸(Threonine)、精胺酸(Arginine)、丙胺酸(Alanine)、脯胺酸(Proline)、酪胺酸(Tyrosine)、半胱胺酸(half-Cysteine,half-Cys)、纈胺酸(Valine)、甲硫胺酸(Methionine)、異白胺酸(Isoleucine)、白胺酸(Leucine)、賴胺酸(Lysine)、苯丙胺酸(Phenylalanine)和脯胺酸(Proline)所組成的群組中。
  35. 如請求項34所述之游離胺基酸之分析方法，其中該游離胺基酸還包括至少一種胺基酸選自由天門冬醯酸(Asparagine)、γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid)、麩醯胺酸(Glutamine)、鳥氨酸(Ornithine)、牛磺酸(Taurine)和茶胺酸(Theanine)所組成的群組中。
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