CN113176357A - 一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，涉及石斛氨基酸测定技术领域，是基于现有的石斛中游离氨基酸含量的测定方法，常见氨基酸种类测定不全、含量测定误差较大、需要标准品多、试验成本高、工作量大等问题提出的。本发明采用柱前衍生化技术，向氨基酸分子中引入较强紫外吸收的异硫氰酸苯酯(FITC)，从紫外吸收角度，提高各氨基酸的相似性，在此基础上，构建基于FITC‑柱前衍生化HPLC‑DAD分析技术的、采用一测多评法可同时测定石斛中20种游离氨基酸含量的方法；本发明方法可显著提高一测多评的准确度，且操作简单，只需要对一种氨基酸进行柱前衍生化处理、节约成本。
Description
技术领域
本发明涉及石斛氨基酸测定技术领域，更具体地说，关于一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法。
背景技术
石斛为兰科石斛属多基源中药。自《神农本草经》首载石斛入药以来，《本草经集注》、《本草图经》、《本草衍义》等历代本草记载均以“石斛”为名。《本草纲目》集前人论述，首次记载金钗石斛，《本草纲目拾遗》首次记载了霍山石斛。近代中草药书籍，包括《中国药典》、《全国中草药汇编》、《中药志》、《中华本草》等，以及各类教科书、期刊，有关石斛记载也均以“石斛”为正名。迄今为止已发现石斛属植物1100种，其中我国有76种，包括霍山石斛、铁皮石斛、马鞭石斛、金钗石斛、流苏石斛等。2020版中国药典，规定中药石斛为“金钗石斛、霍山石斛、鼓槌石斛或流苏石斛及其近似种的新鲜或干燥茎”，这些石斛属植物作为中药石斛入药，具“益胃生津、滋阴清热”，主治“热病津伤，胃阴不足，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热等”，用量为“干品12-15克或鲜品15-30克”。在药材市场上，石斛多以鲜品加工炮制成干品形式销售及临床应用。传统的石斛炮制方法包括：修制、炒制、清洗、绕条、加箍、烘焙、整形等工序。
游离氨基酸指游离状态存在的氨基酸，在植物种广泛存在，是重要的生物活性分子之一，是构建细胞和组织的基础物质。在加热的情况下，游离氨基酸和糖类会发生美拉德反应，产生大量中间产物和终产物，这些产物具有多种生活性，是中药药效物质和食品风味的重要来源，少数美拉德反应产物对人体有害。作为美拉德反应的重要底物，游离氨基酸的种类与含量直接影响美拉德反应产物的种类，进而影响中药药效和食品的风味。
石斛鲜条干制过程中，炒制、烘焙等加热工序，会有大量美拉德反应发生，石斛鲜条中游离氨基酸的种类与含量直接影响石斛炒制、烘焙过程中的美拉德反应产物，影响石斛的药效、品质和口感。构建一个可同时测定多种游离氨基酸的高效、经济的方法，对于石斛及其加工炮制过程中的质量控制具有重要意义。
目前对于氨基酸含量测定的方法主要有：(1)氨基酸自动分析仪测定，如文献《安徽霍山三种石斛中游离氨基酸分析》([J].安徽农业大学，1995(3):268-269.)，采用氨基酸自动分析仪测定安徽霍山三种石斛中游离氨基酸的含量。但是，氨基酸自动分析仪测定游离氨基酸局限性在于：测定时间相对较长；采用水合茚三酮柱后衍生化，造成柱后扩散比较大，峰形变宽，分辨率降低；难以检测天冬酰胺胺、谷氨酰胺、色氨酸。(2)HPLC法直接测定，通过标准品建立不同氨基酸标准曲线方程，通过测定样品中不同氨基酸的峰面积，计算样品中氨基酸含量。但是，HPLC法直接测定游离氨基酸含量局限性在于：很难选择一个合适的波长使得20种氨基酸都有较高摩尔消光系数，导致同时测定多种氨基酸时，部分氨基酸定量限、灵敏度较差；需要多种氨基酸标准品。文献《柱前衍生-HPLC法测定不同产地流苏16种游离氨基酸含量及其聚类分析》([J].现代中药研究与实践，2020(3):4-8.)，采用柱前衍生化-HPLC建立流苏石斛中16种游离氨基酸的含量测定方法，通过R语言聚类热图、SPSS聚类分析对不同产地流苏石斛进行聚类分析。但是技术存在的问题如下：只能测定16种游离氨基酸的含量，并需要对16种氨基酸分别进行柱前衍生化处理，原料和试验成本大，工作量大，操作复杂。
中药与食品质量控制中，需要对多种成分的含量进行定性定量分析，当标准品缺乏时，常规方法难以完成对无标准品组分的定量分析，一测多评法可解决在无标准品时如何对多个组分定量分析问题，然而，其定量分析的准确度，受参与一测多评的多个化合物间结构相似性影响。当化合物结构差异较大时，一测多评用于定量分析，准确度低，成为一测多评法应用的难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于解决现有的石斛中游离氨基酸含量的测定方法，常见氨基酸种类测定不全、含量测定误差较大、需要标准品多、试验成本高、工作量大等问题。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，包括以下步骤：
(1)将新采集的石斛鲜条洗净后进行脱水处理至恒重，粉碎、过40目筛，获石斛干粉；称取石斛干粉置于烧瓶中，向烧瓶中加入提取剂，在60℃下进行超声提取，然后重复离心提取三次，将三次离心的上清液合并，再置于60℃下减压浓缩至干，向减压浓缩得到的残渣加入0.1mol/L的HCl溶解后转移至10mL具塞试管中，再使用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，混匀，得到供试品储备液；
(2)柱前衍生化方法制备供试品溶液
移取2.0mL步骤(1)制得的供试品储备液于10.0mL具塞试管中，向具塞试管中加入14％三乙胺-乙睛溶液和1.2％异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯(FITC)-乙睛溶液各1.0mL，混匀，室温避光静置30min，加入4.0mL正己烷，涡旋混合器振荡60s，静置10min，吸取下层溶液，即可得供试品溶液；
(3)构建HPLC色谱条件
流动相A为0.1mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为乙腈-水；
梯度洗脱条件为：0-3min、0％B；3-15min、0-12％B；15-20min、12-15％B；20-35min、15-25％B；35-40min、25-35％B；40-50min、35-65％B；
柱温为35℃；
流速为1.0mL/min；
检测波长为254nm；
(4)吸取步骤(2)中制得的供试品溶液，采用高效液相色谱仪器并按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，以20种常见氨基酸中任意一种氨基酸为内标物，通过计算内标物氨基酸与其它氨基酸在HPLC图上的相对距离ΔtRis，确定供试品溶液HPLC图谱中氨基酸的色谱峰，计算各氨基酸峰面积，通过内标物氨基酸与其它氨基酸的ΔtRis值，鉴定HPLC图谱上的色谱峰所对应的氨基酸，并确定供试品溶液中内标物氨基酸具体为哪一种氨基酸，再根据内标物氨基酸与其他待测氨基酸的峰面积之比，计算出内标物氨基酸对待测氨基酸的换算因子fs/i；
ΔtRis计算方法如下：
ΔtRis＝tRi-tRs
式中，tRi为测定的待测氨基酸在HPLC图谱上保留时间，tRs为测定的内标物氨基酸在HPLC图谱上保留时间；
(5)取步骤(4)中鉴定出的内标物氨基酸为对照氨基酸，将对照氨基酸用0.1mol/L盐酸溶于10.0mL容量瓶中，均匀混合，定容，得对照品储备液，然后按照步骤(2)的操作将对照品储备液进行柱前衍生化处理，得到对照品溶液；
(6)游离氨基酸含量测定
将得到的对照品溶液等比稀释成10个梯度，然后按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，获得内标物氨基酸标准曲线；将步骤(4)中计算出的供试品溶液中该内标物氨基酸峰面积代入曲线方程，计算出供试品溶液中该内标物氨基酸的浓度，然后按以下公式计算出供试品溶液中其它氨基酸的浓度：
Ci＝(Cs/As)×fs/i×Ai
式中，As为供试品溶液中内标物氨基酸的峰面积，Cs为供试品溶液中内标物氨基酸的浓度，Ai为供试品溶液中其他待测氨基酸的峰面积，fs/i为内标物氨基酸对待测氨基酸的换算因子。
本发明采用柱前衍生化技术，向氨基酸分子中引入较强紫外吸收的异硫氰酸苯酯(FITC)，从紫外吸收角度，提高各氨基酸的相似性，在此基础上，构建基于FITC-柱前衍生化HPLC-DAD分析技术的、采用一测多评法可同时测定石斛中20种游离氨基酸含量的方法；现有柱前衍生化技术难以同时测定20种常见氨基酸含量，且需要20种氨基酸标准品、对20种氨基酸进行柱前衍生化处理，原料和试验成本大，工作量大，操作复杂；本发明方法可显著提高一测多评的准确度，且操作简单，只需要对一种氨基酸进行柱前衍生化处理、节约成本。
本发明方法可以用于石斛类药材中游离氨基酸的含量、石斛类药材炮制加工过程中质量控制，为其它中药、食品加工过程中质量控制提供参考方法。
优选地，所述步骤(1)中石斛鲜条为石斛新鲜的茎，所述石斛包括霍山石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛及其近似种。
优选地，所述步骤(1)中石斛鲜条的脱水处理为-50℃冷冻干燥。
优选地，所述步骤(1)中提取剂为60％甲醇溶液，石斛干粉与提取剂的料液比为1:40/g:mL。
优选地，所述步骤(1)中超声提取的时间为30min，超声的功率为240W。
优选地，所述步骤(1)中单次离心提取的时间为10min，离心的转速为5000r/min。
优选地，所述步骤(3)中醋酸钠缓冲液的pH为6，加入3％乙腈混匀。
优选地，所述步骤(3)中流动相B中乙腈和水的体积比为4:1。
优选地，所述步骤(4)中高效液相色谱仪器为Agilent1260液相色谱仪，色谱柱为Waters XBridge C18反相柱。
优选地，所述步骤(4)中20种常见氨基酸为Asp、Glu、Asn、Ser、Gln、Gly、His、Ala、Arg、Thr、Pro、Tyr、Val、Met、Cys、Ile、Leu、Phe、Trp和Lys。
本发明具有如下的有益效果：
1、本发明采用柱前衍生化技术，向氨基酸分子中引入较强紫外吸收的异硫氰酸苯酯(FITC)，从紫外吸收角度，提高各氨基酸的相似性，在此基础上，构建基于FITC-柱前衍生化HPLC-DAD分析技术的、采用一测多评法可同时测定石斛中20种游离氨基酸含量的方法；现有柱前衍生化技术难以同时测定20种常见氨基酸含量，且需要20种氨基酸标准品、对20种氨基酸进行柱前衍生化处理，原料和试验成本大，工作量大，操作复杂；本发明方法可显著提高一测多评的准确度，且操作简单，只需测定一种游离氨基酸的含量，便可以通过换算因子计算出其它19种氨基酸的含量，节约了原料成本。
2、本发明采用柱前衍生化，相对于氨基酸自动分析仪的柱后衍生化，分辨率较高。
3、本发明采用柱前衍生化向20种氨基酸同时引入254nm处有强吸收基团的异硫氰酸苯酯，在254nm下同时测定20种常见氨基酸，解决了20种氨基酸最大吸收波长不同导致HPLC直接测定时波长难以选择问题。
4、本发明采用柱前衍生化向20种氨基酸同时引入254nm处有强吸收基团的异硫氰酸苯酯，解决了不经柱前衍生化处理直接一测多评分析面临的检测准确性受化合物结构影响的问题。
附图说明
图1为本发明实施例1的内标物氨基酸与其它氨基酸的ΔtRis值结果图；
图2为本发明实施例1的内标物氨基酸与待测氨基酸的换算因子fs/i值结果图；
图3为本发明实施例1的20种常见氨基酸标准品混合物FITC柱前衍生化HPLC检测图谱；
图4为本发明实施例2-5的霍山石斛、金钗石斛、鼓吹石斛、流苏石斛鲜条总游离氨基酸HPLC图谱；
图5为本发明实施例2的基于一测多评法测定与标准曲线法测定的霍山石斛游离氨基酸含量对比结果图；
图6为本发明实施例3的基于一测多评法测定与标准曲线法测定的金钗石斛游离氨基酸含量对比结果图；
图7为本发明实施例4的基于一测多评法测定与标准曲线法测定的鼓槌石斛游离氨基酸含量对比结果图；
图8为本发明实施例5的基于一测多评法测定与标准曲线法测定的流苏石斛游离氨基酸含量对比结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例和说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，包括以下步骤：
(1)将新采集的石斛鲜条洗净，-50℃冷冻干燥至恒重，粉碎、过40目筛，获霍山石斛冻干粉；称取石斛冻干粉0.5g置于烧瓶中，向烧瓶中加入20mL 60％甲醇溶液，在60℃下超声(超声功率240W)提取30min，5000r/min离心10min，沉淀同样操作提取2次，合并上清液，60℃下减压浓缩至干，残渣加0.1mol/L的HCl溶液溶解后转移至10mL具塞试管中，加0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，混匀，得到供试品储备液；
(2)柱前衍生化方法制备供试品溶液
移取2.0mL步骤(1)制得的供试品储备液于10.0mL具塞试管中，向具塞试管中加入14％三乙胺-乙睛溶液和1.2％异硫氰酸苯酯(FITC)-乙睛溶液各1.0mL，混匀，室温避光静置30min，加入4.0mL正己烷，涡旋混合器振荡60s，静置10min，吸取下层溶液，即可得供试品溶液；
(3)构建HPLC色谱条件
流动相A为0.1mol/L醋酸钠缓冲液(pH为6，加入3％乙腈混匀)、流动相B为乙腈-水(乙腈和水的体积比为4:1)；
梯度洗脱条件为：0-3min、0％B；3-15min、0-12％B；15-20min、12-15％B；20-35min、15-25％B；35-40min、25-35％B；40-50min、35-65％B；
柱温为35℃；
流速为1.0mL/min；
检测波长为254nm；
(4)吸取步骤(2)中制得的供试品溶液，采用Agilent1260液相色谱仪并按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，以Asp、Glu、Asn、Ser、Gln、Gly、His、Ala、Arg、Thr、Pro、Tyr、Val、Met、Cys、Ile、Leu、Phe、Trp和Lys这20种常见氨基酸中任意一种氨基酸为内标物，通过计算内标物氨基酸与其它氨基酸在HPLC图上的相对距离ΔtRis，确定供试品溶液HPLC图谱中氨基酸的色谱峰，计算各氨基酸峰面积，通过内标物氨基酸与其它氨基酸的ΔtRis值(结果如图1所示)，鉴定HPLC图谱上的色谱峰所对应的氨基酸，并确定供试品溶液中内标物氨基酸具体为哪一种氨基酸，再根据内标物氨基酸与其他待测氨基酸的峰面积之比，计算出内标物氨基酸对待测氨基酸的换算因子fs/i(结果如图2所示)；
ΔtRis计算方法如下：
ΔtRis＝tRi-tRs
式中，tRi为测定的待测氨基酸在HPLC图谱上保留时间，tRs为测定的内标物氨基酸在HPLC图谱上保留时间；
(5)取步骤(4)中鉴定出的内标物氨基酸为对照氨基酸，将对照氨基酸用0.1mol/L盐酸溶于10.0mL容量瓶中，均匀混合，定容，得对照品储备液，然后按照步骤(2)的操作将对照品储备液进行柱前衍生化处理，得到对照品溶液；
(6)游离氨基酸含量测定
将得到的对照品溶液等比稀释成10个梯度，然后按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，获得内标物氨基酸标准曲线；将步骤(4)中计算出的供试品溶液中该内标物氨基酸峰面积代入曲线方程，计算出供试品溶液中该内标物氨基酸的浓度，然后按以下公式计算出供试品溶液中其它氨基酸的浓度：
Ci＝(Cs/As)×fs/i×Ai
式中，As为供试品溶液中内标物氨基酸的峰面积，Cs为供试品溶液中内标物氨基酸的浓度，Ai为供试品溶液中其他待测氨基酸的峰面积，fs/i为内标物氨基酸对待测氨基酸的换算因子。
对照品溶液制备：准确称取L-Asp0.708mg、L-Glu0.529mg、L-Asn0.323mg、D-Ser0.253mg、L-Gln0.519mg、Gly0.179mg、L-His0.364mg、β-Ala0.221mg、L-Arg0.490mg、L-Thr0.421mg、D-Pro0.300mg、DL-Tyr0.396mg、D-Val0.290mg、L-Met0.343mg、L-Cys0.533mg、L-Ile0.253mg、D-Leu0.261mg、DL-Phe0.323mg、DL-Trp0.278mg、L-Lys0.161mg，用0.1mol/L盐酸溶解于10ml容量瓶中，混合均匀，定容，得对照品储备液；准确移取2mL对照品储备液于10.0mL具塞试管中，分别加入14％三乙胺-乙睛溶液和1.2％异硫氰酸苯酯(FITC)-乙睛溶液各1.0mL混匀，室温避光静置30min后，加入4.0mL正己烷，涡旋混合器振荡60s，静置10min，吸取下层溶液制得氨基酸标准品衍生化溶液。
1、线性关系考察
标准曲线的测定：取上述制得的氨基酸标准品衍生化溶液1.0mL，向其中加入0.5mL浓度为0.1mol/L的HCl溶液，摇匀后量取1.0mL，再加入0.5mL浓度为0.1mol/L的HCl溶液，摇匀，同样操作，最终获得10个浓度呈等比下降的20种浓度不同的氨基酸标准品溶液；将氨基酸标准品溶液按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，结果如图3所示，图3中1-20的标号代表的氨基酸分别为：1-Asp、2-Glu、3-Asn、4-Ser、5-Gln、6-Gly、7-His、8-Ala、9-Arg、10-Thr、11-Pro、12-Tyr、13-Val、14-Met、15-Cys、16-Ile、17-Leu、18-Phe、19-Trp、20-Lys；以各氨基酸进样质量为自变量，对应的峰面积为因变量，获得20种常见氨基酸的标准曲线及其线性范围、检测限与定量限，结果如表1所示，结果表明，20种氨基酸成分进样量与峰面积之间线性关系良好，线性相关系数R2均高于0.9950。
表1为20种常见氨基酸标准曲线、线性范围、检测限与定量限(ng)
2、精密度试验
取上述制得的氨基酸标准品衍生化溶液，按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件，分别于6、12、18、24、36、48、60、72h各进样1次，记录各组分色谱峰峰面积，计算得到20种游离氨基酸衍生物日间、日内峰测定的峰面积的RSD均小于3.0％，结果如表2所示，说明构建的方法精密度良好。
3、稳定性实验
取上述制得的氨基酸标准品衍生化溶液6份，按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件测定峰面积，计算20种氨基酸含量，其RSD均小于2.0％，结果如表2所示，说明方法重复性良好。
4、重现性实验
取上述制得的氨基酸标准品衍生化溶液，分别采用Waters 1525、Agilent1260HPLC system、Laballiance PC-4000三种高效液相色谱仪，按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件测定峰面积，计算20种氨基酸含量，其RSD均小于2.0％，结果如表2所示，说明方法用于定量，重现性良好；按步骤(4)的方法，计算20种氨基酸在三种高效液相色谱仪测定的HPLC图谱上的相对距离ΔtRis，其RSD均小于2.0％，说明方法用于定性，重现性良好。
表2为方法学考察结果(n＝6)
实施例2
采用一测多评法测定霍山石斛中游离氨基酸含量
材料准备：供试品霍山石斛(Dendrobium huoshanese)采自皖西学院植物园，将新采集的霍山石斛鲜条洗净，-50℃冷冻干燥至恒重，粉碎、过40目筛，获得霍山石斛冻干粉；
按照实施例1的方法，将获得的霍山石斛冻干粉制备成霍山石斛供试品储备液，然后将霍山石斛供试品储备液进行柱前衍生化方法，根据构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，测定霍山石斛游离氨基酸含量，测定的霍山石斛游离氨基酸HPLC图谱如图4(a)所示，然后将测定的霍山石斛游离氨基酸含量与标准曲线法测定的霍山石斛游离氨基酸含量结果进行对比，结果如图5所示，可以发现，二者结果基本一致，说明本发明构建的一测多评法测定霍山石斛中游离氨基酸含量，结果准确。
回收率实验：准确称取霍山石斛茎样品6份，每份0.5g，分别置50mL烧瓶中，分为A、B两组；B组按样品含量-对照品(1:1)的比例加入一定量的对照品溶液，依法提取测定，计算各成分的回收率，结果游离氨基酸的加样回收率均在96.49-103.33％之间。
实施例3
采用一测多评法测定金钗石斛中游离氨基酸含量
材料准备：供试品金钗石斛(Dendrobium nobile)采自皖西学院植物园，将新采集的金钗石斛鲜条洗净，-50℃冷冻干燥至恒重，粉碎、过40目筛，获金钗石斛冻干粉；
按照实施例1的方法，将获得的金钗石斛冻干粉制备成金钗石斛供试品储备液，然后将金钗石斛供试品储备液进行柱前衍生化方法，根据构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，测定金钗石斛游离氨基酸含量，测定的金钗石斛游离氨基酸HPLC图谱如图4(b)所示，然后将测定的金钗石斛游离氨基酸含量与标准曲线法测定的金钗石斛游离氨基酸含量结果进行对比，结果如图6所示，可以发现，二者结果基本一致，说明本发明构建的一测多评法测定金钗石斛中游离氨基酸含量，结果准确。
回收率实验：精密称取金钗石斛茎样品6份，每份0.5g，分别置50mL烧瓶中，分为A、B两组；B组按样品含量-对照品(1:1)的比例加入一定量的对照品溶液，依法提取测定，计算各成分的回收率。结果游离氨基酸的加样回收率均在95.3-105.4％之间。
实施例4
采用一测多评法测定鼓槌石斛中游离氨基酸含量
材料准备：供试品鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum)采自皖西学院植物园，将新采集的鼓槌石斛鲜条洗净，-50℃冷冻干燥至恒重，粉碎、过40目筛，获鼓槌石斛冻干粉；
按照实施例1的方法，将获得的鼓槌石斛冻干粉制备成鼓槌石斛供试品储备液，然后将鼓槌石斛供试品储备液进行柱前衍生化方法，根据构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，测定鼓槌石斛游离氨基酸含量，测定的鼓槌石斛游离氨基酸HPLC图谱如图4(c)所示，然后将测定的鼓槌石斛游离氨基酸含量与标准曲线法测定的鼓槌石斛游离氨基酸含量结果进行对比，结果如图7所示，可以发现，二者结果基本一致，说明本发明构建的一测多评法测定鼓槌石斛中游离氨基酸含量，结果准确。
回收率实验：精密称取鼓槌石斛茎样品6份，每份0.5g，分别置50mL烧瓶中，分为A、B两组；B组按样品含量-对照品(1:1)的比例加入一定量的对照品溶液，依法提取测定，计算各成分的回收率。结果游离氨基酸的加样回收率均在94.92-107.15％之间。
实施例5
采用一测多评法测定流苏石斛中游离氨基酸含量
材料准备：供试品流苏石斛(Dendrobium fimbriatum)采自皖西学院植物园，将新采集的流苏石斛鲜条洗净，-50℃冷冻干燥至恒重，粉碎、过40目筛，获流苏石斛冻干粉；
按照实施例1的方法，将获得的流苏石斛冻干粉制备成流苏石斛供试品储备液，然后将流苏石斛供试品储备液进行柱前衍生化方法，根据构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，测定流苏石斛游离氨基酸含量，测定的流苏石斛游离氨基酸HPLC图谱如图4(d)所示，然后将测定的流苏石斛游离氨基酸含量与标准曲线法测定的流苏石斛游离氨基酸含量结果进行对比，结果如图8所示，可以发现，二者结果基本一致，说明本发明构建的一测多评法测定流苏石斛中游离氨基酸含量，结果准确。
本实施例的回收率实验：精密称取流苏石斛茎样品6份，每份0.5g，分别置50mL烧瓶中，分为A、B两组；B组按样品含量-对照品(1:1)的比例加入一定量的对照品溶液，依法提取测定，计算各成分的回收率。结果游离氨基酸的加样回收率均在96.49-103.33％之间。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将新采集的石斛鲜条洗净后进行脱水处理至恒重，粉碎、过40目筛，获石斛干粉；称取石斛干粉置于烧瓶中，向烧瓶中加入提取剂，在60℃下进行超声提取，然后重复离心提取三次，将三次离心的上清液合并，再置于60℃下减压浓缩至干，向减压浓缩得到的残渣加入0.1mol/L的HCl溶解后转移至10mL具塞试管中，再使用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，混匀，得到供试品储备液；
(2)柱前衍生化方法制备供试品溶液
移取2.0mL步骤(1)制得的供试品储备液于10.0mL具塞试管中，向具塞试管中加入14％三乙胺-乙睛溶液和1.2％异硫氰酸苯酯-乙睛溶液各1.0mL，混匀，室温避光静置30min，加入4.0mL正己烷，涡旋混合器振荡60s，静置10min，吸取下层溶液，即可得供试品溶液；
(3)构建HPLC色谱条件
流动相A为0.1mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为乙腈-水；
梯度洗脱条件为：0-3min、0％B；3-15min、0-12％B；15-20min、12-15％B；20-35min、15-25％B；35-40min、25-35％B；40-50min、35-65％B；
柱温为35℃；
流速为1.0mL/min；
检测波长为254nm；
(4)吸取步骤(2)中制得的供试品溶液，采用高效液相色谱仪器并按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，以20种常见氨基酸中任意一种氨基酸为内标物，通过计算内标物氨基酸与其它氨基酸在HPLC图上的相对距离ΔtRis，确定供试品溶液HPLC图谱中氨基酸的色谱峰，计算各氨基酸峰面积，通过内标物氨基酸与其它氨基酸的ΔtRis值，鉴定HPLC图谱上的色谱峰所对应的氨基酸，并确定供试品溶液中内标物氨基酸具体为哪一种氨基酸，再根据内标物氨基酸与其他待测氨基酸的峰面积之比，计算出内标物氨基酸对待测氨基酸的换算因子fs/i；
ΔtRis计算方法如下：
ΔtRis＝tRi-tRs
式中，tRi为测定的待测氨基酸在HPLC图谱上保留时间，tRs为测定的内标物氨基酸在HPLC图谱上保留时间；
(5)取步骤(4)中鉴定出的内标物氨基酸为对照氨基酸，将对照氨基酸用0.1mol/L盐酸溶于10.0mL容量瓶中，均匀混合，定容，得对照品储备液，然后按照步骤(2)的操作将对照品储备液进行柱前衍生化处理，得到对照品溶液；
(6)游离氨基酸含量测定
将得到的对照品溶液等比稀释成10个梯度，然后按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，获得内标物氨基酸标准曲线；将步骤(4)中计算出的供试品溶液中该内标物氨基酸峰面积代入曲线方程，计算出供试品溶液中该内标物氨基酸的浓度，然后按以下公式计算出供试品溶液中其它氨基酸的浓度：
Ci＝(Cs/As)×fs/i×Ai
式中，As为供试品溶液中内标物氨基酸的峰面积，Cs为供试品溶液中内标物氨基酸的浓度，Ai为供试品溶液中其他待测氨基酸的峰面积，fs/i为内标物氨基酸对待测氨基酸的换算因子。
2.根据权利要求1所述的一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中石斛鲜条为石斛新鲜的茎，所述石斛包括霍山石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛及其近似种。
3.根据权利要求1所述的一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中石斛鲜条的脱水处理为-50℃冷冻干燥。
4.根据权利要求1所述的一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中提取剂为60％甲醇溶液，石斛干粉与提取剂的料液比为1:40/g:mL。
5.根据权利要求1所述的一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中超声提取的时间为30min，超声的功率为240W。
6.根据权利要求5所述的一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中单次离心提取的时间为10min，离心的转速为5000r/min。
7.根据权利要求1所述的一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中醋酸钠缓冲液的pH为6，加入3％乙腈混匀。
8.根据权利要求1所述的一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流动相B中乙腈和水的体积比为4:1。
9.根据权利要求1所述的一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于：所述步骤(4)中高效液相色谱仪器为Agilent1260液相色谱仪，色谱柱为WatersXBridge C18反相柱。
10.根据权利要求1所述的一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于：所述步骤(4)中20种常见氨基酸为Asp、Glu、Asn、Ser、Gln、Gly、His、Ala、Arg、Thr、Pro、Tyr、Val、Met、Cys、Ile、Leu、Phe、Trp和Lys。
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